一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了属于生物防治领域的一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株JQ23，该菌株已于2014年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9375。本发明还公开了一种含有JQ23的微生物杀虫剂及其制备方法。本发明苏云金芽孢杆菌JQ23对韭菜迟眼蕈蚊幼虫具有很高的毒力，为韭菜迟眼蕈蚊的防治提供了一种有效的方法；其次，本发明苏云金芽孢杆菌属于天然产物，对人畜无毒，对环境无污染；此外，本发明微生物杀虫剂制备方法简单，使用方便。

说明书

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云 金芽孢杆菌，以及该苏云金芽孢杆菌在蔬菜害虫防治中的应用。

背景技术

韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)又名韭蛆、黄脚蕈蚊，属双翅目， 眼蕈蚊科，主要危害韭菜、大葱、洋葱、小葱、大蒜等百合科蔬菜，偶尔也 危害莴苣、青菜、芹菜等，是葱蒜类蔬菜的主要害虫之一，在全国各地均有 分布。韭菜迟眼蕈蚊的幼虫生活在土壤表层，群集在韭菜地下部的鳞茎和柔 嫩的茎部蛀食为害。初孵幼虫先为害韭菜叶鞘基部和鳞茎的上端；春、秋季 主要为害嫩茎，导致根茎腐烂。受害韭菜地上部分生长细弱，叶片发黄萎蔫 下垂，最后韭叶枯黄死亡。夏季气温高时，幼虫向下移动，为害韭菜鳞茎， 致使整个鳞茎腐烂，严重时整墩韭菜枯死。对于韭菜迟眼蕈蚊的防治方法主 要有物理防治(糖醋液、臭氧等)和化学防治。由于物理防治方法存在操作 繁琐、防治效果受环境影响大等缺点，生产上主要采用农药灌根等化学手段 进行防治，但是由于韭蛆繁殖快、隐蔽性强、防治难度大，导致菜农不规范 或过量、甚至违规使用禁用的高毒农药进行防治，导致农药残留超标、污染 环境、危害人类健康以及杀害有益鸟类等问题，另一方面，长期大量使用化 学农药增强害虫抗药性、污染环境、杀伤鸟类、造成害虫再度猖獗的恶性循 环，不能达到对害虫种群的有效控制，同时造成韭菜农残超标，使消费者健 康受到威胁。近年来毒韭菜事件频发，如：2004年4月“香河毒韭菜进京事 件”、2010年4月“青岛毒韭菜”和2011年3月河南南阳“毒韭菜事件”， 连续的毒韭菜曝光事件，使得消费者“谈韭色变”，严重影响了菜农的经济 利益和消费者的食品安全。

生物防治由于具有专一性强、对人畜无毒害、不存在产生抗药性以及环 境污染等问题，日益受到人们的青睐。为了减少化学农药对环境的污染及对 人民健康的威胁，筛选对韭蛆有高致病性的生防微生物是防治韭蛆的有效方 法和重要措施。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种从 土壤或死亡昆虫体内分离出来的革兰氏阳性细菌，此类菌在芽孢形成时期能 产生一种或多种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目、等 翅目、毛翅目或缨翅目等多种害虫具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白(Insecticidal  Crystal Proteins，简称ICPs)。这种杀虫晶体蛋白对目标害虫高效专一、对人 畜无害、不污染环境，因而苏云金芽孢杆菌在害虫的生物防治中得到了广泛 的应用。

利用苏云金芽孢杆菌防治韭蛆的研究相对较少，如苏云金芽孢杆菌防治 韭蛆的效果可达75％左右(成学美等.植保技术与推广。1998年04期)或 84.85％(解维星.2006，华中农业大学硕士论文)。

从上述可知，利用苏云金芽孢杆菌防治韭菜迟眼蕈蚊具有良好应用前景。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于防治韭菜迟眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌。 该菌株对双翅目眼蕈蚊科害虫韭菜迟眼蕈蚊具有高毒杀能力。

本发明另一目的在于提供一种微生物杀虫剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物杀虫剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述苏云金芽孢杆菌的用途。

