一种脂质代谢网络动态研究的方法

摘要

本发明公开了一种脂质代谢网络动态研究的方法，该方法是基于稳定同位素标记辅助的脂质组学，并结合非靶向的同位素异构体筛选。其特征在于，结合稳定同位素标记的细胞、动物或人体的实验，高分辨的超高效液相色谱-质谱联用(high resolution-UHPLC-MS)的脂质组学分析，非靶向的同位素异构体筛选，在获得静态脂质代谢指纹的同时，可以捕获包含其中的动态代谢过程（如脂质分子的合成、转化、分解等过程）。本发明具有高度的分子特异性和广泛的网络覆盖能力，方法重复、稳健、可靠。该方法为深入研究脂质代谢开辟了新思路，以期对生物体系的病理生理过程、代谢扰动获得更深刻全面的理解。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学和生物化学领域，是一种基于稳定同位素标记辅 助的脂质组学并结合非靶向的同位素异构体筛选，用于脂质代谢网络的动 态研究的新方法。

背景技术

脂质是一类重要的代谢物，除了储存能量外，是细胞膜结构的重要组 成成分，也是调节各类信号过程的关键因子。脂质代谢的失调与多种疾病 的发生、发展有关。脂质组学（Lipidomics）是研究脂质代谢的有力手段。 然而大部分的脂质组学组学只能获取到“快照式（snapshot）”的静态脂质轮 廓，无法对脂质代谢的动态过程（如合成、转化、降解等）进行深入研究。

将稳定同位素标记的前体分子引入到实验体系中，可以捕获脂质代谢 动态过程。经典方法有气相色谱-同位素比例质谱 （gas-chromatography-isotope ratio mass spectrometry,GC-IRMS）、基于气相 色谱-质谱联用（gas-chromatography coupled with mass spectrometry,GC-MS） 的质量同位素异构体分布分析（mass isotopomer distribution analysis, MIDA）。然而这些方法涉及的GC-MS分析前的样品预处理复杂繁琐，并且 无法从分子水平上实现MID分析。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的分 析手段通过二级质谱实验（MS/MS）显著提高了同位素富集研究的分子特 异性。

目前有报道，通过测定胆固醇酯（cholesterol esters）、磷脂 （phospholipid）、三酰甘油（triacylglycerol）、鞘脂（sphingolipid）或酯酰 辅酶A（acyl-coA）等脂质库对外源性稳定同位素的吸收,来研究在饮食或 药物干预下的脂质代谢应答；或利用稳定同位素标记追踪脂肪酸碳链的延 长和降解。这些研究大大开拓了人们对脂质代谢的认识。然而，到目前为 止，这些研究只关注某一类或某几种的脂质，缺少一种非靶向的策略，可 以实现对尽可能多的标记脂质的检测和覆盖，从而进一步获取细胞、体液 或组织中脂质代谢动态过程的复杂信息。

鉴于此，我们提出一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学并结合非 靶向的同位素异构体筛选，用于脂质代谢网络的动态研究的新方法。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提出一种脂质代谢网络动态研究的方法， 该方法是基于稳定同位素标记辅助的脂质组学，并结合非靶向的同位素异 构体筛选。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案和技术步骤如下：

第一步，将稳定同位素标记的脂质合成前体分子（常用有¹³C全标记的 棕榈酸或油酸）引入生物体系中。实验体系包括细胞模型，植物、动物模 型或人体的在体模型，通过如培养基、饮食、注射等方式在各个相应模型 中引入稳定同位素标记的脂质合成前体分子；

第二步：脂质提取物用超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UHPLC-high resolution MS)以全扫描的形式进行脂质组学数据采集。

