一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微方法与装置

摘要

本发明公开了一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微方法，包括步骤：1)将脉冲化的激光光束准直后转换为线偏振光，再对线偏振光进行偏振调制得到径向偏振光；2)将径向偏振光转换为圆偏振光投射到待测样品上，进行双光子激发，收集荧光得到第一信号光强I1；3)对步骤1)中得到的线偏振光进行偏振调制，转换为切向偏振光；4)将切向偏振光转换为圆偏振光投射到待测样品上，进行双光子激发，收集荧光得到第二信号光强I2；5)根据公式I＝I1-γI2计算有效信号光强I，实现超分辨率成像。本发明还公开了一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微装置。本发明装置简单，无需分光，使用较低的光功率，减弱光漂白效应，更高的分辨率和更大的成像深度。

说明书

技术领域

本发明涉及超分辨领域，尤其涉及一种能在远场超越衍射极限、实现 超分辨率的双光子荧光受激发射微分超分辨率显微方法与装置。

背景技术

传统的远场光学显微方法因为光学衍射极限的存在，所能达到的分辨 率也是有极限的，这个极限由阿贝衍射极限理论确定。光束经过显微物镜 聚焦后，在焦平面上形成一个模糊的光斑，光学显微镜的分辨率就定义为 可以分辨出来的两个同等亮度的光斑的最小距离。因此光斑的尺寸决定了 显微镜的极限分辨率。光斑的尺寸用半高全宽(FWHM:Full Width at Half Maximum)表示为其中λ是照明光的波长，NA是显微镜物 镜的数值孔径。因此，传统的远场光学显微方法的极限分辨率就是一般在半波长左右。

为了克服光学衍射极限的限制，获取更高分辨率的光学显微图像，科 研工作者提出了多种超分辨显微方法，包括基于单分子高精度成像的光激 活定位显微技术(PALM:Photoactivated Localization Microscopy)和随机 光场重建显微技术(STORM:Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)， 以及通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的受激发射损耗显微 技术(STED:Stimulated Emission Depletion Microscopy)和结构光照明荧 光显微技术(SIM:Structured Illumination Microscopy)等。

除此之外，最近提出的一种超分辨率显微方法FED(FED:Fluorescence Emission Difference Microscopy)，如在公开号为CN102735617A的专利中 公开了一种超分辨显微方法，包括：将激光器发出的激光光束准直后转换 为线偏振光；线偏振光经第一次相位调制后进行光路偏转；偏转后的光束 经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，收集待测样品各扫描 点发出的信号光，得到第一信号光强；切换调制函数，对线偏振光进行第 二次相位调制后投射到待测样品上，收集待测样品各扫描点发出的信号光， 得到第二信号光强；计算有效信号光强，并得到超分辨图像。

在上述的专利中，光学显微镜分辨能力不足是因为受光学衍射极限的 限制。平行的照明光束聚焦在焦平面上形成一个有一定面积的弥散的光斑， 而不是理想的一个点。荧光样品上被弥散斑照亮的区域均会受激发射出荧 光，荧光反向通过显微物镜和扫描振镜系统，经探测系统收集，此过程同 样受光学衍射极限的限制。平行的照明光束聚焦形成的弥散斑尺寸一般为 一个艾里斑大小，根据瑞丽判据，被弥散斑照亮的区域内，样品的细节无 法被分辨，因此限制了光学显微镜的分辨能力。另外，除了分辨率，显微 镜的成像深度也是衡量显微镜成像质量的关键指标。传统的荧光光学显微 镜采用单光子激发方式，使用短波长激发光激发荧光，样品对短波长激发 光的散射作用较强，激发光光强随深度增大成指数衰减，因此限制了显微 镜的成像深度。

