抗聚泛素抗体及使用方法

摘要

本发明提供抗聚泛素抗体及其使用方法。

说明书

相关申请

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序列表

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发明领域

本发明涉及抗聚泛素(anti-polyubiquitin)抗体领域，并且更具体地 来说，涉及不特异性结合单泛素(monoubiquitin)且对线性聚泛素具有 特异性的抗聚泛素抗体，以及其使用方法。

背景

泛素(ubiquitin)是一种在诸多细胞途径中具有重要调节作用的小 蛋白质。这些作用中最为人所共知的是泛素在蛋白质降解中的作用， 在此泛素与靶蛋白共价连接，使得靶蛋白被26S蛋白酶体识别并受之 破坏(参见Wilkinson,Semin.Cell Devel.Biol.11(3):141-148(2000))。 泛素(一种76个氨基酸的蛋白质)与靶蛋白的共价连接是一个三步酶 促过程(Pickart,Annu.Rev.Biochem.70:503-533(2001))。首先，在ATP- 依赖性反应中泛素激活酶E1形成泛素-E1硫酯。在第二步中，泛素 由泛素-E1硫酯转移至泛素偶联酶(E2)家族的成员。在第三步中，在 泛素-蛋白质连接酶(E3)的帮助下，在泛素的羧基末端和靶蛋白上赖氨 酸残基的ε-氨基之间形成异肽键。称为去泛素酶的酶类将泛素部分从 靶蛋白上除去(Guterman和Glickman,Curr.Prot.Pep.Sci.5:201-210 (2004))。

泛素含有7个赖氨酸残基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys33、Lys29、 Lys48和Lys63)，因此泛素自身可作为靶蛋白用于泛素化(Peng等， Nat.Biotechnol.21:921-926(2003)；Pickart和Fushman,Curr.Opin. Chem.Biol.8:610-616(2004))。泛素蛋白的泛素化后所产生的分子称 为聚泛素分子，并可包含两个或更多个泛素部分。理论上，泛素的泛 素化可在7个赖氨酸残基中任何一个上发生(Peng等，Nat.Biotechnol. 21:921-926(2003))，以致存在具有至泛素内不同赖氨酸残基的异肽键 的不同种类的聚泛素。已报道在所有七个赖氨酸残基上具有内部异肽 键联的聚泛素链。Iwai和Tokunaga,EMBO Reports10:706-713(2009)。

最近发现也形成线性聚泛素链，其中泛素的C端甘氨酸偶联至 另一泛素分子的N端蛋氨酸的α-氨基。Iwai和Tokunaga,EMBO  Reports10:706-713(2009)。线性聚泛素经由由两个环指蛋白HOIL-1L 和HOIP组成的线性泛素链装配复合物(LUBAC)形成。Tokunaga等， Nat.Cell Biol.11:123-132(2009)。据信基因编码的未锚定的线性聚泛 素未存在于细胞中，因为其C端易受异肽酶T裂解。Iwai和Tokunaga, EMBO Reports10:706-713(2009)。这一观察表明，线性聚泛素翻译后 装配在底物蛋白上并且偶联的线性聚泛素分子是蛋白质活性和功能 的潜在调节剂。同上。例如，已显示NF-kB必要调节剂(NEMO)的线 性聚泛素化在NF-κB激活中起作用。同上。

区分不同赖氨酸键联的线性聚泛素和聚泛素的抗体将用于进一 步检查线性聚泛素链在蛋白质降解和调控中的作用以及用于在线性 聚泛素介导的途径中靶向和调节线性聚泛素。

概述

本发明提供抗线性聚泛素抗体及其使用方法。在一个实施方案 中，本发明提供特异性结合包含C端至N端键联的第一聚泛素的分 离的抗体，其中所述抗体不特异性结合包含赖氨酸键联的第二聚泛 素。在另一个实施方案中，本发明提供特异性结合包含C端至N端 键联的第一聚泛素和包含赖氨酸键联的第二聚泛素的分离的抗体，其 中所述抗体不特异性结合单泛素，并且其中所述抗体以与抗体对第一 聚泛素的结合亲和力相比实质性降低的结合亲和力结合第二聚泛素。