第三步：将得到的脂质组学原始数据进行峰匹配和特征提取后，得到包含 各个样品的所有离子的保留时间（tR）、质荷比（m/z）以及强度的峰表，并 进行初步数据预处理，包括修正80%原则除去缺失值（参考文献1：Bijlsma, S.;Bobeldijk,L.;Verheij,E.R.;Ramaker,R.;Kochhar,S.;Macdonald,I.A.; van Ommen,B.;Smilde,A.K.Analytical Chemistry2006,78,567-574.），QC 重复性考察除去变异系数大的离子（参考文献2：Gika,H.G.;Theodoridis,G. A.;Wingate,J.E.;Wilson,I.D.Journal of Proteome Research2007,6, 3291-3303.）。

第四步：从处理后的峰表信息中筛选出同源的标记了完整的初始前体 分子的同位素异构体（isotopomer），即标记的同位素异构体含有的稳定同 位素个数为前体分子中的稳定同位素个数或其整数倍，如，采用¹³C全标记 的棕榈酸，相应的同位素异构体含有至少一个¹³C₁₆，并将同源的，即属于 同一个标记脂质的所有筛选所得同位素异构体归属到同一个标记脂质分 子；筛选原则包括：

1）根据所采用的标记前体分子，同源的同位素异构体系列的理论m/z 差为固定值，在实验测定中允许一定误差范围，在高分辨质谱下允许 ±0.005～±0.001的误差范围；

2）同源的同位素异构体的理论保留时间t_R完全对齐，在实验测定中允 许一定漂移范围，在可重复的色谱行为下允许±0.1min以内；

3）各个同位素异构体由于同位素富集程度（如¹³C富集度）的不同， 同位素模式（isotopic>

4）稳定同位素标记的同位素异构体在空白对照中检测不到；

根据上述筛选原则，从峰表数据中提取出同源的标记了完整的初始前 体分子的同位素异构体，并归属于同一个标记脂质分子。

如在采用[U-¹³C]-palmitate为前体分子的例子中，同源的同位素异构体 系列的m/z差=16×（¹³C-¹²C）=16.0536；该步骤筛选出一系列的同源同位素 异构体，包括，M（天然不标记形式的脂质分子），M+16（¹³C₁₆标记形式）， M+32（¹³C₃₂标记形式），M+48（¹³C₄₈标记形式）系列同位素异构体离子， 并进行匹配。

第五步：在第四步基础上筛选出标记了前体分子代谢中间体的脂质同 位素异构体，筛选原则包括：

1）标记了前体分子代谢中间态的同位素异构体，与第四步中筛选出的 同源离子，m/z差是基于可能的中间代谢过程所导致的碳链的长度变化，如 脂肪酸链的缩短或延长；并在实验测定中允许一定误差范围，在高分辨质 谱下允许±0.005～±0.001的误差范围

2）所有同源同位素异构体的理论保留时间t_R完全对齐，在实验测定中 允许一定漂移范围，在可重复的色谱行为下允许±0.1min以内；

3）各个同位素异构体由于同位素富集程度（如¹³C富集度）的不同， 同位素模式（isotopic>

4）稳定同位素标记的同位素异构体在空白对照中检测不到；

根据上述筛选原则，从峰表数据中提取除同源的标记了前体分子的代 谢中间体的同位素异构体，并合并第四步中筛选得的标记了完整前体分子 的同位同位素异构体，进行匹配。

如在以[U-¹³C]-palmitate为标记前体分子的例子中，筛选出M+12（¹³C₁₂标记形式），M+14（¹³C₁₄标记形式），M+18（¹³C₁₈标记形式），M+20（¹³C₂₀标记形式），M+28（¹³C₂₈标记形式），M+30（¹³C₃₀标记形式），M+34（¹³C₃₄标记形式），M+36（¹³C₃₆标记形式），M+44（¹³C₄₄标记形式），M+46（¹³C₄₆标记形式），M+50（¹³C₅₀标记形式），M+52（¹³C₅₂标记形式）系列同位素异 构体离子，并将所有的同源离子（包括第四步筛选出的离子）进行匹配， 归属到同一个标记脂质分子。