实现本发明的技术方案如下：

本发明一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株JQ23，该菌株 已于2014年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏编号为CGMCC No.9375。

一种微生物杀虫剂，含有上述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 菌株JQ23。

上述微生物杀虫剂，其剂型为液体剂型。

上述微生物杀虫剂，其所述的液体剂型中含有上述苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)菌株JQ23的芽孢浓度为10⁷～10⁸cfu/ml。

上述微生物杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)、菌种活化：将保存的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌 株JQ23在LB平板培养基上、在29～31℃下活化12～16h；挑取单菌落在 LB斜面培养基上、在29～31℃下培养3～5天，得活化的菌株；

(2)、种子液制备：用无菌接种环刮取一小环步骤(1)中活化的菌株接 种到LB液体培养基50ml中，在29～31℃、转速为200～220rpm/min条件 下培养10～14h，得种子液；

(3)、发酵培养：按照体积比为1～2％的比例将步骤(2)所得的种子液 接入到黄豆饼淀粉粉培养基中，在29～31℃、转速为200～220rpm/min条件 下培养48～60h，得到发酵液；

(4)、用水稀释步骤(3)所得的发酵液，调节pH值至6.6～6.8，添加 0.02～0.1％的苯甲酸钠，即得微生物杀虫剂；或者将步骤(3)所得的发酵液 在4℃、转速为5000rpm/min条件下离心30min，取沉淀，得沉淀物，再用水 稀释沉淀物，调节pH值至6.6～6.8，添加0.02％～0.1％的苯甲酸钠，即得微 生物杀虫剂。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基为本 领域技术人员所熟知的常用培养基，其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1L，pH7.2。

上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基为本领域技术人员熟知 的常用培养基，其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， 氯化钠10g，水1L，pH7.2。

上述制备方法步骤(3)中所述的黄豆饼粉培养基的组成成分及其重量百 分比为：黄豆饼粉2.5％、棉籽饼粉1.2％、玉米淀粉1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄0.03％、MgSO₄0.05％，水1L。

上述苏云金芽孢杆菌JQ23在防治蔬菜害虫上的应用。

所述的蔬菜害虫是指双翅目眼蕈蚊科害虫。

所述的眼蕈蚊科害虫是指韭菜迟眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)。

本发明菌株JQ23采集筛选的过程及其分类鉴定：

(一)采集筛选的过程及形态分类鉴定：

本发明菌株JQ23是河北省农林科学院植物保护研究所将2013年4月在 河南省采集的土样中分离到的菌株接种在LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵 母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1L，pH7.2)上在30℃条件下培 养，不同时间取样镜检观察菌落(见图1)形态特征、晶体特征等。在LB培 养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.1～ 1.5×0.5μm；单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约1.0～1.2×0.5 μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴孢晶体：球 形，直径约0.4μm，具有杀虫活力。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手 册》(东秀珠等编著，科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌形态特征基本 一致，初步判断该菌株属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，并 将其命名为JQ23。

(二)利用gyrB基因序列对JQ23菌株进行分子鉴定分类：

将JQ23菌株接种于LB培养液，30℃振荡过夜，取1mL菌液于Eppenddorf 管中，离心，弃上清，200μL超纯水悬浮，100℃处理10min，12000rpm离心 5min，取上清即为DNA模板。利用芽孢杆菌gyrB-F和gyrB-R为引物进行 PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：

gyrB-F：5’TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3’(SEQ ID No.1)，

gyrB-R：5’TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3’(SEQ ID No.2)；

gyrB的PCR扩增反应体系(50μL):10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL；dNTP  Mixture(2.5mM)5μL，引物(10μmol/L)各1μL，模板1μL，Taq聚合酶(5U/ μL)1μL，超纯水补至50μL。反应程序为：95℃5min；95℃30s，55℃45s， 72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限 公司进行测序，得JQ23菌株的gyrB基因序列(见SEQ ID No.3)。将JQ23 菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现JQ23与苏云 金芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到99％；同时利用MEGA软件 构建系统发育树，结果(见图3)JQ23菌株与苏云金芽孢杆菌聚合在一起， 说明JQ23菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，并且与任何其他 菌株不同，是一个新菌株。