发明内容

本发明提供了一种双光子荧光受激发射微分超分辨率方法，是针对已 提出的FED显微方法的一种更优化的超分辨率显微技术，可以在远场实现 超衍射极限的分辨率。

一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微方法，包括以下步骤：

1)将脉冲化的激光光束准直后转换为线偏振光，再对线偏振光进行 偏振调制得到径向偏振光；

2)将所述的径向偏振光转换为圆偏振光投射到待测样品上，对待测 样品进行双光子激发，收集激发的荧光得到第一信号光强I₁；

3)对步骤1)中得到的线偏振光进行偏振调制，转换为切向偏振光；

4)将所述的切向偏振光转换为圆偏振光投射到待测样品上，对待测 样品进行双光子激发，收集激发的荧光得到第二信号光强I₂；

5)根据公式I＝I₁-γI₂计算有效信号光强I，实现超分辨率成 像。

在步骤5)中，当所述的有效信号光强I为负值时，设置I＝0。

若对待测的荧光样品进行扫描，在步骤2)中，对待测样品进行二维 扫描，在二维扫描过程中收集各扫描点发出的信号光，得到信号光强I₁(x,y)， 其中(x,y)为扫描点的二维坐标；在步骤4)中，对待测样品进行二维扫描， 在二维扫描过程中收集各扫描点发出的信号光，得到信号光强I₂(x,y)，其 中(x,y)为扫描点的二维坐标；在步骤5)中，根据公式 I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算有效信号光强I(x,y)，其中，为 信号光强I₁(x,y)中的最大值，为信号光强I₂(x,y)中的最大值。

在本方法中，以飞秒脉冲激光器作为脉冲化的激光光束的光源，这时 所用的激发光源强度高，光子密度满足荧光分子同时吸收两个光子的要求， 形成双光子激发。传统的激光器强度较低，无法满足双光子激发所要求的 高光子密度，不能激发出双光子荧光。然而高功率、高强度的激光又极易 引起光漂白和光中毒(尽管双光子激发采用红外或近红外波段的激发光， 能一定程度的减弱光毒性)。为解决以上两点问题，高功率飞秒脉冲激光 器是最佳的选择。高功率飞秒脉冲激光器具有很高的峰值能量，能够达到 双光子激发的光子密度要求，同时具有很窄的脉冲宽度(飞秒级)，平均 能量很低，可以有效降低光漂白和光中毒的发生概率。

在步骤1)和步骤3)中，进行偏振调制所采集用的光学元件为液晶 偏振转换器。本发明所采用的液晶偏振转换器采用电控方式，即可以通过 改变输入电压值来控制其对入射光偏振状态的调制，这样可以带来以下几 点好处。一是无需分光，使光路变得更简单，更易搭建与调试；二是可以 实现快速切换输出光的偏振态，提高系统的成像速度；三是经由此液晶偏 振转换器调制形成的径向偏振光聚焦后形成的空心光斑的暗斑尺寸更小， 能一定程度的提高成像的分辨率。

同时，本发明还提供了一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微装 置，结构简单、分辨率更高、成像深度更大、成像速度快，可以很好的应 用于荧光样品的观测中。

一种双光子荧光受激发射微分超分辨率显微装置，包括用于产生脉冲 化的激光光束的光源和将光线投射到样品台的显微物镜，所述光源和显微 物镜之间依次设有：

用于将所述光源发出的激光光束转换为线偏振光的起偏器，

用于将所述线偏振光转换为径向偏振光或切向偏振光的光学元件，

和用于将径向偏振光或切向偏振光转换为圆偏振光的1/4波片，所述 圆偏振光通过显微物镜投射到样品台上的待测样品；

还包括用于收集所述待测样品发出荧光的信号光探测系统。

所述的光源为飞秒脉冲激光器，所述的光学元件为液晶偏振转换器。

在本发明的装置中，还包括用于对所述径向偏振光和切向偏振光进行 光路偏转的扫描振镜系统，所述的液晶偏振转换器和扫描振镜系统均受控 于一控制器。

所述的信号光探测系统包括沿光路依次布置的分束镜、带通滤波片、 聚焦透镜、小孔和探测器；

所述的分束镜布置在1/4波片和扫描振镜系统之间；

所述的带通滤波片用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光；

所述的聚焦透镜用于将透过带通滤波片的信号光聚焦至探测器；

所述的小孔位于聚焦透镜的焦平面处，用于对信号光进行空间滤波。

其中，显微物镜的数值孔径是NA＝1.4，分束镜选用二色镜，探测器 选用光电倍增管(PMT)，所用小孔15的直径为0.73个艾里斑。小孔大 小的选取需要在图像分辨率和信噪比两者间进行权衡。小孔过大，空间滤 波能力减弱，无法滤去焦外光强(接近宽场成像)，图像分辨率劣化，但 收集到的总信号光增多，信噪比提高；小孔过小，空间滤波能力增强，更 多的焦外光被滤去，图像的分辨率提高，但收集到的总信号光减少，信噪 比降低。小孔大小选择0.73个艾里斑，能实现空间滤波，也不会挡掉太多 的信号光，能同时保证较高的分辨率和信噪比。

