法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-01-06
授权
授权
2014-12-03
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/88 申请日:20130428
实质审查的生效
2014-10-29
公开
公开
技术领域
本发明涉及中药制剂质量控制领域，更具体地，涉及一种小儿七星茶口服液 指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
背景技术
小儿七星茶口服液中的主要成分为薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉 蜕、甘草。主治功能为，定惊消滞，用于小儿消化不良，不思饮食，二便不畅、 夜寐不安。中山市恒生药业有限公司是目前唯一一家获国家食品药品监督管理总 局批准生产小儿七星茶口服液的企业。
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分 系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优 良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之 相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地 反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述 和评价。中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相 色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳法（HPCE）等色谱法以 及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR） 和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS 和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、 检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。中药成分绝大多数可在高效液 相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成 为中药指纹图谱技术的首选方法。
对于小儿七星茶口服液，目前缺乏全面反映其质量和真伪的方法，现有技术 中更没有使用HPLC对小儿七星茶口服液进行质量评价。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种小 儿七星茶口服液指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种小儿七星茶口服液指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：供试品和对照 品溶液的制备，色谱条件的确定，指纹图谱的测定，其特征在于，所述的色谱条 件为：检测波长为280～340nm；柱温为20～40℃，流速为0.8～1.5ml/min，以十 八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相由流动相A和B组成，以乙腈为流动相 A，以PH值为2.0～4.0的水溶液为流动相B，在50～80min内进行线性梯度洗脱， 流动相A的起始体积分数为3～7%，结束时的体积分数为20～40%。
该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度 高、重现性好等优点。利用该方法检测到的小儿七星茶口服液指纹图谱化学成分 相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
作为一种优选方案，所述的线性梯度洗脱的时间为70min；线性梯度洗脱的 的条件为：
0min时，流动相A的体积分数为3～7%，流动相B的体积分数为97～93%；
25～35min时，流动相A的体积分数为13～17%，流动相B的体积分数为 87～83%；
50～70min时，流动相A的体积分数为20～30%，流动相B的体积分数为 80～70%。
作为一种优选方案，所述的线性梯度洗脱的时间为60min；线性梯度洗脱的 的条件为：
0min时，流动相A的体积分数为5%，流动相B的体积分数为95%；
30min时，流动相A的体积分数为15%，流动相B的体积分数为85%；
60min时，流动相A的体积分数为25%，流动相B的体积分数为75%。
在指纹图谱的建立方法中，为了使指纹图谱中的各特征峰具有较好的分离度、 峰形及合理的控制指纹图谱的检测时间，对于梯度洗脱条件的选择至关重要，本 领域技术人员在选择梯度洗脱条件的时候都需要付出大量的实验不断对梯度洗 脱条件进行优化，因为对于不同的中药材及制剂，其中的化学成分千差万别，不 同的药材及制剂指纹图谱的洗脱条件并无参考价值，流动相比例的微小变化将会 对指纹图谱造成很大的影响，如将会影响特征峰的分离度和峰形。本申请的发明 人通过大量的实验，对梯度洗脱条件进行摸索，最终确定了上述梯度洗脱条件。
作为一种优选方案，所述的流动相B为体积分数为0.01～0.1%冰醋酸水溶液。
