防治植物真菌病害的生防菌株G58及其菌剂制备方法和应用

摘要

本发明公开了防治植物真菌病害的生防菌G58及其菌剂制备方法和应用。该生防菌命名为BacillusamyloliquefaciensG58，保藏号CGMCCNO.8977；该生防菌菌剂的制备方法为将活化后的菌株G58接种于NA培养液培养22～26h获得种子液，将种子液接种于发酵培养基培养48～72h获得发酵液，即为生防菌菌剂；含菌株G58的生防菌剂对于水稻纹枯病表现出显著的防治效果，防效可达73.6%。菌株G58具有抗菌谱广，定植能力强，效果稳定，制备成本低，应用方法简单，环境友好，无毒害等特点，在植物真菌病害防治方面具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及防治植物真菌病害的生防菌株G58及其菌剂制备方法和应用。

背景技术

据联合国粮农组织（FAO）统计，每年由于粮食、蔬菜等作物病害问题引起的作物损失至少有10%~15%，而其中70%~80%的植物病害均是由真菌引起的。一种作物上可发现几种甚至几十种真菌病害。许多病原真菌形成特殊的组织或孢子可耐受环境的变化，经历严寒和酷暑。真菌在田间主要通过气流、水流传播；此外，风、雨、昆虫也可传播真菌病害。因此，病原真菌较难控制，容易广泛传播。由于真菌性病害的特点和传播途径，目前一般多采用化学药剂进行保护性防治，或通过改进栽培管理措施加以防治。

化学防治方法简单，效果显著。然而化学农药的长期使用已经带了一系列严重的负面影响。出现了土壤和农产品中大量农药残留，农产品安全质量下降；土壤中大量有益微生物被杀死，产生了抗药性病原微生物，病害防治更加困难等问题。目前农业的可持续发展和农产品安全问题备受关注，这就要生产者在利用土地环境资源的同时要保护和改善环境；保证农产品产量的同时更要关注农产品的质量和安全。植物病害的生物防治是由英国植物病害学家Garrett于1965年提出的。生物防治是以生态学为基础防治植物病害。可以避免化学防治带来的一系列植保、环境等问题。减少了化学农药的残留，提高了农产品安全性，促进了农业的可持续发展。芽孢杆菌是目前生物防治中应用最为广泛的微生物。芽孢杆菌可以通过竞争机制，分泌抗菌物质，溶菌作用以及诱导抗性等机制产生抗病作用。芽孢杆菌中研究最为透彻的是枯草芽孢杆菌，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究始终是国内外研究的热点。而近年来解淀粉芽孢杆菌也被报到具有抗病、促生等作用，因此解淀粉芽孢杆菌在生物防治方面也受到越来越多的关注。

水稻纹枯病是由真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKuhn)引起的水稻最主要的病害之一。水稻纹枯病以其常发性和对水稻产量造成的巨大损失而越来越受到重视，长江以南许多省份已将其列为水稻生产上的第一大病害。该病一般减产10%~30%，严重时可达50%。考虑到健康和环境因素，欧盟已于2002年禁止使用井冈霉素。因此, 为了提高综防效益，很有必要探索新的针对水稻纹枯病的防治策略。利用生防菌是水稻纹枯病防治的重要途径，具有广泛的应用前景。

发明内容

为了解决上述问题，植物病害多发，防治困难，成本较高，化学农药残留严重，土壤微生物区系被破坏，农作物安全等问题，本发明提供了效果稳定、定植能力强，抗菌谱广，无环境污染的防治植物病害的生防菌株G58。

本发明的目的在于提供一株新菌种：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）G58。

本发明的另一个目的在于提供上述菌株在植物病害防治过程中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种含有Bacillus amyloliquefaciensG58的植物病害防治剂。

本发明的再一个目的在于提供生防菌株Bacillus amyloliquefaciensG58菌剂的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种植物真菌病害生防菌株G58，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，2014年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.8977，建议的分类命名为Bacillus amyloliquefaciensG58，已于2014年3月28日鉴定保藏的菌株是存活的。

上述生防菌株Bacillus amyloliquefaciensG58在植物病害防治过程中的应用。

进一步的，上述植物病害为植物真菌病害。

一种植物病害防治剂，其含有上述的植物真菌病害生防菌株Bacillus amyloliquefaciensG58。

生防菌株Bacillus amyloliquefaciensG58菌剂的制备方法，包括以下步骤：将生防菌株G58接种于NA平板在29～31℃条件下活化，将活化后的生防菌株G58接种于NA培养液，29～31℃，105～115 rpm条件下培养22～26h，获得种子液；将种子液按1%~3%的接种量接种于发酵培养基，30～37℃，150~180rpm条件下培养48～72 h，获得发酵液，即生防菌株Bacillus amyloliquefaciensG58菌剂。

