一种新的酯酶及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种新的酯酶及其编码基因和应用。酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。酯酶EST04211的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明从来源于印度洋深海的芽孢杆菌SCSIO15121中克隆到一个新的酯酶，该酯酶的最大特点是，在30℃条件下催化异丁酸乙酯合成的酯化率为97％，并且在相似条件下还可以催化丙酸、丁酸、戊酸、己酸与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成丙酸乙酯、丙酸丙酯、丙酸丁酯等相应的短链芳香酯类香料，酯化率大部分达到85％～95％。该酯酶可应用于异丁酸乙酯等短链芳香酯类香料的工业化生物制造，这些酯类香料品质高，属于天然产物，可应用于食品、香烟、日化产品等生产行业。

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程和生物催化技术领域，具体涉及一种来自印度洋深海芽孢杆菌属的 酯酶基因，该基因表达的酯酶，以及该酯酶可以用于异丁酸乙酯的生物制造。

背景技术：

异丁酸乙酯作为《食品添加剂使用标准》规定允许使用的食用香料，主要用于配制奶油 及草莓、樱桃等所有水果型香精，也可用于香烟、日化产品或其它产品的香原料，同时也是 一种优良的有机溶剂。工业上生产异丁酸乙酯的方法主要是使异丁酸和乙醇直接酯化，一直 沿用强酸(如浓硫酸、对甲苯磺酸等)作催化剂。尽管强酸作为酯化合成催化剂具有理想的催 化活性且价格低廉，但强酸易使有机物碳化和氧化，且具有选择性差、产品色泽深、能耗高、 副反应多、对设备腐蚀严重和污染环境等缺点。因此，国内外都在探索代替强酸的新型催化 剂，其中生物催化剂(酶)是人们最为关注的类型之一。酶在工业生产中具有很大的优势， 能在常温常压下反应，反应速率快，催化作用专一，无污染，价格较低等。

酯酶(Esterase)是一种能催化酯键水解和合成的酶的总称，在催化酯键水解时产生甘油 和脂肪酸；在催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应时则产生酯类等香味物质。酯酶广 泛的存在于动物、植物和微生物中，其中动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。目 前酯酶已经被广泛的应用于食品酿造、农业、医药化学、制浆造纸工业、污水处理和生物修 复等领域。另一方面，酯酶不仅在异相系统(油-水界面)中发生作用，而且有些酯酶在有机 相中也能起催化作用，被广泛应用于酯类合成。目前，在有机介质中酯酶催化相应的酸和醇 合成辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯和戊酸乙酯已有相关的报道。在食品加工方面，固定化 的酯酶现在已被用于芳香酯的合成，比如利用酯酶制备的呈天然水果味的低分子量芳香酯。

目前有关异丁酸乙酯的合成报道主要涉及传统的强酸催化法，对生物催化法暂未见报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种来源于印度洋深海的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 15121的新的酯酶。

本发明的新的酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述酯酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供上述酯酶在催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应产生 酯类中的应用。

优选，是催化乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸分别与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、 己醇合成相应的脂类中的应用。

在合成反应体系中，所述的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸或庚酸，与乙醇、丙醇、丁 醇、戊醇或己醇的物质的量之比为1:1.5，所述的底物酸的浓度为200mM，合成反应温度为 30℃，酯酶EST04211的使用量为30g/L的条件下，合成相应的短链芳香酯类香料，酯化率 大部分达到85％～95％。

进一步优选，是催化异丁酸和乙醇合成异丁酸乙酯中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种异丁酸乙酯的合成方法，其特征在于，以上述酯酶为催 化酶，以异丁酸和乙醇作为底物，以正己烷为介质，催化生成异丁酸乙酯。

在反应体系中，所述的异丁酸和乙醇的最佳物质的量之比为1:1.5，所述的底物异丁酸的 最适浓度为200mM，合成反应最适温度为30℃，酯酶的最佳使用量为30g/L。

本发明的酯酶EST04211，水解活性最高的底物为对硝基苯基丁酸酯(p-NP C4)，其次为 对硝基苯基己酸酯(p-NP C6)与对硝基苯基乙酸酯(p-NP C2)。反应的最适pH值为8.0， 在pH＝8.0～10.0之间具有较高的水解活性。反应的最适温度为40℃，30～55℃之间保留有较高 的水解活性。