第六步，基于精确m/z、二级质谱（MS/MS）和数据库LIPIDMAPS， HMDB搜索所得的定性结果（分子式，含¹³C标记个数）和¹³C的天然丰度 （1.08%），对同位素异构体的丰度进行天然同位素的校正，并进行质量同 位素异构体分布分析（mass>

第七步，计算所有检测到的脂质的整体丰度[¹²C+¹³C]（静态轮廓）；标 记脂质的同位素标记百分比[¹³C/(¹²C+¹³C)]（动态同位素富集）。结合两者信 息，实现对脂质代谢网络的动态过程研究。

附图1是以细胞模型为例的完整技术流程图。

该方法以非靶向的模式检测标记的脂质分子及其质量同位素异构体， 并实现对相同脂质来源的同位素异构体的精确匹配，从而同时得到脂质代 谢轮廓信息和代谢过程的动态信息。该方法的分子特异性高，重复性好， 能广泛覆盖相关代谢网络。

附图说明

图1是本发明的技术流程图（以细胞模型为例）。

图2是基于本专利方法，根据在实施例1中检测到的203个标记脂质分子 的整体水平[¹²C+¹³C]和稳定同位素富集水平[¹³C/(¹²C+¹³C)]，构建的包含动 态过程的脂质代谢网络。图中带下划线表示的脂质种类，是方法所检测到 的标记脂质种类。图中灰色柱状图表示脂质在[U-¹³C]-palmitate处理组中的 整体水平；虚线表示脂质在空白对照组中的整体水平；实线表示标记脂质 的同位素富集水平。图中缩写所表示的脂质名称：PC,phosphatidylcholine; LPC,lyso-phosphatidylcholine;PE,phosphatidylethanolamine;LPE, lyso-phosphatidylethanolamine;PS,phosphatidylserine;LPS, lyso-phosphatidylserine;PI,phosphatidylinositol;LPI,lyso-phosphatidylinositol; PG,phosphatidylglycerol;LPG,lyso-phosphatidylglycerol;PA,phosphatidic acid;LPA,lyso-phosphatidyl>

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技 术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但 本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

棕榈酸（palmitate）被报道在骨骼肌细胞中可以引起细胞压力，胰岛素 抵抗，从而诱发凋亡。但该研究背景下深入的脂质代谢尚不清楚。利用稳 定同位素标记辅助的脂质组学手段，研究棕榈酸的代谢轨迹，下游脂质代 谢及其动态过程，能为该方面的研究提供新的思路。

人类原代骨骼肌肌小管细胞用EMEM培养液（Eagle's minimum essential medium，最低必需培养液)培养，该培养基中含250μM[U-¹³C]-palmitate， 收集4h,12h,24h的处理时间后的细胞。[U-¹³C]-palmitate事先与BSA（牛血清 蛋白）共孵育使[U-¹³C]-palmitate与BSA结合（[U-¹³C]-palmitate:BSA=4:1,摩 尔比）（参考文献3：Peter,A.;Weigert,C.;Staiger,H.;Machicao,F.;Schick,F.; Machann,J.;Stefan,N.;Thamer,C.;H.-U.;Schleicher,E.Diabetes 2009,58,1757–1765.）。同时，以不含[U-¹³C]-palmitate的培养基培养的细胞 在相同的时间点采集，作为空白对照组。

收集的细胞用MTBE提取（参考文献4：Matyash,V.;Liebisch,G.; Kurzchalia,T.V.;Shevchenko,A.;Schwudke,D.Journal of Lipid Research 2008,49,1137-1146.）进行脂质提取，继而用UHPLC-LTQ-Orbitrap分析。

分析条件如下：色谱分离在超高效液相系统Thermo Accela^TM>8AQUITY^TM>2O=60:40,10mM>

原始数据经过Thermo软件Sieve(V1.2,Thermo Fisher,San Jose,CA, USA)峰匹配、特征提取,然后根据修正80%原则（参考文献1：Bijlsma,S.; Bobeldijk,L.;Verheij,E.R.;Ramaker,R.;Kochhar,S.;Macdonald,I.A.;van Ommen,B.;Smilde,A.K.Analytical Chemistry 2006,78,567-574.）和QC重复 性（参考文献2：Gika,H.G.;Theodoridis,G.A.;Wingate,J.E.;Wilson,I.D. Journal of Proteome Research 2007,6,3291-3303.）进行数据预处理，得到包 含>7000个离子的峰表信息。

