一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法，以包含UCP3基因的待测肉牛全基因组DNA为模版，以引物对P为引物，PCR扩增肉牛UCP3基因；用限制性内切酶BglⅠ消化PCR产物后，再进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定肉牛UCP3基因第4912位的基因型；由于UCP3基因功能涉及背膘厚性状，基因型数据与这些性状关联分析后发现：位于UCP3基因第四外显子的G4912A突变不同基因型与背膘厚呈显著相关，其中GG型个体背膘厚显著大于GA型个体（P<0.05）。以上说明GG基因型可以作为一个提高肉牛背膘厚的候选分子遗传标记。本发明提供的检测方法可以用于肉牛生长肉质性状的标记辅助选择（MAS），加快良种群的选育。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性（SNP）的检测，特别涉及一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法及其应用。

背景技术

随着经济的发展，人们对于牛肉的数量和品质要求日益提高。虽然我国已成为第三大养牛与牛肉生产国，但是高档大部分依赖于进口。因此提高肉用性能势在必行，途径主要有改善饲料营养，加强饲养管理水平和培育优良品种等，而良种是肉牛业发展的先决条件和物质基础。人们在了解肉用性状的遗传规律和相应的生长发育、脂肪沉积等生命活动调控规律的基础上，结合分子生物学方面的研究，发现了与肉用性状有密切联系的功能基因和主效基因以及和这些基因连锁的分子遗传标记，根据目标性状与候选基因基因型间的关联性进行选择，提高了育种方向的准确性，缩短了育种年限。

    单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

分子生物学的发展为分子标记辅助选择提供了理论基础和技术支持，通过检测功能基因某位点的多态性，对不同基因型个体与其生产性能进行关联分析，找出优势基因型和优势等位基因，为选种提供依据，这一过程中检测多态性和基因分型的准确是很关键的。目前主要的方法有PCR-RFLP技术或PCR-SSCP技术结合DNA测序。

PCR-RELP方法是检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RELP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

 UCP3基因编码解偶联蛋白3（uncoupling protein 3，UCP3），该蛋白是解偶联蛋白超家族成员之一，最早是1997年Boss在人类骨骼肌中发现的。解偶联蛋白镶嵌在线粒体内膜上，是哺乳动物线粒体的质子载体，在氧化磷酸化解偶联、抗氧化和能量代谢调控中发挥重要作用。在猪的分子育种中已经发现，猪UCP3基因对日增重、脂肪沉积、饲料转化率和小猪初生重有重要影响。牛UCP3基因定位于牛15号常染色体。Sherman等（2008）发现牛UCP3基因内含子3一个A/G多态与欧洲牛与大不列颠杂交牛的平均日增重和局部生长效率显著相关。Li等（2010）发现南阳牛、鲁西牛、延边牛中UCP3基因BglI 酶切多态等位基因A比等位基因B频率更高。关联分析显示鲁西牛中AA型比AB型β-球蛋白含量更优。结果还显示UCP3基因BglI 酶切多态与南阳牛的生长性状显著相关，AB基因型个体优于其他个体，表明这一多态位点与牛的生长性状相关。Brennan等（2009）发现UCP3基因的mRNA水平表达量的提高与脂肪酸β-氧化和牛体重损失产生的脂肪酸副产物有关。本发明提供的检测方法为UCP3基因SNP与肉质性状关系的建立奠定了基础，以便用于肉牛肉质性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RELP方法检测肉牛UCP3基因的多态性，并将其与肉质性状进行关联分析，验证是否可以作为肉牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

     本发明是通过以下技术方案来实现：

      一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含UCP3基因的待测肉牛全基因组DNA模版，以引物对P为引物，PCR扩增肉牛UCP3基因；用限制性内切酶BglⅠ消化PCR产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定肉牛UCP3基因第4912位的单核苷酸多态性。

用于检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的引物，其特征在于：所述引物为引物对p，序列为：上游引物：5'-TCACTATCCACGACCCTACC-3'；

下游引物：5'- GGTGTAGAACTGCTTGACGG-3'。

所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火40s；72℃延伸30s；72℃延伸7min；4℃保存。

    所述的琼脂糖凝胶电泳为2%琼脂糖凝胶电泳。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定肉牛UCP3基因第4912位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为396/166bp条带；GA基因型表现为560bp/396bp/166bp条带；AA基因型表现为560bp条带。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据UCP3基因的序列设计引物，分别以8个肉牛品种的基因组DNA为模版，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到肉牛UCP3基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较后，发现在第4912位存在SNP多态性。

针对上述第4912位的SNP多态性，本发明还公布了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对8种肉牛品种的SNP基因型进行了检测和基因型频率分析，对上述SNP位点与肉牛部分生长性状(宰前活重、酮体重、屠宰率、净肉重、大理石花纹评分、眼肌面积、实测背膘厚、嫩度、大腿肉厚、腰部肉厚、酮体长)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高肉牛背膘厚的分子标记。