本发明的酯酶EST04211经冷冻干燥制成酶粉后，在有机介质中可应用于异丁酸乙酯的 合成，合成反应以正己烷为介质；底物异丁酸和乙醇的最佳摩尔比为1:1.5；在确定底物摩尔 比后，底物异丁酸的最适浓度为200mM；合成反应的最适温度为30℃；合成反应中催化剂 EST04211的最佳使用量为30g/L；在最适合成条件下，获得的最高酯化率为97％，初始合成 速率为31mmol L^-1h^-1。

本发明从来源于印度洋深海的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO15121中克隆到一个新的酯 酶，该酯酶能够催化异丁酸和乙醇合成异丁酸乙酯，与传统的化学合成相比具有反应条件温 和、生产能耗低、产品质量好和无污染的优点，因此可将其用于异丁酸乙酯的合成，通过酶 催化在温和的条件下合成、制备异丁酸乙酯，对产品的纯度、产品的质量、生产能耗和环境 保护等均具有明显的优势，这种异丁酸乙酯品质高，属于天然产物，可应用于食品、香烟和 日化产品等生产行业，因此具有广泛的应用前景。本发明提供的酯酶经冷冻干燥制成酶粉后， 可用于催化乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸分别与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成丙酸 乙酯、丙酸丙酯、丙酸丁酯等相应的短链芳香酯类香料，酯化率大部分达到80％～95％，其余 特征与应用于异丁酸乙酯的合成相似。同样该酯酶可应用于相应的短链芳香酯类香料的工业 化生物制造，这些酯类香料品质高，属于天然产物，可应用于食品、香烟、日化产品等生产 行业。

附图说明：

图1是酯酶对不同底物p-NP(C2-C12)进行水解分析的图；

图2是以p-NP C4为底物，在不同pH的缓冲液下分析酯酶EST04211的水解活性图；

图3是以p-NP C4为底物，在pH＝8.0的磷酸盐缓冲液下分析不同反应温度对酯酶EST04211 水解活性的影响图；

图4是在30℃、20g/L EST04211、200mM浓度的异丁酸条件下，分析不同底物摩尔比对酯 酶EST04211酯化率的影响图；

图5是在30℃、20g/L EST04211、异丁酸/乙醇＝1:1.5条件下，分析不同底物含量对酯酶 EST04211的酯化率的影响图；

图6是在20g/L EST04211、异丁酸/乙醇＝1:1.5、异丁酸浓度为200mM的条件下，分析不同 反应温度对酯酶EST04211的酯化率的影响图；

图7是在异丁酸/乙醇＝1:1.5、异丁酸浓度为200mM、30℃的条件下，分析不同酯酶EST04211 用量对初始反应速率的影响图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、芽孢杆菌的分离与鉴定

芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO15121分离自印度洋(89°29.22′E，10°00.12′N)-3400米深 海泥，培养好的菌体用于总DNA的提取。

2、酯酶EST04211基因的克隆、表达及酶粉制备

根据全基因组中EST04211基因序列的分析，设计相应引物扩增该基因并连接到表达载 体pET-28a(+)上，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行高效表达。

设计引物如下：上游引物为5′-TGCTAGCCATATGTATGAAACGACTGTCCAAACGTG- 3′；下游引物为5′-CGAATTCCTAAACCTGCAGGTTTGAGGCTG-3′，上下游引物的5′端分 别设计了NdeI和EcoRI酶切位点(下划线标记部分)，以芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO15 121的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，上述引物扩增得到的P CR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1476bp的碱基，命名为酯酶EST04211 基因，将其在ncbi中进行blastx比对分析，表明其与来源Bacillus licheniformis9945A的硝 基苄基酯酶(para-nitrobenzyl esterase,GI:511061542)具有99％的一致性，但是硝基苄基酯 酶(para-nitrobenzyl esterase,GI:511061542)(链接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/511061542)酯酶只是提交的Bacillus licheniformis9945A全基因组序列中的一个基因的编码序列， 他们根据这株菌中的DNA序列，根据生物信息学知识推测的这个orf编码一个酯酶，但是并 没有对这个酯酶的功能进行相应的鉴定，特别是鉴定这个酯酶在催化制备异丁酸丙酯香料中 的应用。酯酶EST04211基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有491个氨基酸， 命名为酯酶EST04211，与GenBank数据库中GI号为511061542的硝基苄基酯酶(由上述硝 基苄基酯酶(para-nitrobenzyl esterase,GI:511061542)编码的酯酶)具有99％的一致性，不 同之处在于酯酶EST04211中第435位氨基酸为A，而B.licheniformis9945A的硝基苄基酯 酶为V。