在另一个实施方案中，本发明提供特异性结合C端至N端连接 的聚泛素的分离的抗体，其中所述抗体不特异性结合单泛素。一方面， 所述抗体包含至少一个高变(HVR)序列，所述序列分别选自SEQ ID  NO:1、4、19和50-57中任一个的HVR-L1；SEQ ID NO:2和58-63 中任一个的HVR-L2；SEQ ID NO:3、5、6、20、21和64-72中任一 个的HVR-L3；SEQ ID NO:7、10、13、16、22和73-81中任一个的 HVR-H1；SEQ ID NO:8、11、14、17、23、24和82-86中任一个的 HVR-H2；以及SEQ ID NO:9、12、15、18和87-93中任一个的 HVR-H3。

另一方面，所述抗体包含至少一个选自HVR-L1、HVR-L2和 HVR-L3的序列，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQX₁VX₂X₃X₄VA (SEQ ID NO:39)，其中氨基酸X₁选自氨基酸D、S和G，氨基酸X₂选自S和D，氨基酸X₃选自S、T和N且氨基酸X₄选自A和S；其 中HVR-L2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；并且其中HVR-L3包 含氨基酸序列QQX₅X₆X₇X₈X₉PX₁₀T(SEQ ID NO:40)，其中氨基酸 X₅选自S、Y和H，氨基酸X₆选自Y和F，氨基酸X₇选自T、Y和 A，氨基酸X₈选自T、Y和S，氨基酸X₉是任选的且如果存在，则 是丝氨酸，且氨基酸X₁₀选自P和L。

另一方面，所述抗体包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和 HVR-H3的高变(HVR)序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列 X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈(SEQ ID NO:41)，其中氨基酸X₁₁选自T和 N，氨基酸X₁₂选自F和I，氨基酸X₁₃选自S、T和Y，氨基酸X₁₄ 选自N、D、S和Y，氨基酸X₁₅选自T、Y、S和D，氨基酸X₁₆选 自Y、D和S，氨基酸X₁₇选自I和M，且氨基酸X₁₈选自S和H； 并且其中HVR-H2包含氨基酸序列AX₁₉IX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅TX₂₆(SEQ ID NO:42)，其中氨基酸X₁₉选自S、G、W和E，氨基酸X₂₀选自T、S和Y，氨基酸X₂₁选自P和S，氨基酸X₂₂选自S和Y，氨 基酸X₂₃选自G、S和Y，氨基酸X₂₄选自G和S，氨基酸X₂₅选自S 和Y，且氨基酸X₂₆选自D和S，以及HVR-H3包含氨基酸序列 RX₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇D(SEQ ID NO:43)，其中氨基酸 X₂₇选自T、E和G，氨基酸X₂₈选自W、A和Y，氨基酸X₂₉选自L、 G、V和S，氨基酸X₃₀选自L、S和W，氨基酸X₃₁选自R、K和Y， 氨基酸X₃₂选自W、L、G和Y，氨基酸X₃₃选自V、L、A和G，氨 基酸X₃₇选自M和F，且其中氨基酸X₃₄、X₃₅和X₃₆任选地存在且如 果存在，氨基酸X₃₄是S，氨基酸X₃₅选自V和P，且氨基酸X₃₆是A。

