用于合成醋酸格拉替雷的质谱内标的多肽

摘要

本发明涉及用于合成醋酸格拉替雷（又称共聚物-1）的质谱内标的多肽，其制备方法和用途。

说明书

技术领域

本发明涉及用于合成醋酸格拉替雷（又称共聚物-1）的质谱内标的多肽，其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及用于在醋酸格拉替雷合成过程中，作为中间体分子量测定的内标的多肽，其制备方法和用途。 

背景技术

自身免疫类疾病是指，生物机体的免疫系统将一些机体本身的组织当作“外来物”进行攻击的现象。通常这种疾病可以通过阻碍生物机体T细胞和B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。这些早期的免疫反应是通过抗原结合到主要组织相容性抗原复合物（MHC）分子上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作“自抗原”，被机体免疫系统攻击。例如：多发性硬化症，就是免疫系统攻击隔离和保护神经的髓鞘的疾病。这种疾病发展到失去髓鞘，就会带来神经元和运动神经功能丧失。 

很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替雷是一个由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸组成的多肽的混合物。它的氨基酸摩尔比大约是0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100，平均分子量大约5000～9000道尔顿。US5800808中描述了共聚物-1和其三元共聚物（丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸中任意三种组成的多肽的混合物）的平均分子量最佳范围和合成工艺。 

最早，Teitelbaum等在Eur.J.Immun.,1,242,1971中描述了合成共聚物-1的方法是由溶于1,4-二氧六环的L-丙氨酸的N-羧酸酐、L-酪氨酸的N-羧酸酐、γ-谷氨酸苄酯的N-羧酸酐和三氟乙酰基赖氨酸的N-羧酸酐制备保护的醋酸格拉替雷（保护的共聚物-1）。然后用33%溴 化氢的乙酸溶液除去谷氨酸残基上的γ-苄基保护基，同时部分的切断多肽的肽链，得到三氟乙酰基醋酸格拉替雷（三氟乙酰基共聚物-1）。然后用哌啶水溶液除去赖氨酸残基上的三氟乙酰基保护基，得到粗共聚物-1。最后，经过透析，将溶液冻干，即得到共聚物-1原料药。 

为了能够确保得到的共聚物-1或三元共聚物具有药效，就必须准确的知道多肽混合物在合成过程中的平均分子量分布和变化。已有常规方法可以得到共聚物-1的平均分子量，但是就整个工艺的过程控制而言，这类方法不适合。因为保护的共聚物和三氟乙酰基共聚物都不溶于水，而共聚物-1易溶于水，常规方法也是在水体系中测量共聚物-1的平均分子量。而且通常用于测定分子量的柱色谱法还会因待测产物的结构、组成等不同而存在一定误差。 

因此，本领域中仍然需要更加准确地在共聚物-1合成过程中测量中间体的分子量，尤其是保护的共聚物和三氟乙酰基共聚物的分子量，正确得到共聚物-1合成过程中平均分子量和分子量分布变化的规律，从而加强对共聚物-1合成过程中的中间体质量控制。 

发明内容

本发明就是为了在合成共聚物-1的过程中，加强工艺控制，找到保护的共聚物-1、三氟乙酰基共聚物-1和共聚物-1的分子量之间的关系和变化规律。所以，准确的测量保护的共聚物和三氟乙酰基共聚物的平均分子量和分子量分布就尤为重要了。本发明中利用了两个系列的合成多肽的作为内标，确定了色谱柱的校正系数，得到了比较准确的分子量，为找到保护的共聚物、三氟乙酰基共聚物和共聚物-1的分子量之间的关系和变化规律提供了可靠的数据支持。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于醋酸格拉替雷合成的内标品1，包括选自以下的3-7条多肽： 

表1.内标肽系列（其中TFA表示三氟乙酰基，Bn表示苄基，NEt2表示碳端是N,N-二乙基酰胺） 

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于醋酸格拉替雷合成的 内标品2，包括选自以下的3-7条多肽： 

表2.内标肽系列二（其中TFA表示三氟乙酰基） 

在一个实施方案中，所述内标肽全部由L-氨基酸组成。 

在一个实施方案中，所述内标肽全部由D-氨基酸组成。 

在一个实施方案中，本发明提供了所述内标品1用作在共聚物-1合成过程中测量保护的共聚物-1的平均分子量和分子量分布的内标的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了所述内标品2用作在共聚物-1合成过程中测量三氟乙酰基共聚物-1的平均分子量和分子量分布的内标的用途。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在共聚物-1合成过程测量保护的共聚物-1的平均分子量和分子量分布的方法，其中使用前述的内标品1作为内标。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在共聚物-1合成过程测量三氟乙酰基共聚物-1的平均分子量和分子量分布的方法，其中使用前述的内标品2作为内标。 

