一种通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒。该试剂盒含有以鸭甲肝病毒DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白包被的ELISA板。该重组蛋白是以下述方法获得：以DHAV-1和DHAV-3作为材料，分别对DHAV-1VP3基因和DHAV-1VP1基因进行扩增、克隆得到重组质粒pMD-1VP3和pMD-3VP1，然后定向串联插入到pET-32a(+)表达载体，筛选获得重组表达质粒pET-1VP3-3VP1，经ITPG诱导表达、纯化，获得DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白。该试剂盒一次检测可对DHAV-1和DHAV-3两种抗体水平作出评价，成本低廉、操作简便、快速，适合批量样品的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通用型鸭甲型肝炎病毒抗体检测试剂盒，用于鸭甲型肝炎病毒1型 (DHAV-1)和3型(DHAV-3)抗体的快速检测，属于生物技术领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎是危害雏鸭的一种急性、高致死性传染病，具有发病急、病程短、传播快、 病死率高等特点，主要侵害3周龄以内雏鸭，严重威胁养鸭业健康发展。其病原为鸭甲型肝 炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，归属于小RNA病毒科的禽肝炎病毒属，由于DHAV 序列之间存在显著差异，且不同型的DHAV间无交叉反应，又将DHAV分为DHAV-1、DHAV-2 和DHAV-3，其分别对应基因A型(血清1型)、基因B型(台湾新型)和基因C型(韩国 新型)。迄今为止，国内流行的主要为DHAV-1和DHAV-3毒株。除台湾外，内陆尚未见DHAV-2 毒株的报道。随着养鸭业不断向产业化、集约化和规模化方向发展，许多地区所进行的传统 鸭肝炎的主动免疫或被动免疫失败现象频繁发生，对鸭肝炎的防控提出了新的挑战。目前 DHAV-1疫苗已获得批准文号，DHAV-3疫苗尚在研制过程中。鉴于当前DHAV-1和DHAV-3 的危害日趋严重，多价苗的开发迫在眉睫。

疫苗研制成功后，又面临如何对免疫抗体进行追踪监测？传统的血清中和试验周期长， 费时费力，不利于批量样品的快速检测。基于全病毒建立的ELISA方法因DHV纯化比较困 难而限制了该方法的推广应用，已报道的利用大肠杆菌表达的主要抗原蛋白建立的ELISA方 法是针对其中一个血清型的DHAV，在用于多价疫苗评价时，需要分别进行DHAV-1和 DHAV-3抗体的检测，操作繁琐，成本翻倍。目前尚未见针对DHAV-1和DHAV-3抗体通用 型ELISA检测方法的报道。在小RNA病毒中，VP1和VP3蛋白作为主要的宿主保护蛋白， 编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，是决定病毒抗原性的主要成分，是目 前研究的热点基因。因此，利用基因工程技术研制开发适用于DHAV-1和DHAV-3抗体检测 的特异的、敏感的、适合基层应用的通用型ELISA检测试剂盒，对于我国当前鸭甲型肝炎病 毒的快速诊断和有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服传统鸭肝炎检测方面的不足，可同时进行DHAV-1和DHAV-3两种 抗体水平的评价。本发明提供一种针对DHAV-1和DHAV-3抗体的通用型ELISA检测试剂盒， 该试剂盒成本低廉、操作简便、快速，尤其适用于疫苗免疫后批量样品的抗体监测，大大提 高了鸭肝炎血清学诊断的速度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：通用的鸭甲型肝炎病毒1型VP3和3型 VP1(DHAV-1VP3-3VP1)重组蛋白的制备，包括以下步骤：

1)以DHAV-1病毒作为材料，通过RT-PCR方法对其VP3基因(SEQ-1)进行扩增、克 隆得到重组质粒pMD-1VP3；扩增VP3基因的上下游引物分别是：

正链引物(上游引物)：5'-AAGGGATCCGGAAAGAGAAARCCACG-3'(SEQ-5)(BamH I)