本发明的原理如下：

本发明结合了双光子荧光激发方式和荧光受激发射超分辨显微术来 同时实现超分辨和增大成像深度。双光子荧光激发方式不同于单光子激发 方式，单光子激发中电子吸收一个光子跃迁到激发态，然后自发辐射出荧 光，双光子激发中电子吸收两个光子跃迁到激发态，然后自发辐射出荧光。 因此比较单光子激发和双光子激发，如果激发出的荧光波长相同，双光子 激发要求的单个光子的能量较低，可使用波长较长的激发光，减弱样品对 激发光的散射作用，增大成像深度。另外，双光子荧光激发需要很高的光 子密度，因此激发过程只在光子密度高的地方发生，比如聚焦点处，而在 光子密度低的地方，即焦外，发生概率较低，这样焦平面外的荧光分子没 有被激发，使得更多的激发光能够穿透更深的样品，到达焦平面。因此， 相比较于常规的FED显微术，本发明能实现更大深度的成像。除此之外， 因为双光子荧光激发方式可以在一定程度上抑制焦外荧光分子的激发，所 以能够降低噪声，提高图像的信噪比。

在本发明中，当线偏振光被调制成径向偏振光时，调制后光束经显微 物镜聚焦后在样品上形成的光斑是一个实心光斑。该实心光斑照亮的样品 区域所激发出的荧光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强 I₁。当线偏振光被调制成切向偏振光时，调制后光束经显微物镜聚焦后在 样品上形成的光斑是一个面包圈形状的空心光斑。该空心光斑照亮的样品 区域所激发出的荧光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强 I₂。对于同一扫描点探测得到的I₁和I₂，利用公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计 算得到I(x,y)。实心光斑减去空心光斑，只保留了中心区域的信号光，相 当于缩小了实心光斑的尺寸，因此I(x,y)所对应的扫描点处的有效信号光 发光面积将小于I₁(x,y)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。另外， 采用聚焦径向偏振光产生的实心光斑尺寸小于通过传统方法产生的实心 光斑，而且，相比于使用0-2π涡旋位相板或是空间光调试器产生的空心 光斑，采用聚焦切向偏振光形成的空心光斑的暗斑尺寸更小，因此，能够 进一步缩小扫描点处的有效信号光发光面积，提高分辨率。所以，相比于 常规的FED显微术，本发明可以在一定程度上进一步提高其分辨率。

相对于现有的技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)使用较低的光功率，减弱光漂白效应；

(2)更高的分辨率和更大的成像深度；

(3)装置简单，无需分光。

附图说明

图1为本发明双光子荧光受激发射微分超分辨显微装置的示意图。

图2为本发明中所成实心光斑和常规FED所成实心光斑的归一化光 强分布曲线。

图3为本发明中所成面包圈型空心光斑和常规FED所成面包圈型空 心光斑的归一化光强分布曲线。

图4为本发明中有效信号光光斑和常规FED中信号光光斑的归一化 光强分布比较曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，荧光受激发射微分超分辨显微装置，包括：飞秒脉冲激 光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，液晶偏振转换器5，二向色 镜6，扫描振镜系统7，扫描透镜8，场景9，1/4波片10，显微物镜11， 样品台12，滤光片13，聚焦透镜14，小孔15，探测器16，控制器17。

单模光纤2、准直透镜3、起偏器4、液晶偏振转换器5、二向色镜6 依次位于飞秒脉冲激光器1出射光束的光轴之上，且起偏器4的透光轴与 竖直方向平行，扫描振镜系统7位于经二向色镜6反射后光束的光轴上。

扫描透镜8、场镜9、1/4波片10、显微物镜11、样品台12依次位于 扫描振镜系统7出射光束的光轴之上，样品台12位于显微物镜11的焦平 面附近。

滤光片13，聚焦透镜14，小孔15，探测器16依次位于分束镜6反射 光束的光轴之上，小孔15位于聚焦透镜14的焦平面处。

其中，控制器17分别与液晶偏振转换器5和扫描振镜系统7连接， 用于控制液晶偏振转换器5的切换，以及扫描振镜系统7的扫描；液晶偏 振转换器在控制器17的控制下将线偏振光调制成径向偏振光或切向偏振 光，并按一定的切换频率使调制光在两种偏振态之间切换；液晶偏振转换 器5的切换频率与扫描振镜系统7的帧扫描频率相同，从而实现扫描振镜 系统7每扫描一帧图像，液晶偏振转换器5的调制光偏振态切换一次。