附图说明

图1是引物P扩增不同牛个体（牛UCP3基因第4912位多态位点）PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为600bp Marker，1-5为PCR产物。

图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的牛UCP3基因序列第4912为G或A突变测序结果图。

图3是本发明牛UCP3基因引物P扩增片段PCR产物的RFLP分析图。其中1、3、5、10、11、12泳道为GA型，2、4、6、7泳道为GG型，8、9泳道为AA型，M为600bp Marker。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对肉牛UCP3基因第4912位突变的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

A、肉牛UCP3基因第二内含子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛（NC_007313.5）序列为参考，利用Primer premier 5.0软件设计能够扩增包含肉牛UCP3基因第二内含子区域的PCR产物，其引物序列如下：

上游引物：5'-TCACTATCCACGACCCTACC-3'

下游引物：5'- GGTGTAGAACTGCTTGACGG-3'

B、以引物P进行PCR扩增待测肉牛的UCP3基因片段

实施例1

1、牛样品的采集和处理

本发明采用8个牛群体共计318个个体，具体为：（1）安格斯（Angus）牛血液样品18份，晋南牛（Jinnan）血液样品23份，利木赞（Limousin）牛血液样品22份，鲁西黄牛（Luxi）血液样品29份，秦川牛（Qinchuan）血液样品27份，西门塔尔（Simmental）牛血液样品30份，夏洛莱（Charolais）牛血液样品29份，采自河北大厂县华安肉牛育肥场；（2）安格斯（Angus）牛血液样品30份，海福特（Hereford）牛血液样品30份，西门塔尔（Simmental）牛血液样品28份，采自内蒙古通辽三元肉牛育肥场；（3）西门塔尔（Simmental）牛血液样品，采自内蒙古通辽宝龙山肉牛育肥场。从每头牛的颈静脉采血8 mL于10 mL管中，加ACD抗凝剂（血液与ACD体积比为6：1）摇匀，将血样用加冰块的泡沫箱带回实验室，于-80℃超低温冰箱保存备用。

2、基因组DNA的提取

（1）冰冻血样室温下融化、摇匀，用移液枪吸取1.5mL全血加入5mL离心管中，加入1.5mL（或与血样等体积）PBS缓冲液，颠倒混匀10min，12000r/min离心10min，结束后可看到离心管底部白细胞沉淀。

（2）弃上清液，重复（1）的步骤1～2次，至下层白细胞内无红细胞。

（3）弃上清液，加入1mL裂解液SET，40μL 10% SDS，20μL蛋白酶K溶液，振荡器振荡2～3min，使之充分混匀，至于恒温水浴振荡器中55℃水浴，消化过夜至不见粘稠团块。

（4）向管中加入与管内液体等体积的Tris饱和酚（约1.5mL），盖紧管盖，缓慢连续颠倒混合不少于10min，12000r/min离心10min。

（5）小心吸取上清液至新的5 mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混和液，缓慢颠倒离心管不少于10min，使溶液两相充分混匀，12000r/min离心10min。

（6）转移上清液至另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，12000r/min离心10min。

（7）转移上清液至新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，盖紧管盖，顺一个方向水平摇晃数次即可看到白色絮状DNA沉淀，离心4min，使DNA贴附在离心管管壁下部。

（8）用预冷的75%乙醇洗涤两次，小心倒出乙醇，室温放置。

（9）乙醇挥发后，加入100μL ddH₂O溶解，4℃放置，24h后，将DNA溶液转移至灭菌的1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

3、DNA浓度和纯度检测

（1）琼脂糖凝胶电泳检测

取5μL DNA溶液，与1μL上样缓冲液（6×loading buffer）混匀，于1%的琼脂糖凝胶中以100V电压电泳30min左右，结束后利用凝胶成像系统拍照，初步观察DNA的纯度。

（2）紫外分光光度计检测

将5μl待测DNA溶液充分溶于ddH₂O，并定容至1ml。利用紫外分光光度计测得其260nm和280nm波长处的OD值。根据以下公式计算DNA纯度和浓度：

DNA浓度= OD₂₆₀×50ng/μl×200

DNA纯度=OD₂₆₀/OD₂₈₀

若DNA纯度在1.8-2.0之间，则DNA纯度较高；若小于1.8，则样品中可能存在RNA污染；若大于2.0，则样品中可能存在蛋白质污染。经紫外分光光度计测定OD值为1.72，纯度较高。

4、PCR扩增 

分别以8个牛品种的DNA为模版，用上述引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为32μL，见表1；PCR总反应程序，见表2；

                表1本发明的PCR反应体系

*2×Taq PCR MasterMix包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2×，具体产品组成详见产品说明书