负链引物(下游引物)：5'-ATCGTCGACCTGATYATTGGTTGCCAT-3'(SEQ-6)(Sal I)

扩增片段大小为711bp；

2)以DHAV-3病毒作为材料，通过RT-PCR方法对其VP1基因(SEQ-2)进行扩增、克 隆得到重组质粒pMD-3VP1；扩增VP1基因的上下游引物分别是：

正链引物(上游引物)：5'-ATTGTCGACGGTGATTCCAATCAGCTTG-3'(SEQ-7)(Sal I)

负链引物(下游引物)：5'-AGTCTCGAGTTCAATYTCCARATGGAG-3'(SEQ-8)(Xhol I)

扩增片段大小为720bp；

3)以BamH I和Sal I同时对重组质粒pMD-1VP3和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的 片段，16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经BamH I和Sal I双酶切鉴定正 确后获得阳性重组质粒pET-1VP3；以Sal I和Xhol I同时对重组质粒pMD-3VP1和pET-1VP3 进行酶切，回收目的片段，16℃连接过夜，转化BL21(DE3)感受态细胞，提取质粒，经Sal I 和Xhol I双酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-1VP3-3VP1；

4)将阳性重组表达质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓 度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，超声波破碎，离心后取沉淀进一 步分离纯化，得到较纯的目的重组蛋白。

本发明的技术方案是：一种通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，其特征是， 包括以DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白包被的ELISA板。

ELISA板的最佳制备条件为：用pH8.5的0.05M Tris-HCL缓冲液作包被液，将 DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白稀释为10μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2 小时，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2小时，以含0.05％吐温 -20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，待其干燥后 装入含干燥剂的包装袋中保存。

本发明的进一步技术方案是：一种通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，包括 以下组分：以DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白包被的ELISA板：5块；样品稀释液：200mL；10 ×浓缩洗涤液：400mL(用前1:10稀释)；酶结合物工作液：50mL；显色液：100mL；终止液： 60mL；阳性对照：2mL；阴性对照：2mL。

上述通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒中，样品稀释液为含0.05％吐温-20 的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；10×浓缩洗液为含0.5％吐温-20的0.1M pH7.4的磷酸盐缓 冲液；酶结合物工作液为美国KPL公司生产的HRP-羊抗鸭IgG；显色液为0.2mg/mL四甲基 联苯胺(TMB)溶液和含0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，二者体积比为1：1； 终止液为0.31％氢氟酸溶液；阳性对照为经DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白免疫获得的阳性血清 (OD_650nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤；阴性对照为经筛选获得的阴性血清 (OD_650nm≤0.25)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤。

上述通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒使用方法：将待检血清用样品稀释液 作1：200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育45min； 弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL 的酶结合物工作液，37℃孵育45min；洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；依次加入100μL 显色液，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪在650nm波长下测定各孔吸光度A 值，读值计算并判定结果。其检测样本的判定标准为：以待检样本OD_650nm值与阴性对照 OD_650nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD_650nm值大于0.381判为阳性。

本发明具有下列优点：

1.本发明建立的通用型鸭甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒，一次检测即可对 DHAV-1和DHAV-3两种抗体水平作出评价，较DHAV-1和DHAV-3分别检测时成本大大降 低。该试剂盒操作简便、快速，适合批量样品的检测，大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。

2.本发明以基因工程表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白为基础制备而成，重组蛋白为非 全病毒抗原，安全性好，不含无关杂蛋白，只与DHAV-1和DHAV-3阳性血清特异结合，不 与其它病毒的阳性血清发生交叉反应，具有良好的抗原性，因此所发明的检测试剂盒具有很 高的特异性和敏感性。

附图说明

图1是DHAV-1VP3基因扩增的电泳图片，其中M：DNA Marker DL2000，1：DHAV-1VP3 基因。

图2是DHAV-3VP1基因扩增的电泳图片，其中M：DNA Marker DL2000，1：DHAV-3VP1 基因。

图3是DHAV-1VP3基因克隆到pMD18-T载体得到的重组质粒pMD-1VP3的酶切鉴定图 片，其中M1：DNA Marker DL15000，M2：DNA Marker DL2000，1：重组质粒pMD-1VP3 的酶切片段。