另一方面，所述抗体包含至少一个选自HVR-L1、HVR-L2和 HVR-L3的高变(HVR)序列，其中HVR-L1包含氨基酸序列RASQ  X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃A(SEQ ID NO:44)，其中氨基酸X₃₈选自D、A、 E、G、L、N、S、T和V，氨基酸X₃₉选自V、A、L和S，氨基酸 X₄₀选自S、F、G、L、R和V，氨基酸X₄₁选自T、G、I、N、S和 V，氨基酸X₄₂选自A、H、Q、R、S和Y，且氨基酸X₄₃选自V和L， 且其中HVR-L2包含氨基酸序列SX₄₄X₄₅X₄₆X₄₇YX₄₈(SEQ ID NO: 45)，其中氨基酸X₄₄选自A和R，氨基酸X₄₅选自S、K、Q和R， 氨基酸X₄₆选自F和Y，氨基酸X₄₇选自L、A、F、G、H、I、K、M、 N、P、R、S、V和Y，且氨基酸X₄₈选自S、A、D、F、G、H、V、 W和Y并且其中HVR-L3包含序列QQ X₄₉X₅₀X₅₁X₅₂PPT(SEQ ID NO: 46)，其中氨基酸X₄₉选自H和S，氨基酸X₅₀选自Y、K、N、Q、R、 S、V和W，氨基酸X₅₁选自T、I、Q、R、S和V，且氨基酸X₅₂选 自T、A、D、F、G、K、N、P、Q、R、S和V。

另一方面，所述抗体包含至少一个选自HVR-H1、HVR-H2和 HVR-H3的高变(HVR)序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列 X₅₃X₅₄X₅₅YX₅₆S(SEQ ID NO:47)，其中氨基酸X₅₃选自A、F、K、M、 Q、R和S，氨基酸X₅₄选自N和W，氨基酸X₅₅选自T、A、I、L、 M和V，且氨基酸X₅₆选自I、M和V，且其中HVR-L2包含氨基酸 序列AX₅₇X₅₈TPX₅₉SGX₆₀TX₆₁(SEQ ID NO:48)，其中氨基酸X₅₇选自 T和S，氨基酸X₅₈选自I、S和V，氨基酸X₅₉选自S和A，氨基酸 X₆₀选自S、H、I、L、M和Q，氨基酸X₆₁选自D和N，且其中HVR-H3 包含氨基酸序列X₆₂WX₆₃X₆₄RWVX₆₅D(SEQ ID NO:49)，其中氨基酸 X₆₂选自S和T，氨基酸X₆₃选自L和Y，氨基酸X₆₄选自L、I和V， 氨基酸X₆₅选自M和F。

另一方面，所述抗体分别包含SEQ ID NO:1或4的HVR-L1序 列、SEQ ID NO:2的HVR-L2序列和选自SEQ ID NO:3、5和6的 HVR-L3序列。另一方面，所述抗体分别包含选自SEQ ID NO:7、10、 13和16的HVR-H1序列、选自SEQ ID NO:11、23和24的HVR-H2 序列，和SEQ ID NO:12的HVR-H3序列。另一方面，所述抗体分别 包含选自SEQ ID NO:1和50-56的HVR-L1序列、选自SEQ ID NO: 2和57-62的HVR-L2序列和选自SEQ ID NO:3和63-71的HVR-L3 序列。另一方面，所述抗体分别包含选自SEQ ID NO:7和72-80的 HVR-H1序列、选自SEQ ID NO:8和81-85的HVR-H2序列，和选 自SEQ ID NO:9和86-92的HVR-H3序列。

另一方面，所述抗体包含与图1A中克隆1E2、1D8、1F4或1A10 所列的那些序列的对应的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。另一 方面，所述抗体包含与图1B中克隆1E2、1D8、1F4或1A10所列的 那些序列对应的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。另一方面，所 述抗体包含与图4A中克隆1D8.3C2、1D8.3F8或1D8.4F5所列的那 些序列对应的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。另一方面，所述 抗体包含与图4B中克隆1D8.3C2、1D8.3F8或1D8.4F5所列的那些 序列对应的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