其中，显微物镜11的数值孔径NA为1.4；所用小孔15的直径为0.73 个艾里斑；所用探测器16为光电倍增管(PMT)。

采用图1所示的装置进行双光子荧光受激发射微分超分辨率显微的方 法如下：

因为双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤样品，激光器使用 高功率飞秒脉冲激光器，这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很 低的平均能量，其脉冲宽度为100飞秒，其周期可以达到80至100兆赫。 飞秒脉冲激光器1发出的激光光束首先耦合入单模光纤2，然后从单模光 纤2中出射后经准直透镜3准直。起偏器4将准直后的光束转换为线偏振 光，线偏振光经过液晶偏振转换器5被调制为径向偏振光或切向偏振光。 控制器17通过控制加载在液晶偏振转换器5上的电压来控制调制光的偏 振态。

利用控制器17对液晶偏振转换器5进行控制，使调制光为径向偏振 光。调制光从液晶偏振转换器5中出射，经二向色镜6反射后进入扫描振 镜系统7。光束从扫描振镜系统7中出射后，依次被扫描透镜8聚焦、场 镜9准直，之后通过1/4波片10转换为圆偏振光，圆偏振光束经显微物镜 11投射到位于样品台12上的待测样品之上。当调制光为径向偏振光时， 聚焦光斑为实心光斑。本发明中所成实心光斑和常规FED所成实心光斑 的归一化光强分布曲线如图2所示。

待测样品被激发出的荧光被显微物镜11收集，然后反向通过1/4波片 10、场镜9、扫描透镜8、扫描振镜系统7，经二向色镜6透射、滤光片 13滤光、聚焦透镜14聚焦、小孔15空间滤波后，最后被探测器16收集。 记此时探测器16探测得到的信号光强值为，将其作为在当前扫描点处的 第一信号光强。扫描振镜系统7能够实现对待测样品的二维扫描，各扫描 点的第一信号光强记录为I₁(x,y)，其中x,y是待测样品面上扫描点的坐标。

利用控制器17对液晶偏振转换器5进行控制，使调制光为切向偏振 光。调制光从液晶偏振转换器5中出射，经二向色镜6反射后进入扫描振 镜系统7。光束从扫描振镜系统7中出射后，依次被扫描透镜8聚焦、场 镜9准直，之后通过1/4波片10转换为圆偏振光，圆偏振光束经显微物镜 11投射到位于样品台12上的待测样品之上。当调制光为切向偏振光时， 聚焦光斑为面包圈形的空心光斑。本发明中所成面包圈型空心光斑和常规 FED所成面包圈型空心光斑的归一化光强分布曲线如图3所示。

待测样品被激发出的荧光被显微物镜11收集，然后反向通过1/4波片 10、场镜9、扫描透镜8、扫描振镜系统7，经二向色镜6透射、滤光片 13滤光、聚焦透镜14聚焦、小孔15空间滤波后，最后被探测器16收集。 记此时探测器16探测得到的信号光强值为，将其作为在当前扫描点处的 第二信号光强。扫描振镜系统7能够实现对待测样品的二维扫描，各扫描 点的第一信号光强记录为I₂(x,y)，其中x,y是待测样品面上扫描点的坐标。

最后，利用公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)，可以计算得到各个扫描点处 的有效信号光强I(x,y)，实现超分辨率成像。本发明中有效信号光光斑和 常规FED中信号光光斑的归一化光强分布曲线如图4所示。由图4可以 看出，本发明中有效信号光的光斑尺寸较常规FED显微方法中信号光光 斑尺寸有所减小，因此本发明方法可以进一步提高FED显微术的分辨能 力。

本发明双光子荧光受激发射微分超分辨率显微装置也可以采用非电 控液晶偏振转换片来实现。具体装置与图1类似，只是在液晶偏振转换片 前要增加一块1/2波片，用以调节出射光的偏振态。该液晶偏振转换片有 一个主轴，如果入射线偏光偏振方向与主轴方向一致，则出射光为径向偏 振光，如果入射线偏光偏振方向与主轴方向垂直，则出射光为切向偏振光。 转动1/2波片，可调节入射光的偏振方向，从而调节出射光的偏振态，实 现两种照明模式的切换。但与之前的液晶偏振转换器5不同，该液晶偏振 转换片不是电控的，只能手动调节1/2波片来调节出射光的偏振态，因此 会限制两种模式之间的切换速度，减慢成像速度，而且手动调节会引入误 差，影响成像效果。