(三)利用phoR基因序列对JQ23菌株进行分子鉴定分类：

提取JQ23菌株的DNA，然后以JQ23菌株的DNA为模板，以phoR-F 和phoR-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：

phoR-F：5’TTYARYTCATGRGAVACATT3’(SEQ ID No.4)；

phoR-R：5’GGNTAYAAANARGAGGAGCC3’(SEQ ID No.5)；

phoR的PCR反应体系(50μL):10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP  Mixture(2.5mM)5μL，引物(10μmol/L)各2μL，模板1μL，Taq聚合酶(5U/ μL)1μL，超纯水补至50μL。反应程序为：95℃5min；95℃30s，50℃45s， 72℃1min，30个循环；72℃10min。将所得扩增产物送交上海生工生物工程 有限公司进行测序，得JQ23菌株的phoR基因序列(见SEQ ID No.6)。将JQ23 的phoR基因序列(见SEQ ID No.6)在Genbank中进行同源性比较，结果发 现JQ23菌株与苏云金芽孢杆菌的phoR基因序列同源性最高，达到99％；同 时利用MEGA软件构建系统发育树，结果(见图4)JQ23菌株与苏云金芽孢 杆菌聚合在一起，说明JQ23菌株在分类上属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus  thuringiensis)，并且与任何其他菌株不同，是一个新菌株。

本发明JQ23微生物杀虫剂的使用方法：将JQ23微生物杀虫剂直接兑水 稀释至1×10⁷cfu～1×10⁸cfu/ml，在韭蛆发生初期灌根防治，连续灌根3次， 每次间隔5-7d。

本发明具有的优点或有益效果：本发明苏云金芽孢杆菌菌株JQ23对韭 菜迟眼蕈蚊幼虫具有很高的毒力，其菌液浓度在1×10⁷cfu/mL以上时，对韭 菜迟眼蕈蚊幼虫7天的校正死亡率达83.84％以上；JQ23微生物杀虫剂 1×10⁷cfu/mL使用浓度下，田间虫口减退率达到66.03％，防治效果达到 85.09％；本发明为韭菜迟眼蕈蚊的防治提供了一种有效的、无害的、环保的 方法；其次，本发明苏云金芽孢杆菌属于天然产物，对人畜无毒，对环境无 污染，将其作为微生物杀虫剂用于蔬菜害虫防治，属于环境友好型杀虫剂， 该微生物杀虫剂的开发和利用将有效杜绝“毒韭菜事件”再次发生，保障食 品安全；此外，本发明JQ23的微生物杀虫剂制备方法简单，使用方便。

附图说明

图1.为JQ23菌株菌落照片。

图2.为JQ23菌株感染的韭菜迟眼蕈蚊幼虫对比照片，其中左侧的为健 康的韭菜迟眼蕈蚊幼虫，右侧的为被JQ23菌株感染的韭菜迟眼蕈蚊幼虫。

图3.为根据gyrB基因序列构建的JQ23系统发育树。

图4.为根据phoR基因序列构建的JQ23系统发育树。

具体实施方式

实施例1：JQ23菌株微生物杀虫剂的制备

按照如下方法进行：

(1)菌种活化：将保存的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23((已于2014年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，保藏编号为CGMCC No.9375))在LB平板培养基(其组成成分 及其重量比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g， 水1L，pH7.2)上29℃活化13h，挑取单菌落在LB斜面培养基((其组成成 分及其重量比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g， 水1L，pH7.2)上30℃培养3天，得活化的菌株。

(2)种子液的制备：用无菌接种环刮取一小环步骤(1)活化的菌株接 种到LB液体培养基(其组成成分及其重量比例为：胰蛋白胨10g，酵母提取 物5g，氯化钠10g，水1L，pH7.2)50ml中，在30℃、摇床转速为200rpm/min 的条件下培养12h，得种子液。