对上述含有酯酶EST04211基因的PCR产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，分别用 NdeI和EcoRI酶切含有酯酶EST04211基因的PCR产物(目的扩增片段)和表达质粒pET-28a (+)，然后将酶切产物进行连接，使酯酶EST04211基因插入到表达质粒pET-28a(+)中，经测 序验证，确认酯酶EST04211基因插入到表达质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，由 此得到重组表达质粒pET-28a(+)-EST04211。

把重组表达质粒pET-28a(+)-EST04211转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细 胞中，挑取转化子于LB液体培养基中，在37℃摇床中培养，当OD₆₀₀达到0.8左右时，加入 IPTG使其终浓度达到0.5mmol/L，转置20℃继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好 的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰 浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，11000rpm/min离心20分钟离心收集上清， 所收集的上清液即为粗酶液，可用于纯酶与酶粉的制备。粗酶液通过镍离子亲和层析柱纯化 后得到纯酶(由酯酶EST04211基因编码的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 示)。酶粉直接用粗酶液冻结后，在冷冻干燥机中制备。

3、酯酶EST04211的水解活性分析

标准反应体系为1mL，包含0.5μg纯酶(酯酶EST04211)，100mM的p-NP酯底物， 100mM的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，30℃反应10分钟，然后利用酶标仪在405nm处检测底 物的水解情况，并以相对酶活性进行表征。

(1)底物特异性分析

按照标准反应体系，对不同底物p-NP(C2-C12)进行水解分析，结果如图1所示。

酯酶EST04211水解活性最高的底物为对硝基苯基丁酸酯(p-NP C4)，其次为对硝基苯 基己酸酯(p-NP C6)与对硝基苯基乙酸酯(p-NP C2)。

(2)最适反应pH值的分析

按照标准反应体系，以p-NP C4为底物，在不同pH的缓冲液下分析酯酶EST04211的水 解活性，结果见图2。

酯酶EST04211的最适pH值为8.0，在pH＝8.0～10.0之间具有较高的水解活性。

(3)最适反应温度的分析

按照标准反应体系，以p-NP C4为底物，在pH＝8.0的磷酸盐缓冲液下分析不同反应温度 对酯酶EST04211水解活性的影响，结果见图3。

酯酶EST04211的最适温度为40℃，30～55℃之间保留有较高的水解活性。

4、酯酶EST04211催化异丁酸和乙醇生成异丁酸乙酯

标准反应体系为10ml，以正己烷为反应介质，在200rpm/min的摇床中，分别试验了不 同的底物摩尔比(异丁酸/乙醇＝1:1-1:2)、不同底物含量(100-400mM)、不同反应温度 (20-40℃)和酶用量(20-40g/L)对酯化率和反应速率的影响。产物通过GC/MS进行结构 鉴定，酯化率通过酸碱滴定法测定底物酸的消耗量间接计算得出。

(1)底物摩尔比对酯化率的分析

按照标准反应体系，在30℃、20g/L酯酶EST04211、200mM浓度的异丁酸条件下，分 析不同底物摩尔比对酯化率的影响，结果见图4，由图4可以看出，底物异丁酸和乙醇的最 佳摩尔比为1:1.5。

(2)底物含量对酯化率的分析

按照标准反应体系，在30℃、20g/L酯酶EST04211、摩尔比异丁酸/乙醇＝1:1.5条件下， 分析不同底物含量对酯化率的影响，结果见图5。底物异丁酸的最适浓度为200mM。

(3)温度对酯化率的分析

按照标准反应体系，在20g/L酯酶EST04211、摩尔比异丁酸/乙醇＝1:1.5、异丁酸浓度为 200mM的条件下，分析不同反应温度对酯化率的影响，结果见图6，从图6可以看出合成反 应的最适温度为30℃。

(4)酶用量对酯化率的分析

按照标准反应体系，在摩尔比异丁酸/乙醇＝1:1.5、异丁酸浓度为200mM、30℃的条件下， 分析不同酶用量对初始反应速率的影响，结果见图7。从图7中可以看出，当酶用量达到30g/L 时，初始反应速率达到最大值，获得的最高酯化率为97％，初始合成速率为31mmol L-1h-1。

5、酯酶EST04211催化合成其他短链芳香酯类香料

标准反应体系为10ml，以正己烷为反应介质，在200rpm/min的摇床中，分别试验了不 同的底物(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸分别与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇)， 在摩尔比酸/醇＝1:5，酸的含量200mM、30℃和酶用量30g/L的条件下，合成丙酸乙酯、丙酸 丙酯、丙酸丁酯等相应的短链芳香酯类香料，酯化率大部分达到80％～95％，结果见表1。

表1

以上所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明，所述内容 属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并 未在说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。