进一步的，上述发酵培养基配方含有0.8~1.2g/L蔗糖、8~12 g/L酵母粉、0.6~1 g/L KCl，pH为5~6。

本发明的有益效果是：

1）本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株G58菌剂制备过程简单，成本较低，无毒害，无环境污染，可替代或减少对化学农药的应用，减少农药残留，定植能力强，改善土壤微生物环境，提高农产品安全性。

2）本发明的生防菌株G58在试验室平板拮抗试验中表现出良好的竞争抑制效果，极大程度的抑制了植物真菌病原菌生长。竞争抑制可以避免因抑菌物质的分解带来抑菌效果下降或消失的问题。同时，该菌也可产生抑菌物质抑制植物真菌病原菌的生长。

3）本发明的生防菌株G58在温室试验结果中表明：含本发明所述的生防菌株G58的生防菌剂有效抑制了真菌病原菌的生长，对于水稻纹枯病表现出显著的防治效果，防效可达73.6%。

附图说明

图1为生防菌株G58抑制水稻纹枯病（Rhizoctonia solani）平板拮抗试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

一、生防菌株G58的分离、筛选和鉴定

一种植物真菌病害生防菌株G58，命名为Bacillus amyloliquefaciensG58，由广东省增城市附近水稻田土壤分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下：

（1）生防菌株G58的分离

称取10.0 g混合均匀的土壤样品，加入90 ml无菌水，于30 °C，180 rpm下，振荡30 min，制成10^-1菌悬液，再稀释成梯度为10^-2～10^-6的菌悬液，吸取适当梯度的菌悬液100 μl均匀涂布在营养琼脂(10^-5、10^-6)平板上，每个稀释度重复三次，于30 °C恒温培养箱中培养1～2 d。按照细菌形状，大小，色泽等生理性状的不同，挑取单菌落再涂平板直到获得单一形态的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态，确为单一形态即为纯化，纯化后4 °C冷藏备用。

（2）生防菌株G58的筛选

采用平板拮抗试验方法进行生防菌株的筛选。

吸取浓度为1×10⁵CFU/ml的植物真菌病原菌菌液100 μl放入 PDA平板中涂布均匀，利用无菌打孔器在平板上打3个孔，每孔中分别注入在30 °C培养24h的不同分离菌株的培养液50μl，每个处理重复三次。30 °C恒温培养箱中培养3~5 d后，观察有无抑菌圈，计算抑菌活性。

抑菌活性用抑菌圈直径表示：抑菌圈直径=透明圈直径－孔径(8 mm)。

将具有抑菌活性的菌株在NA平板上连续转接培养10次(每隔7 d一次)，测定每次继代培养菌株的拮抗效果。

根据对水稻纹枯病、柑橘炭疽病、辣椒炭疽病、玉米炭疽病、番茄叶霉病、小麦赤霉病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黄萎病、油菜菌核病等的抑菌活性以及传代后抑菌活性的稳定性，筛选出一株效果稳定的广谱抗植物真菌病害菌株，将菌株纯化后，用50%的甘油保存于-70℃超低温冰箱。

(3) 生防菌株G58的鉴定

经形态、染色、生理生化反应及分子生物学鉴定为Bacillus amyloliquefaciens，命名为G58。

a.防治植物真菌病害的解淀粉芽孢杆菌G58的形态特征

观察经NA平板划线培养24h后形成的单菌落形态特征可知，GB58菌落形态较小、边缘不整齐、表面无凸起、干燥、不透明，呈乳白色。液体静止培养时有菌膜形成。通过革兰氏染色、芽孢及鞭毛染色，在显微镜下观察，细胞呈短杆状、革兰氏阳性菌、中生芽孢、周生鞭毛。

b. 本发明的防治植物真菌病害的解淀粉芽孢杆菌G58生理生化特征（见表1）

需氧性，葡萄糖发酵型，接触酶、淀粉水解、硝酸盐还原、酪朊水解、明胶水解、糖醇类发酵、M.R.和V-P试验结果为阳性；柠檬酸盐水解、纤维素分解和酪氨酸水解试验结果为阴性。

表 1 生防菌株G58的生理生化特征

注：“+”阳性，“-”阴性。

c. 生防菌株G58的分子生物学鉴定

采用Fast DNA kit 提取细菌基因组DNA，利用16srRNA的通用引物进行测序。所用引物序列为：8F(5'-AGAGTTTGA TCATGG CTCAG-3')和907R(5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT -3')从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物委托Cornell大学测序中心测定，测序结果提交到GenBank数据库获得登录号KJ801304，利用Blast程序搜索同源序列，结果与登录号为 的 NC009725 Bacillus amyloliquefaciens FZB42同源性为99%，因此，结合菌落形态和生理生化特征，生防菌株G58鉴定为Bacillus amyloliquefaciens。