图4是DHAV-3VP1基因克隆到pMD18-T载体得到的重组质粒pMD-3VP1的酶切鉴定图 片，其中M1：DNA Marker DL15000，M2：DNA Marker DL2000，1：重组质粒pMD-3VP1 的酶切片段。

图5是DHAV-1VP3与DHAV-3VP1基因串联插入到pET-32a(+)载体得到的重组质粒 pET-1VP3-3VP1的酶切鉴定图片，其中M1：DNA Marker DL15000，M2：DNA Marker DL2000， 1：重组质粒pET-1VP3-3VP1的酶切片段。

图6是诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析图片，其中M：蛋白Marker，1～4重组质粒 pET-1VP3-3VP1分别诱导表达2h，3h，4h，5h的上清，5～8：重组质粒pET-1VP3-3VP1分别 诱导表达2h，3h，4h，5h的沉淀。

图7是DHAV-1VP3-3VP1表达产物与DHAV-1阳性血清反应的Western blotting分析图片， 其中M：预染蛋白Marker，1：诱导表达蛋白。

图8是DHAV-1VP3-3VP1表达产物与DHAV-3阳性血清反应的Western blotting分析图片， 其中M：预染蛋白Marker，1：诱导表达蛋白。

图9是重组蛋白的纯化图片，其中M：蛋白Marker，1：纯化的重组蛋白，2：未纯化的 重组蛋白。

具体实施方式

1.DHAV-1VP3基因和DHAV-3VP1基因的扩增与表达载体的构建

根据GenBank中已登录的DHAV-1VP3基因序列(SEQ-1)和DHAV-3VP1基因序列 (SEQ-2)，设计两对引物：P1上游引物：5'-AAGGGATCCGGAAAGAGAAARCCACG-3' (SEQ-5)；P1下游引物：5'-ATCGTCGACCTGATYATTGGTTGCCAT-3'(SEQ-6)。P2上游引 物：5'-ATTGTCGACGGTGATTCCAATCAGCTTG-3'(SEQ-7)；P2下游引物：5' -AGTCTCGAGTTCAATYTCCARATGGAG-3'(SEQ-8)。利用Trizol试剂分别提取DHAV-1 和DHAV-3RNA模板，利用P1和P2引物对分别进行RT-PCR反应。RT反应体系(20μL)： 25mmol/L Mg²⁺1.2μL、10mmol/L dNTP2.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、下游引物1.0μL、RNA 酶抑制剂0.5μL、RNA模板10.3μL。置于PCR扩增仪进行反应，反转录酶1μL于42℃时加 入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。PCR反应体系(50μL)：ddH₂O38.1μL、 10×缓冲液4.0μL、25mmol/L Mg²⁺1.4μL、5U/μL rTaqDNA聚合酶0.5μL、上游引物1.0μL、RT 产物5.0μL。置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃5min预变性；94℃变性30sec、50℃ 退火30sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。PCR产物在1％ 琼脂糖凝胶中电泳，以确定产物大小(如图1和图2所示)。

将扩增出的DHAV-1VP3基因克隆至pMD18-T载体中，经BamH I和Sal I双酶切鉴定、 测序正确的阳性克隆命名为pMD-1VP3(如图3所示)。将扩增出的DHAV-3VP1基因克隆至 pMD18-T载体中，经Sal I和Xhol I双酶切鉴定、测序正确的阳性克隆命名为pMD-3VP1(如 图4所示)。以BamH I和Sal I同时对重组质粒pMD-1VP3和pET-32a(+)载体进行酶切，回收 目的片段，16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经BamH I和Sal I双酶切鉴 定正确后获得阳性重组质粒pET-1VP3。以Sal I和Xhol I同时对重组质粒pMD-3VP1和 pET-1VP3进行酶切，回收目的片段，16℃连接过夜，转化BL21(DE3)感受态细胞，提取质 粒，经Sal I和Xhol I双酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-1VP3-3VP1(如图5所示)。