(3)发酵培养：按照体积比为1％的比例将步骤(2)的种子液接入到黄 豆饼淀粉粉培养基(其组成成分及其重量百分比为：黄豆饼粉2.5％、棉籽饼 粉1.2％、玉米淀粉1.5％、酵母粉0.5％、KH₂PO₄0.03％、MgSO₄0.05％，加 水混合溶解，调pH7.2，121℃灭菌30min，再降到30℃备用)中，在30℃， 转速为200rpm/min摇床培养48h，检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液 中胞晶分离达到95％时停止发酵培养，得发酵液(以下简称“菌液”)；经稀 释平板计数法计数发酵液中的活菌数大于5.46×10⁸cfu/ml。

(4)将步骤(3)所得发酵液调节pH值至6.6～6.8，添加0.02％～0.1％ 的苯甲酸钠，即得微生物杀虫剂；或者将发酵液在4℃、转速为5000rpm/min 条件下离心30min，弃掉上清液，所得沉淀为JQ23孢晶混合物，用水稀释菌 体JQ23孢晶混合物至1×10⁷cfu/ml浓度，调节pH值至6.6～6.8，添加0.02％～ 0.1％的苯甲酸钠，即为微生物杀虫剂。

实施例2：本发明JQ23菌株防治韭菜迟眼蕈蚊幼虫室内生测试验

(一)试验设计：

将实施例1制备的JQ23菌液用水分别稀释成5×10⁸、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、 1×10⁵cfu/ml五个浓度梯度。

对照：无菌水

(二)试验方法：

(1)将灭菌的1.5％水琼脂倒入一次性塑料培养皿中，厚度为3mm，上 铺两层滤纸；

(2)将韭菜剪至大小为10mm的韭菜段，浸泡在实施例(1)制备的JQ23 菌液中20min，取出浸泡过JQ23菌液的韭菜段放入平皿中。

(3)挑取大小一致、健康活泼的韭菜迟眼蕈蚊幼虫接种在步骤(2)中 含菌的韭菜段上，以无菌水为对照。置于25℃、光周期14h：10h(L：D) 条件下饲养7d。每处理30头试虫，设3次重复，施药后定期调查死亡虫数。 数据统计分析应用SPSS18.0软件进行数据处理。

表1本发明菌株JQ23防治韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫的试验结果

注：同一列不同字母表示差异显著。

结果(见表1)JQ23菌液浓度大于1×10⁷孢子/mL时，JQ23对韭菜迟眼 蕈蚊幼虫3天的校正死亡率为78.9％以上。说明JQ23菌株对韭菜迟眼蕈蚊幼 虫有很高的杀虫活性。

实施例3、本发明苏云金芽孢杆菌JQ23防治韭菜迟眼蕈蚊田间对比试验

(一)试验药剂

(1)、处理I：实施例1制备的JQ23菌液，浓度为1×10⁷cfu/ml。

(2)、处理II：毒死蜱乳油(480g/L)(青岛金正农药有限公司)，用水 稀释1000倍液。

(3)、处理III：清水(空白对照)

(二)试验时间和地点：2014年4月在河北省农林科学院植物保护研 究所的温室大棚内进行。

(三)试验方法：将温室种植的韭菜田，分割成20m²/小区，每处理重复 3次，采取随机分组排列方法放置。在韭蛆发生初期，按(一)中各处理采用灌 根方法进行处理，每小区用水量1.5L，间隔7d重复一次，共施药3次，采用 随机五点取样方法，每点0.2m²，调查第一次用药前幼虫虫口基数和最后一次 施药后7d幼虫虫口数，计算平均虫口减退率和平均防治效果。计算公式为：

虫口减退率％＝(施药前虫口密度－施药后虫口密度)/施药前虫口密度 ×100％。

防治效果％＝(处理的虫口减退率－空白对照虫口减退率)/(1-空白对照虫 口减退率)×100％。

结果(见表2)苏云金芽孢杆菌JQ23菌液浓度为1×10⁷cfu/ml时，连续 施药3次后对韭蛆的虫口减退率达到66.03％，防治效果达到85.09％，田间防 治效果显著；同时，苏云金芽孢杆菌属于生物农药，对人畜安全无毒害、保 障食品安全、对环境无污染、符合我国可持续发展要求，因此具有较好的应 用前景。

表2本发明JQ23菌株防治韭菜迟眼蕈蚊对比试验结果