另一方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1的HVR-L1序列、SEQ ID  NO:2的HVR-L2序列、SEQ ID NO:3的HVR-L3序列、SEQ ID NO: 10的HVR-H1序列、SEQ ID NO:11的HVR-H2序列和SEQ ID NO:12 的HVR-H3序列。另一方面，所述抗体包含SEQ ID NO:19的HVR-L1 序列、SEQ ID NO:2的HVR-L2序列、SEQ ID NO:3的HVR-L3序 列、SEQ ID NO:10的HVR-H1序列、SEQ ID NO:23的HVR-H2序 列和SEQ ID NO:12的HVR-H3序列。另一方面，所述抗体包含SEQ  ID NO:1的HVR-L1序列、SEQ ID NO:2的HVR-L2序列、SEQ ID NO: 20的HVR-L3序列、SEQ ID NO:10的HVR-H1序列、SEQ ID NO:11 的HVR-H2序列和SEQ ID NO:12的HVR-H3序列。另一方面，所 述抗体包含SEQ ID NO:1的HVR-L1序列、SEQ ID NO:2的HVR-L2 序列、SEQ ID NO:20的HVR-L3序列、SEQ ID NO:10的HVR-H1 序列、SEQ ID NO:11的HVR-H2序列和SEQ ID NO:12的HVR-H3 序列。另一方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1的HVR-L1序列、SEQ  ID NO:2的HVR-L2序列、SEQ ID NO:3的HVR-L3序列、SEQ ID NO: 7的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9 的HVR-H3序列。另一方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1的HVR-L1 序列、选自SEQ ID NO:2、57和59的HVR-L2序列、选自SEQ ID NO: 3、64和71的HVR-L3序列、SEQ ID NO:7或79的HVR-H1序列、 SEQ ID NO:8或81的HVR-H2序列和选自SEQ ID NO:9、86、88 或89的HVR-L3序列。另一方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1的 HVR-L1序列、SEQ ID NO:57的HVR-L2序列、SEQ ID NO:3的 HVR-L3序列、SEQ ID NO:7的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8的 HVR-H2序列和SEQ ID NO:9的HVR-H3序列。另一方面，所述抗 体包含SEQ ID NO:1的HVR-L1序列、SEQ ID NO:2的HVR-L2序 列、SEQ ID NO:3的HVR-L3序列、SEQ ID NO:7的HVR-H1序列、 SEQ ID NO:81的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9的HVR-H3序列。 另一方面，所述抗体包含SEQ ID NO:1的HVR-L1序列、SEQ ID NO: 57的HVR-L2序列、SEQ ID NO:3的HVR-L3序列、SEQ ID NO:7 的HVR-H1序列、SEQ ID NO:81的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9 的HVR-H3序列。在某些方面，任何本文中所述的抗体可包括 HVR-H3的C端之后作为第一氨基酸的亮氨酸(例如，紧邻HVR-H3， 诸如1E3，–TWLLRVMDL(SEQ ID NO:96)的C端的氨基酸)。

另一方面，所述抗体包含选自SEQ ID NO:25-28、33-35、94和 193-195的轻链氨基酸序列。另一方面，所述抗体包含选自SEQ ID NO: 29-31、36-38、95和196-198的重链氨基酸序列。

另一方面，所述抗体包含与下列序列组合中的一个的氨基酸序列 具有至少95%序列同一性的轻链和重链氨基酸序列：SEQ ID NO25 和29；SEQ ID NO:26和30；SEQ ID NO:27和31；SEQ ID NO:28 和32；SEQ ID NO:33和36；SEQ ID NO:34和37；SEQ ID NO:35 和38；SEQ ID NO:95和95；SEQ ID NO:193和196；SEQ ID NO:194 和197；和SEQ ID NO:195和198。

在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗体，其中所述抗体结 合C端至N端连接的聚泛素上与前述抗体中的任何一个相同的抗原 决定簇，并且其中所述抗体不特异性结合单泛素。在另一个实施方案 中，本发明提供与前述抗体中的任何一个竞争结合C端至N端连接 的聚泛素的分离的抗体，其中所述抗体不特异性结合单泛素。在另一 个实施方案中，本发明提供任何前述的分离的抗体，其中所述抗体特 异性结合C端至N端连接的聚泛素化的蛋白质。在另一个实施方案 中，本发明提供任何前述的分离的抗体，其中所述抗体调节至少一个 聚泛素介导的信号传导途径。