2.重组表达质粒的诱导表达

将获得的阳性重组表达质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入IPTG至 终浓度为0.8mmol/L，进行诱导表达。收集不同诱导时间表达的菌体，超声波破碎，离心后 分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，并对表达产物进行Western blotting分析，一抗分别 用鸡抗DHAV-1和DHAV-3阳性血清，二抗用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG，DAB 显色。结果表明重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，分子量约为74ku，与预期结果 相符，以诱导后5h表达量最大(如图6所示)。Western blotting分析发现，表达的重组蛋白能 够与DHAV-1和DHAV-3阳性血清进行反应，具有良好的免疫学活性(如图7和图8所示)。

3.重组蛋白的纯化

选用KCL显色法：将破碎好的重组菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，先用 双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCL溶液中显色5-10min，最后用双蒸水洗 涤。将目的蛋白条带切下，PBS洗涤3次，用玻璃棒将其捣细，反复冻融3次，8000r/min离 心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。结果只有一条74ku的目的蛋白条带， 表明KCL显色法获得了较纯的目的蛋白(如图9所示)。

4.样品稀释液、洗涤液、终止液的配制

样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄0.2g， NaHPO₄·12H₂O2.9g，NaCl8g，定容至1000mL，再加0.5mL吐温-20)；10×浓缩洗涤液为含 0.5％吐温-20的0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄2g，NaHPO₄·12H₂O29g，NaCl80g，定 容至1000mL，再加5mL吐温-20)；终止液为0.31％氢氟酸溶液(取氢氟酸0.31ml，双蒸水 定容至100mL)。

5.阳性对照和阴性对照的制备

将DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白免疫获得的阳性血清用样品稀释液作1:200稀释 (OD_650nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为通用型甲型肝炎病毒抗体间接 ELISA检测试剂盒中的阳性对照；将筛选获得的阴性血清(OD_650nm≤0.25)，加入1000U/mL 的青链霉素，无菌过滤，作为通用型甲型肝炎病毒抗体间接ELISA检测试剂盒中的阴性对照。

6.显色液的配制

显色液：称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双 蒸水定容至1000mL；称取21g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，28.2g无水磷酸氢二钠(Na₂HPO4)， 6.4mL0.75％过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调pH值4.5～5.0；二者的体积比为1：1。

7.检测DHAV-1和DHAV-3抗体的间接ELISA反应条件的确定

抗原和血清最佳工作浓度的确定：采用方阵试验确定。用包被缓冲液将DHAV-1VP3-3VP1 重组蛋白作1:10，1:20，1:40，1:80等系列稀释，包被ELISA反应板，100μL/孔；抗DHAV-1 和DHAV-3的阳性血清和阴性血清用样品稀释液分别作1:50，1:100，1:200，1:400，1:800， 1:1600，1:3200等系列稀释；进行间接ELISA测定；显色液显色，终止液终止反应；测定光 波长650nm的OD值。取阳性血清OD_650nm1.0左右，阴性血清OD_650nm0.3左右，且阳性血清 OD_650nm/阴性血清OD_650nm即P/N值大于2.1的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度，结果 如表1所示，结果表明血清最佳稀释度为1:200，抗原最佳浓度10μg/mL。

表1抗原和血清最佳工作浓度的确定(OD_450nm值)

8.结果判定标准

将收集的30份无DHAV-1和DHAV-3抗体的鸭血清，在最佳工作条件下进行间接ELISA 测定，以确定鸭血清在无DHAV-1和DHAV-3感染时其吸收值范围 ，因此确定以待检样本OD_650nm值与阴性OD_650nm值的比值 (P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD_650nm值大于0.381判为阳性。

9.通用型鸭甲型肝炎病毒抗体检测ELISA板的制备

用pH8.5的0.05M Tris-HCL缓冲液作包被液，将DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白稀释为 10μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2小时，4℃包被过夜，拍干，用1％ 牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加 入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中备用。