作为一种最优选方案，所述的流动相B为体积分数为0.1%冰醋酸水溶液。
本发明考察了许多不同的流动相对指纹图谱的影响，结果表明，采用上述流 动相，指纹图谱中所得峰的信息较多；基线较平稳，分离度、峰形和柱效最佳。
作为一种优选方案，所述的检测波长为290～320nm；柱温为25～35℃，流 速为0.8～1.2ml/min。
作为一种最优选方案，所述的检测波长为300nm；柱温为30℃，流速为 1.0ml/min。
本发明考察了不同的检测波长、柱温对指纹图谱的影响，结果在上述波长和 柱温下得到的指纹图谱，其成分相对较多、各峰高比例适中、基线比较平稳。
本发明所述的供试品溶液通过以下方法制备得到：取小儿七星茶口服液过 0.45μm微孔滤膜，即得。本发明考察了利用不同溶剂、不同提取方法制备供试 品溶液，结果表明，在本发明所述方法下制备得到的供试品溶液，经检测，在指 纹图谱中化学成分相对较多、各峰高度比例适中，且基线比较平稳，故采用上述 方法作为供试品溶液的制备方法。
本发明所述对照品溶液的制备方法为取甘草苷对照品，精密称定，加甲醇制 成每1ml含甘草苷0.1～0.2mg的溶液。优选地，加甲醇制成每1ml含甘草苷0.14mg 的溶液。
本发明所述指纹图谱的测定方法为分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液 各2～15μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图。优选地，分别精密吸取对 照品溶液和供试品溶液各5μl。
所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，其保留时间分别为：6.301min； 8.899min；11.486min；16.165min；17.234min；19.424min；24.071min；25.433min； 28.121min；31.558min；36.210min；54.356min。
所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，以甘草苷峰为参照，其相对保 留时间分别为：0.1740；0.2458；0.3172；0.4464；0.4759；0.5364；0.6648；0.7024； 0.7766；0.8715；1；1.5011。
所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，其峰面积为：0.0596；0.0349； 0.0768；0.0279；0.0642；0.0566；0.0227；0.0191；0.0857；0.1630；0.1732；0.0222。
所测定的指纹图谱中含有12个共有特征峰，以甘草苷峰为参照，其相对峰 面积为：0.3441；0.2015；0.4434；0.1611；0.3707；0.3268；0.1311；0.1103；0.4948； 0.9411；1；0.1282。
本发明具有如下有益效果：（1）该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣， 具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；（2）用该方法检测到的小儿 七星茶口服液指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳， 分离度、峰形和柱效好。
附图说明
图1为供试品色谱图。
图2为经指认后的色谱图。图1和2中，峰S为甘草苷。
图3为方法1下制备得到的供试品的色谱图。
图4为方法2下制备得到的供试品的色谱图。
图5为方法3下制备得到的供试品的色谱图。
图6为方法4下制备得到的供试品的色谱图。
图7为方法5下制备得到的供试品的色谱图。
图8为方法6下制备得到的供试品的色谱图。
图9为检测波长为280nm时的色谱图。
图10为检测波长为300nm时的色谱图。
图11为检测波长为320nm时的色谱图。
图12为检测波长为340nm时的色谱图。
图13为流动相1下得到的色谱图。
图14为流动相2下得到的色谱图。
图15为流动相3下得到的色谱图。
图16为流动相4下得到的色谱图。
图17为流动相5下得到的色谱图。
图18为流动相6下得到的色谱图。
图19为流动相7下得到的色谱图。
图20为流动相8下得到的色谱图。
图21为流动相9下得到的色谱图。
图22为流动相10下得到的色谱图。
图23为梯度1下得到的色谱图。
图24为梯度2下得到的色谱图。
图25为梯度3下得到的色谱图。
图26为梯度4下得到的色谱图。
图27为梯度5下得到的色谱图。
图28为梯度6下得到的色谱图。
图29为梯度7下得到的色谱图。
图30为梯度8下得到的色谱图。
图31为梯度9下得到的色谱图。
图32为梯度10下得到的色谱图。
图33为梯度11下得到的色谱图。
图34为梯度12下得到的色谱图。
图35为梯度13下得到的色谱图。
图36为梯度14下得到的色谱图。
图37为梯度15下得到的色谱图。
图38为梯度16下得到的色谱图。
图39为梯度17下得到的色谱图。
图40为梯度18下得到的色谱图。
图41为梯度19下得到的色谱图。
图42为梯度20下得到的色谱图。
图43为梯度21下得到的色谱图。
图44为梯度22下得到的色谱图。
图45为梯度23下得到的色谱图。
图46为梯度24下得到的色谱图。
图47为梯度25下得到的色谱图。
图48为梯度26下得到的色谱图。
图49为梯度27下得到的色谱图。
图50为梯度15℃下得到的色谱图。
