一种同步、简化的蛋白质研究方法及所需多功能载体的构建

摘要

本发明属于蛋白质作用机制的研究领域以及多功能载体领域。现有蛋白质的研究工作流程繁复、效率低下，且准确性难以保证，为克服以上问题，本发明提出一种可同时完成基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化的研究方法；并提供一种高效率、低毒性的载体的构建方案，本方案以超小尺寸纳米材料为基本载体，通过多种功能化使载体同时获得基因转染功能、活性分子的运载与释放性能、蛋白质纯化功能，大大提高了蛋白质作用机制研究过程的效率、准确性和即时性。本发明的主要用途为蛋白质作用机制的研究，可用于重大疾病产生机制的研究、疾病预防和新药开发、蛋白质药物生产以及基因疗法等。

说明书

技术领域：

本发明涉及蛋白质作用机制的研究领域以及多功能载体领域。本发明提供了一种同步、简化的蛋白质作用机制的研究方法，提高了蛋白质作用机制研究的效率和准确性。同时构建了一种集基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化功能于一体的多功能载体。

背景技术：

研究蛋白质的作用机制是了解各种生命活动和疾病发病机制的重要手段。蛋白质之间通过相互作用形成蛋白质复合物，从而决定生物体的复杂功能。目前，人们从生物化学、生物物理、分子动力学等多学科多方法来研究蛋白质之间的相互作用，是后基因组时代生命科学与其他学科交叉研究的热点。从分子水平揭示蛋白质复合物的三维结构是蛋白质相互作用研究中的核心方向，对于理解生物调控机制等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机制、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供了重要的理论基础。

目前蛋白质作用机制的研究流程如图1所示：

（1）基因转染，将特定基因导入细胞，通过条件摸索和筛选，得到稳定表达或高表达特定蛋白的细胞，观察微观蛋白质行为和细胞宏观反应。

（2）生物活性分子运载（如药物分子等），使用运载试剂将活性分子导入细胞，观察细胞应激行为。

（3）在步骤（1）或（2）之后，提取、分离特定蛋白质（或蛋白质复合物），解析结构、组成等，确定作用位点，分析作用模式。

目前国内外关于上述流程的主要研究方向是单独研究上述不同步骤，分别进行改进提高。如提高基因转染效率，降低毒性，提高活性分子运载的能力、靶向性、和释放的可控性；提高蛋白质（复合物）纯化的方便性和纯度等。

但是当前的研究流程存在如下问题：

（1）不同时间段细胞状态不同，许多生命活动过程很快，上述各个步骤均为独立操作，时间上很难达到同步，实验一致性难以控制，导致研究结果不准确，甚至出现错误结论。

（2）由于每步操作各自使用不同试剂，它们或存在一定的毒性，或有副作用而改变细胞的功能，从而对细胞产生多重、叠加影响。

（3）蛋白质的纯化方法主要为色谱法和亲和性分离，色谱法耗时长，使用亲和性微球需剧烈的洗脱条件（需要改变盐度、pH值等条件）。在这个过程中，大分子或大分子复合物可能变性或分解，从而造成对结构、组成分析的失误。

    因此，提高蛋白质作用机制研究过程的效率、准确性、和即时性，开发出可同时完成基因转染、生物活性分子输送、和蛋白质纯化、高效率、低毒性的载体是该领域方法学研究的必然趋势。但是到目前为止，能同时完成基因转染、生物活性分子输送、和蛋白质纯化的方案未见报道，因此，这是一个亟待解决的问题。

发明内容：

针对以上提到的问题，提出本发明。

本发明的目的是克服现有蛋白质的研究工作流程繁复、效率低下、准确性难以保证等不足，提供一种可同时完成基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化的研究方法（示意图如附图2）；并提供一种可完成上述功能的、高效率、低毒性的多功能载体的构建方法。

本发明提出的可同时完成基因转染、生物活性分子输送和蛋白质纯化的研究方法主要包含六个部分，详见说明书附图3：进行多功能载体的构建（1）；表征载体的性质，以获得物理、化学特征（2）；表征载体的功能，包括分别对基因转染性能（3）、活性分子的运载与释放性能（4）、蛋白质纯化性能（5），以及载体同时进行基因转染、活性分子运载、和蛋白质纯化综合性能（6）。

本发明的特点在于：

1.多功能载体的构建为流程中最要的一环：本发明涉及的多功能载体以超小尺寸纳米材料为基本载体，对基本载体进行功能化以获得基因负载和转染能力，并提供反应性大量官能团；链接链酶亲和素可专一性识别生物素标记的目标蛋白质，提供纯化功能。

2.多功能载体的性质表征以及功能表征可采取常规方法。

3.研究多功能载体同时进行基因转染、活性分子运载、和蛋白质纯化的综合能力，可采用如下方法：先将多功能载体负载药物分子，并结合可表达生物素标记的绿色荧光蛋白的质粒，使载体同时负载药物分子和DNA。然后加入细胞中，同时进行基因转染和活性分子运载。通过荧光显微镜可观测转染效果，同时并通过蓝色荧光强度评定喜树碱的运载与释放效率。基因转染效率和死亡率可通过取少量细胞，采用流式细胞仪和台盼蓝染色法定量测定。转染过程中，细胞将表达出带有生物素标记的绿色荧光蛋白，被俘获在该多功能载体上。分离载体，得到目标蛋白，使用SDS-PAGE电泳分析蛋白质纯度。从而获得该多功能载体用于蛋白质相互作用研究机制的综合能力。 

附图说明：

图1. 当今研究蛋白质作用机制的主要流程。整个过程需要多步完成，程序较为繁杂，影响因素多，耗时长，许多过程不能同步，细胞和蛋白质状态不易控制，影响研究结果的准确性。

图2. 本项目设计的研究方法示意图。多步操作通过使用同一个载体而一步完成，简化研究流程，大大提高工作效率，增强蛋白质作用机制研究的准确性。

图3. 本项目研究方法步骤图。

图4. 多功能载体的构建方法示意图。