                表2本发明的PCR反应程序

C、         目的片段的检测

将PCR产物与核酸上样缓冲液以6:1体积比充分混匀，以600bp的DNA分子标记为对照，在浓度为2%的琼脂糖凝胶中以150v电压电泳20min左右，用凝胶成像仪拍照，根据PCR产物的大小初步判定是否为所需的目的片段。

D、        PCR-RFLP检测

以测序结果为依据，利用dCAPs数据库和Primer5.0软件查找合适的限制性内切酶，参考内切酶产品说明书建议的反应体系和反应条件进行消化，反应体系见表2-8，反应条件为37℃恒温箱内消化12h。

表3 酶切反应体系

酶切产物以600bp DNA分子标记为对照，于琼脂糖凝胶中进行150V，20min左右的电泳，结束后用凝胶成像仪拍照，根据条带大小和片段数判断基因型。

E、         测序

若琼脂糖凝胶上相同片段单链DNA的电泳图谱带型不同，则视为基因型有差异，每种带型各选取2个样本进行PCR扩增，由生物工程（上海）有限公司对PCR产物进行纯化和测序，将测序结果与GeneBank数据库上的DNA序列一一比对，以最终确定SNP位点的位置和突变种类。

由于牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过琼脂糖凝胶电泳图来进行判别，根据条带的个数判断是否发生了点突变，将不同基因型区分开，从而检测其SNP多态性。结果显示，在第4912位出现三种不同基因型（GA、GG、AA），如图3所示。

F、          肉牛UCP3基因SNP位点的频率统计分析

1、基因和基因频率

基因频率（gene frequency）表示在一个群体中某等位基因在该等位基因所在的特定基因座所有等位基因中所占的百分比。基因型频率（genotype frequency）表示某种特定基因型的个体占该群体全部个体的比例。计算方法如下：

（1）等位基因频率:  P_i = (2ii+ij)/ 2N    P_j=1-P_i

（2）基因型频率=基因型个体数/ N

其中，P_i和P_j表示i、j等位基因的频率，N表示群体总数，ii和ij表示群体中基因型为ii、ij个体的个数。

表4 八种牛品种中UCP3基因4912位点的基因型和等位基因频率

由表4的等位基因频率来看，所有8个品种牛中，G为优势等位基因，且频率都很高，分别为：安格斯0.7396、海福特0.7000、晋南牛0.6739、利木赞0.6136、鲁西牛0.5862、秦川牛0.6111、西门塔尔0.6636、夏洛莱0.7414。从基因型频率来看，安格斯和夏洛莱群体都呈现GG>GA>AA的趋势，而其他6个品种的群体均为GA>GG>AA。

G、        UCP3基因G4912A多态性与肉用性状的关联分析

采用SAS9.1统计软件，对8个牛群体的不同基因型个体与性状数据进行了显著性检验（见表7）。

1）测定的主要性状包括：宰前活重、酮体重、屠宰率、净肉重、大理石花纹评分、眼肌面积、实测背膘厚、嫩度、大腿肉厚、腰部肉厚、酮体长。

2) 测定的群体：八个牛群体共318只。

关联分析一般线性的模型：调用SAS9.1软件一般线性模型GLM（genneral linear models procedure）对各基因型对肉质性状数据进行显著性检测。进行肉用性状与多态性关联分析的318个样本分别来自3个牛场的8个品种的肉牛，且月龄不同，在肉质性状数据处理中，除了考虑基因型的效应，还需要考虑到品种、场别、月龄等固定效应。本实验综合以上影响因素建立的统计模型如下：

Y_abc=μ+G_a+CR_b+M_c+e_abc

此公式中，Y_abc表示个体表型记录；μ为总体平均数；G_a为基因型效应，CR_b表示同期群效应，包括场效应和品种效应；M_c表示月龄效应，e_abc为随机误差。利用SAS 9.1统计软件依上述公式编辑运算程序，对数据进行分析，用最小二乘法拟合线性模型，各基因型间肉用性状的指标采用多重比较（邓肯法），结果用平均数±标准误（X±SE）表示，P值小于0.05为差异显著，P值小于0.01为差异极显著。

由表5可知，UCP3基因G4912A突变位点的多态性与背膘厚存在显著相关，背膘厚表现为GG型>AA型>GA型，其中GG型个体背膘厚显著大于GA型个体（P<0.05）。 

以上说明GG基因型可以作为一个提高肉背膘厚的候选分子遗传标记。

表5 UCP3基因G4912A多态性与牛肉用性状的关联分析

注：平均数肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。P值肩标为*表示差异显著，**表示差异极显著。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术方案范围内，当可利用以上所述技术内容，而做出的些许更动、修饰、演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所做的任何等同变化的更动、修饰与演变，均属于本发明的技术方案的范围内。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  一种检测肉牛UCP3基因单核苷酸多态性的方法及其应用

 

<130>  2

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tcactatcca cgaccctacc                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggtgtagaac tgcttgacgg                                                 20