在一个实施方案中，所述分子量是使用柱色谱法测定的。 

附图说明

图1内标品1的分子量的对数与保留时间线性图（横轴是RT,纵轴是分子量的对数） 

图2内标品1分子量的对数与相对保留时间线性图（横轴是分子量的对数,纵轴是RRT） 

图3内标品2分子量的对数与保留时间线性图（横轴是RT,纵轴是分子量的对数） 

图4内标品2分子量的对数与相对保留时间线性图（横轴是分子量的对数,纵轴是RRT） 

具体实施方式

实施例1.内标品1的内标肽的固相合成 

七条分子量从5400-17000道尔顿的分子量内标肽由深圳翰宇药业股份有限公司客户肽服务部合成（见表3和4）。这些内标肽编号为 TV-##-PR，其中##为氨基酸残基数目（例如：TV-35-PR就是含有35个氨基酸残基的肽链）。氨基酸的组成与共聚物-1的特征值相符，即丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸组成的氨基酸摩尔比为0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100，平均分子量大约5000～9000道尔顿。 

TV-35-PR合成方法：采用替代度0.5mmol/g2-CTC树脂20g，放入固相反应柱，DMF溶胀30分钟，抽掉DMF；称取Fmoc-Ala-OH6.2g，用30ml DMF溶解，加入6.9ml DIPEA活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，加入50ml20%哌啶/DMF溶液，脱除Fmoc保护基，DMF洗涤6次，茚三酮检测有颜色。 

称取Fmoc-Glu（Bn）-OH9.3g、HObt2.97g,用30ml DMF溶解，加入3.4ml DIC活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，茚三酮检测无色透明。按照TV-35-PR肽序，逐个偶联，得到TV-35-PR肽树脂64.8g，得到的肽树脂采用三氟乙醇：二氯甲烷=1:4（V:V）650ml裂解3小时，过滤掉树脂，加入乙醚沉淀，离心，干燥得到TV-35-PR去氨保护肽44.1g。 

将得到的全保护肽44g加入到2L烧瓶中，用200ml四氢呋喃溶解，加入200ml20%二乙胺四氢呋喃溶液，反应5小时，浓缩，HPLC纯化得到TV-35-PR。 

其他几个内标采用同样的方法。 

表3内标肽的肽序及分子量 

表4.作用内标品1的各内标肽氨基酸组成 

实施例2.使用内标品1校正色谱柱 

采用TSKgel HHR（7.8×3000mm，5μm）以N,N-二甲基甲酰胺为流动相，流速0.5ml/min，波长275nm，进样浓度为10mg/ml，进样量为20ul，进行内标这七个内标肽的校正。这些内标肽与保护的共聚物的保留时间与其对应分子量的对数呈一定的相关性。其公式为： 

logMw=A+B×RT或者Mw=10^{（A+B×RT）}

其中Mw为分子量，RT为保留时间，A和B分别为截距和斜率。为了更准确的计算各组分的分子量，我们采用了丙酮作为内标的相对保留时间进行计算，其中丙酮的保留时间为39.8分钟。 

表5.内标品1的色谱柱校正结果（图1、2） 

*RRT=RT/RT(丙酮)； 

**用公式logMw=A+B×RT计算结果； 

***用公式RRT=B1+B2×logMw计算结果； 

实施例3.内标品2的内标肽的固相合成 

七条分子量从4900-15400道尔顿的分子量内标肽由深圳翰宇药业股份有限公司客户肽服务部合成（见表3和5）。这些内标肽编号为TV-##-TFA，其中##为氨基酸残基数目（例如：TV-35-TFA就是含有35个氨基酸残基的肽链）。氨基酸的组成与共聚物-1的特征值相符。 

TV-35-TFA合成方法：采用替代度0.5mmol/g2-CTC树脂20g，放入固相反应柱，DMF溶胀30分钟，抽掉DMF；称取Fmoc-Ala-OH6.2g，用30ml DMF溶解，加入6.9ml DIPEA活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，加入50ml20%哌啶/DMF溶液，脱除Fmoc保护基，DMF洗涤6次，茚三酮检测有颜色。 

称取Fmoc-Glu（Bn）-OH9.3g、HObt2.97g,用30ml DMF溶解，加入3.4ml DIC活化3分钟，加入反应柱，反应2小时，茚三酮检测无色透明。按照TV-35-TFA肽序，逐个偶联，得到TV-35-TFA肽树脂64.8g，得到的肽树脂采用三氟乙醇：二氯甲烷=1:4（V:V）650ml裂解3小时，过滤掉树脂，加入乙醚沉淀，离心，干燥得到TV-35-TFA去氨保护肽44.1g。 

其他几个内标采用同样的方法。 

表6.用作内标品2的各内标肽氨基酸组成 

实施例4.使用内标品2校正色谱柱 

采用TSKgel HHR（7.8×3000mm，5μm），以N,N-二甲基甲酰胺为流动相，流速0.5ml/min，波长275nm，进样浓度为10mg/ml，进样量为20ul，进行内标这七个内标肽的校正。这些内标肽与保护的共聚物的保留时间与其对应分子量的对数呈一定的相关性。其公式为： 

logMw=A+B×RT或者Mw=10^{（A+B×RT）}

其中Mw为分子量，RT为保留时间，A和B分别为截距和斜率。为了更准确的计算各组分的分子量，我们采用了丙酮作为内标的相对保留时间进行计算。 

表7.内标品2的色谱柱校正结果（图3、4） 

^＊RRT=RT/RT(丙酮)； 

^**用公式logMw=A+B×RT计算结果； 

^***用公式RRT=B1+B2×logMw计算结果。