首先从预处理后的峰表中筛选出同源的标记的完整的¹³C₁₆的同位素异 构体。m/z差范围为16.0536(=16×[¹³C-¹²C])±0.001，t_R偏差为±0.05min以 内，用于筛选M（天然不标记形式的脂质分子），M+16（¹³C₁₆标记形式）， M+32（¹³C₃₂标记形式），M+48（¹³C₄₈标记形式）系列同位素异构体离子， 并将同源的同位素异构体归属于同一个标记脂质分子，共得到240个同源 的同位素异构体系列。

随后筛选出标记了前体分子代谢中间体的同位素异构体，允许的m/z误 差范围为±0.0015，t_R偏差为±0.1min，用于筛选M+12（¹³C₁₂标记形式）， M+14（¹³C₁₄标记形式），M+18（¹³C₁₈标记形式），M+20（¹³C₂₀标记形式）， M+28（¹³C₂₈标记形式），M+30（¹³C₃₀标记形式），M+34（¹³C₃₄标记形式）， M+36（¹³C₃₆标记形式），M+44（¹³C₄₄标记形式），M+46（¹³C₄₆标记形式）， M+50（¹³C₅₀标记形式），M+52（¹³C₅₂标记形式）系列同位素异构体离子， 并将它们与标记了完整的前提分子的同位素异构体一起归属到同一个标记 脂质分子，共得到749个同位素异构体。根据精确m/z和二级质谱MS/MS 和数据库LIPIDMAPS，HMDB搜索，进行脂质分子的鉴定。根据鉴定得到 的分子式和¹³C的天然丰度（1.08%），进行¹³C天然同位素校正，最终保留 692个离子，归属于203个标记的脂质分子。

203个标记的脂质分子，覆盖了12类脂质，包括，磷脂酰胆碱（PC）， 溶血磷脂酰胆碱（LPC），磷脂酰乙醇胺（PE），溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）， 磷脂酰丝氨酸（PS），溶血磷脂酰丝氨酸（LPS），磷脂酰肌醇（PI），溶 血磷脂酰肌醇（LPI），磷脂酰甘油（PG）,溶血磷脂酰甘油（LPG），磷 脂酸（PA）,溶血磷脂酸（LPA）,神经酰胺（Cer）,二氢神经酰胺（dHCer）, 己糖苷神经酰胺（HexCer），鞘磷脂（SM）,二酰甘油（DG）,三酰甘油 （TG）,胆固醇酯（choE）,心磷脂（CL）,溶血心磷脂（LCL）,3-磷酸- 甘油（G-3-P），二磷酸胞苷-二酰基甘油（CDP-DG）。这些标记脂质表明 了棕榈酸流向的下游脂质库。

用所有标记脂质的整体水平（[¹²C+¹³C]）和标记百分比信息（[¹³C /(¹²C+¹³C)]），构建包含动态信息的在棕榈酸环境下的人类原代骨骼肌肌小 管细胞的脂质代谢网络。从附图2，比较整体水平和稳定同位素富集水平， 可以揭示脂质代谢的静态轮廓和动态过程。如TG，PC尽管其总量[¹²C+¹³C] 随时间变化不大，或仅有微弱的增加，但其同位素标记百分比[¹³C/(¹²C+¹³C)] 随时间显著增加（70%-80%），这表明其具有很高的周转速率（turnover）。 过多的棕榈酸无法以TG的形式储存，是其诱导凋亡的相关原因之一。其他 脂质PI,dHCer,PS,LPC和LPE，在同位素标记水平，即合成显著增加的同 时，总量在4h-24h间也发生了大于2倍的显著上调。