图51为梯度20℃下得到的色谱图。
图52为梯度25℃下得到的色谱图。
图53为梯度30℃下得到的色谱图。
图54为梯度35℃下得到的色谱图。
图55为梯度40℃下得到的色谱图。
图56为梯度45℃下得到的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式 的限定。
本实施例使用如下仪器试药
1．仪器高效液相色谱仪：Waters2695/2487，SHIMADZU(SIL-HTC /SPD-20A/C70-20AC/LC-20AT)；色谱柱：Ultimate AQ-C18（5μm， 150mm×4.6mm）、资生堂MGⅡ-C18（5μm，150mm×4.6mm）、Sepax Bio-C18（5μm， 250mm×4.6mm）、Agilent Eclipse XDB-C18（5μm，250mm×4.6mm）；电子天平： Sartorius CP224S、Sartorius CP225D；真空干燥箱：VOS-201SD；超声波清洗器： KQ-300DA型。
2．试剂乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
3．对照品甘草苷（批号为111610-2011106），购于中国药品生物制品检定 所。
4．供试品20120503、20120201、20120202、20120203、20120302、20120501、 20120502、20120504、20120602、20120606、20120608、20120610、20120702、 20120703、20120710、20120802、20120806、20120812、20120905、20100914、 20121002，共21批样品，均由中山市中智药业集团有限公司提供。
实施例1
1．色谱条件的确定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相 A，以0.1%冰醋酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为 300nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。
表1流动相梯度表
2．对照品溶液的制备精密称取甘草苷对照品，0.00140g，置10ml容量瓶 中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（即：每1ml含甘草苷0.14mg）。
3．供试品溶液的制备取小儿七星茶口服液（用0.45μm微孔滤膜滤过），即 得。
4．测定分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪， 测定，记录色谱图，结果(见图1)。
5.色谱峰的指认取供试品溶液（批号为20120503）、甘草苷对照品及药材 （各药材模拟制法进行制备），按拟定的方法并用DAD检测器测定，记录色谱 图。利用保留时间和DAD光谱图，可知：5～10min的色谱峰主要来源于薏苡仁、 山楂、稻芽药材，其共有峰为1号峰；13～32min的色谱峰主要来源于淡竹叶药 材，其中包括3、4、6、7、8、9号共有峰；40～60min的色谱峰主要来源于甘草 药材，其中包括11、12号共有峰；2号共有峰可能来源于蝉蜕；5号共有峰可能 来源于钩藤和淡竹叶；10号共有峰可能来源于薏苡仁。处方中的七味药味基本 都在本指纹图谱中体现（见附图2）。
请提供1～12号峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、相对峰面积等数据。
实施例2
1．仪器精密度取本品（批号为20120503），按照拟定的方法测定，连续 进样6次，测定结果经中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范计算，6次 测定结果的相似度在均为1.00，说明仪器精密度较高。
2．重复性试验取本品（批号为20120503）共6份，按照拟定的方法测定， 各取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统计 算，图谱之间的相似度均为1.00，表明方法的精密度较好。
3．耐用性试验
3.1溶液稳定性试验取本品溶液（批号为20120503），按照拟定的方法测 定，分别在0、3、6、9、12、15、24、30、36小时测定结果，经中药色谱指纹 图谱相似度评价系统计算，9次测定结果的相似度在均大于0.98，说明供试品溶 液在36小时内是稳定的。
3.2不同色谱柱比较取本品（批号为20120503），分别采用四根不同的色 谱柱进样，按照拟定的方法测定。色谱柱：Ultimate AQ-C18（5μm，150mm×4.6mm）； 资生堂MGⅡ-C18（5μm，150mm×4.6mm）；Sepax Bio-C18（5μm，250mm×4.6mm）； Agilent Eclipse XDB-C18（5μm，250mm×4.6mm）。测定结果经中药色谱指纹图 谱相似度评价系统计算，四根色谱柱的测定结果的相似度在均大于0.95，说明不 同品牌不同柱长的色谱柱均适用于本品。