二、生防菌株G58菌剂的制备

将保存于NA斜面培养基的所述生防菌株G58，接种于NA平板活化，将活化后的生防菌株G58接种于NA培养液，30℃，110 rpm条件下培养24 h，获得种子液。将种子液按1%的接种量接种于发酵培养基，30℃，150rpm条件下培养48h，获得发酵液（生防菌液），即生防菌株G58菌剂，其中生防菌株G58活菌数为10⁸~10⁹CFU/ml。

发酵培养基配方为：蔗糖1g/L，酵母粉10 g/L，KCl浓度0.8 g/L，初始pH5。

三、生防菌株G58对植物病原菌的抑制作用

（1）平板拮抗试验

吸取浓度为1×10⁵CFU/ml的病原菌（具体病原菌如表2所示）菌液100 μl放入PDA平板中涂布均匀，利用无菌打孔器在平板上打3孔，每个孔中分别注入上述“二”中制备的生防菌株G58菌剂50 μl。30℃恒温培养箱中培养3~5 d后，观察有无抑菌圈，测定抑菌圈活性，抑菌活性用抑菌圈直径（mm）表示： 抑菌圈直径=透明圈直径－孔径(8 mm)。

表2 生防菌株G58对植物真菌病原菌的抑菌圈直径（mm）

    抑菌圈活性的测定结果如表2所示，从中可以看出本发明生防菌株G58菌剂对14种常见的植物真菌病原菌水稻纹枯病病原菌、柑桔炭疽病病原菌、番茄叶霉病病原菌、辣椒炭疽病病原菌、玉米炭疽病病原菌、小麦赤霉病病原菌、冬瓜枯萎病病原菌、苦瓜枯萎病病原菌、甘蔗黑腐病病原菌、香蕉炭疽病病原菌、水稻稻瘟病病原菌、水稻稻曲病病原菌、油菜菌核病病原菌和棉花枯萎病病原菌均具有明显的抑菌效果。说明本发明的生防菌株G58对多种植物真菌病原菌均表现出良好的抑制效果，具有较广的抗菌谱。

其中生防菌株G58菌剂对水稻纹枯病病原菌抑菌图如图1所示，从中可以看出生防菌株G58菌剂对这种植物病原菌产生了明显的抑制作用。

综上所述，本发明的生防菌株G58对常见植物真菌病原菌具有很的抑制作用。

（2）温室试验测定生防菌株G58菌剂对水稻纹枯病的防治效果

盆栽试验：水稻品种为粤晶丝苗2号，种子催芽后，采用秧盘育秧20d-25d，然后移栽。光照条件14h/10h，湿度90%~95%，温度32℃。水稻纹枯病菌在 PDA平板上培养5d后，切成许大约 5 mm 的方形小块，在水稻分蘖盛期或末期接种水稻纹枯病。利用锡箔纸将 5 mm 的水稻纹枯病琼脂块固定在水稻叶片上，每张叶片接种 1块 (将琼脂块中长有菌丝的表面层紧贴于叶片的表面 ) ，每个分蘖株接种 3~4张上部叶片。将菌丝块嵌入稻株茎秆倒数第3叶鞘内侧，并保持叶鞘包茎状态不变。待茎杆上出现典型病变斑后，揭开锡箔纸。接种水稻纹枯病后，分别1d、7d、15d、21d进行喷雾含生防菌株G58的菌剂，即上述“二”中制备的生防菌株G58菌剂，生防菌株G58活菌数为1×10⁸CFU/ml。

盆栽试验共设置2个处理，每个处理5盆，每盆含2株水稻。

处理组1（常规组）：常规种植，不接种病原菌和生防菌；

处理组2：接种水稻纹枯病病原+喷施G58菌剂（15ml/盆）； 

处理组3：接种水稻纹枯病病原菌+喷施井岗霉素60A (40μg/ml，15ml/盆)；

处理组4（对照组）：接种水稻纹枯病病原+喷施无菌水；

在40 d后，测量生防菌株G58菌剂对水稻纹枯病的防效，测量结果如表3所示。

表3 G58菌剂对水稻纹枯病的防治情况

从表3中可以看出生防菌株G58菌剂对水稻纹枯病的防效达73.6%，显著高于传统的井岗霉素60A的防效（49.6%）。说明，本发明生防菌株G58对植物具有很好的真菌病害防治作用。

（3）温室试验测定生防菌G58菌剂的定植情况

将上述（2）中处理组2的水稻移栽一个月后，从每盆中随机剪取叶片各1g (2片左右)，剪成1cm长，称重，放入含 100 mL PBS的三角瓶中。25℃、150rpm振荡培养2h后，用PBS稀释样品。吸取100ul经适当稀释的样品放入含有100ug/ml利福平平板中（因生防菌株G58具有利福平抗性，故利用含利福平的平板进行菌落计数），每个稀释液设 3个重复，在30℃下培养24 h后，结合菌落形态计数得到G58菌落数为9.7×10⁶ CFU/g，说明菌株G58具有较好的定植能力。