10.ELISA操作程序的确定

按以上确定的优化条件进行操作，即得到本方法的最佳操作程序：

将待检血清用样品稀释液作1:200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对 照、阳性对照，37℃孵育45min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次， 每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；洗涤3～5次，每 次间隔1min，拍干；加入100μL显色液，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪 在650nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。

实施例：

一、通用型鸭甲肝病毒抗体ELISA检测试剂盒，包括以下组分：

1)ELISA板条(96孔)：5块

2)10×浓缩洗涤液：400mL(用前1：10稀释)

3)样品稀释液：200mL

4)羊抗鸭酶标二抗(酶结合物工作液)：50mL

5)显色液：100mL

6)终止液：60mL

7)阳性血清对照(+)：2mL

8)阴性血清对照(-)：2mL

二、操作步骤：

1、将待检血清用样品稀释液作1:200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性 血清对照、阳性血清对照，37℃孵育45min；

2、弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液350μL，洗涤3～5次，每次间隔1min，拍干；

3、每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育45min；

4、重复步骤2；

5、加入100μL显色液，37℃避光孵育15min；

6、加50μL终止液，用酶标仪在650nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结 果。

三、应用

1、特异性试验

1.1交叉试验：用DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA检测试剂盒分别检测鸭瘟、 鸭呼肠孤病毒病、鸭新城疫、鸭流感、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型等阳性血清及阴性 血清，每样本4个重复，进行交叉反应性测定，检测结果显示鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒 3型阳性血清均为阳性结果，其余均为阴性，表明该检测试剂盒与鸭瘟、鸭呼肠孤病毒病、 鸭新城疫及鸭流感等无交叉反应；

1.2阻抑试验：将DHAV-1VP3-3VP1阳性血清分别与等体积的DHAV-1(200TCID₅₀/0.2ml) 和DHAV-3(200TCID₅₀/0.2ml)以及鸭瘟病毒(200TCID₅₀/0.2ml)混合，室温作用30min， 将处理后的血清与未作任何处理的血清分别按最佳反应条件进行阻抑试验测定，结果表明 DHAV-1VP3-3VP1阳性血清只能被DHAV-1和DHAV-3特异性阻抑，而不能被鸭瘟病毒阻抑。

2、敏感性试验

DHAV-1和DHAV-3阳性血清各5份分别从1：2开始倍比稀释，其余条件按最佳反应条 件进行ELISA检测，分别用DHAV-1和DHAV-3病毒中和试验(VN)对其终点滴度进行测 定。结果表明，ELISA检测试剂盒的敏感性要明显高于中和试验(如表2和表3所示)，ELISA 试剂盒与DHAV-1和DHAV-3中和试验的相关系数分别为0.993和0.984。

表2敏感性试验(DHAV-1阳性血清)

表3敏感性试验(DHAV-3阳性血清)

3、重复性试验

用两次包被的酶标板，检测5份DHAV-1阳性血清、5份DHAV-3阳性血清和5份阴性血 清，每个样品重复检测5次，测定其变异系数CV％(CV＝S.D./X×100％，S.D.：标准差，X： 算术平均值)。结果表明变异系数最大为5.42％，最小为1.2％。15份血清变异系数都较小， 具有较好的重复性。

4、临床应用

临床应用检验的样品为试验样品和部分送检样品。先用血清中和试验进行检测，区分 DHAV-1和DHAV-3阳性血清和共同阴性血清，再用通用型ELISA检测试剂盒进行检测，比 较两种方法的符合率。其中中和试验检出DHAV-1阳性血清30份，阳性检出率为55.56％， ELISA检测试剂盒检出DHAV-1阳性血清为32份，阳性检出率为59.26％，两种方法的符合 率为96.3％；中和试验检出DHAV-3阳性血清38份，阳性检出率为61.29％，ELISA检测试 剂盒检出DHAV-3阳性血清为41份，阳性检出率为66.13％，两种方法的符合率为96.77％(如 表4所示)。

表4ELISA检测试剂盒与中和试验比较

注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％