3.3不同仪器比较取本品（批号为20120503），分别在Waters2695/2487 和SHIMADZU(SIL-HTC/SPD-20A/C70-20AC/LC-20AT)液相色谱仪上采用 Ultimate AQ-C18（5μm，150mm×4.6mm）色谱柱，按照拟定的方法测定。测定 结果经中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，两台仪器的测定结果的相似度 在均大于0.98，说明本品能在Waters2695/2487和SHIMADZU(SIL-HTC /SPD-20A/C70-20AC/LC-20AT)两个品牌仪器液相色谱仪得到较为一致的图 谱。
实施例3样品的测定
取本品21批，按拟定的测定方法测定，将用AIA格式导出，用中药色谱指 纹图谱相似度评价系统（选择时间窗0.1），用平均值法生成对照指纹图谱（见图 27）。将21批样品的谱图与对照指纹图谱（对照指纹图谱是由21批样品的指纹 图谱以平均值法生成的）进行相似度计算（见表2），结果样品与对照指纹图谱 相似度比较均大于0.89，说明样品的一致性较好。
表2样品与对照指纹图谱相似度比较
实施例4供试品制备方法的确定
方法1、取小儿七星茶口服液（用0.45μm微孔滤膜滤过），即得。
方法2、精确量取小儿七星茶口服液10ml，加水稀释至50ml，加入等体积 的乙酸乙酯振摇提取2次，每次50ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇转 移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法3、精密量取小儿七星茶口服液10ml，加入水稀释至50ml，加水饱和 正丁醇振摇提取2次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇转移置10ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法4、精密量取小儿七星茶口服液10ml，用水饱和正丁醇提取2次，每 次20ml，合并，蒸干，残渣加甲醇转移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。
方法5、精密量取小儿七星茶口服液10ml，用水饱和正丁醇提取2次，每次 20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，滤过，滤液通过聚酰胺小 柱（30～60目，2g，内径为1cm），用水30ml洗脱，弃去洗脱液，继以50%乙 醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解转移置10ml量瓶中，加甲 醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法6、精密量取小儿七星茶口服液10ml，加40%盐酸（40→100）12ml， 加热回流2小时，蒸干，残渣用甲醇溶解转移置10ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，滤过，即得。
测定：分别吸取上述6种方法所得的供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定， 记录色谱图，结果见附图3～8。比较了6种不同提取方法的供试品溶液得出图谱， 结果方法1所得的图谱（附图3所示）检测的化学成分相对较多、各峰高之间的比 例适中，且基线比较平稳。
实施例5检测波长的考察
取同一份供试品溶液，分别在280nm、300nm、320nm、340nm下检测，结 果见附图9～12。附图结果表明在300nm波长下检测到的成分相对最多、各峰高 比例适中、基线最平稳。
实施例6流动相的选择（本实施例所述百分比为体积百分比）
流动相1：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；
流动相2：以乙腈为流动相A，以水为流动相B；
流动相3：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水溶液（pH值为2.23）为流动 相B；
流动相4：以乙腈为流动相A，以0.1%冰醋酸水溶液（pH值为3.43）为流 动相B；
流动相5：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液（pH值为2.73）为流动 相B；
流动相6：以乙腈为流动相A，以0.1%冰醋酸水溶液（pH值为3.20）为流 动相B；
流动相7：以乙腈为流动相A，以0.5%冰醋酸水溶液（pH值为2.91）为流 动相B；
流动相8：以乙腈为流动相A，以0.05%冰醋酸水溶液（pH值为3.34）为流 动相B；
流动相9：以乙腈为流动相A，以0.02%冰醋酸水溶液（pH值为3.54）为流 动相B；
流动相10：以乙腈为流动相A，以0.01%冰醋酸水溶液（pH值为3.66）为 流动相B；
按下表中的规定进行梯度洗脱：
流动相梯度表
结果：采用流动相6检测供试品所得峰的信息较多；基线较平稳，分离度、 峰形和柱效为佳（见附图13～22）。
实施例7流动相梯度的考察
以乙腈为流动相A，0.1%冰醋酸水溶液为流动相B，按表3中的梯度对流动相 的梯度进行了考察（见附图23～49），结果梯度27所需有时间短，且分离度、峰形 和柱效佳。具体梯度情况如下：
表3流动相各梯度表
实施例8柱温的考察
对不同的柱温进行考察，其中在柱温为20℃～40℃时，供试品的分离效果均 较为理想，其中检测柱温为30℃时最佳（见附图50～56）。
机译： 食品化学和治疗值标准化的一种方法？使用动画色谱指纹图谱的药物
机译： 一种使用动画色谱指纹图谱标准化食品和药品化学和治疗价值的方法
机译： 一种使用动画色谱指纹图谱标准化食品和药品化学和治疗价值的方法