在一个一般方面，任何前述抗体是单克隆抗体。在另一个一般方 面，任何前述抗体是人抗体。在另一个一般方面，任何前述抗体是人 源化抗体。在另一个一般方面，任何前述抗体是嵌合抗体。在另一个 一般方面，任何前述抗体是结合C端至N端连接的聚泛素的抗体片 段。

在另一个实施方案中，本发明提供编码任何前述抗体的分离的核 酸。在另一个实施方案中，本发明提供包含编码任何前述抗体的分离 的核酸的载体。在另一个实施方案中，本发明提供包含编码任何前述 抗体的分离的核酸的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供包 含载体的宿主细胞，所述载体包含编码任何前述抗体的分离的核酸。

在另一个实施方案中，本发明提供产生任何前述抗体的方法，包 括在其中产生所述抗体的条件下培养上文所述的宿主细胞。一方面， 所述方法还包括从宿主细胞回收抗体。另一方面，所述方法还包括纯 化抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供包含任何前述抗体和细胞毒剂 的免疫偶联物。在另一个实施方案中，本发明提供包含任何前述抗体 和药学上可接受的载体的药物制剂。一方面，药物制剂进一步包含另 外的治疗剂。在一个此类方面，另外的治疗剂是化疗剂。

在另一个实施方案中，本发明提供作为药物使用的任何前述抗 体。在另一个实施方案中，本发明提供在治疗细胞周期相关的疾病或 病症中使用的任何前述抗体。一方面，细胞周期相关的疾病或病症选 自与异常升高的细胞周期进展相关的疾病或病症和与异常降低的细 胞周期进展相关的疾病或病症。在一个此类方面，与异常升高的细胞 周期进展相关的疾病或病症是癌症。在另一个此类方面，与异常降低 的细胞周期进展相关的疾病或病症选自变性肌肉病症和变性神经病 症。

在另一个实施方案中，本发明提供任何前述抗体在制造药物中的 用途。一方面，药物用于选自癌症、变性肌肉病症和变性神经病症的 疾病或病症。在另一个实施方案中，本发明提供治疗患有选自癌症、 变性肌肉病症和变性神经病症的疾病或病症的个体的方法，包括向个 体施用有效量的任何前述抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供测定怀疑含有聚泛素或聚泛素 化的蛋白质的样本中的聚泛素或聚泛素化的蛋白质的存在的方法，包 括将该样本暴露于至少一种前述抗体并且测定所述至少一种抗体与 该样本中聚泛素或聚泛素化的蛋白质的结合。在另一个实施方案中， 本发明提供使样本中C端至N端连接的聚泛素化的蛋白质与非C端 至N端连接的聚泛素化的蛋白质分离的方法，包括使该样本与至少 一种前述抗体接触。在另一个实施方案中，本发明提供测定细胞或样 本中C端至N端连接的聚泛素的功能和/或活性的方法，包括使细胞 或样本与至少一种前述抗体接触并评估所述接触步骤对细胞或样本 的影响。

附图简述

图1示出噬菌体点ELISA的结果，显示克隆1D8、1E3、1F4和 1A10与一组泛素蛋白质在450nm的波长处的相对结合信号，如实施 例1B中描述的。Fab文库克隆各自含有gD标签并且通过结合抗gD 抗体来评估Fab在噬菌体上的展示。未包被的孔用作阴性对照。

图2A和2B描绘实施例1中获得的Fab的轻链和重链氨基酸序 列。图2A描绘克隆1E3、1D8、1F4和1A10的轻链序列(分别为SEQ  ID NO:25-28)。图2B描绘克隆1E3、1D8、1F4和1A10的重链序列 比对(分别为SEQ ID NO:29-32)。在图2A和2B中，每个克隆的HVR 序列由带框的区域标示，其中第一框标示HVR-L1(图2A)或HVR-H1 (图2B)，第二框标示HVR-L2(图2A)或HVR-H2(图2B)，且第三框 标示HVR-L3(图2A)或HVR-H3(图2B)。

图3描绘测量纯化的1F4、1D8和1E3Fab对线性二泛素 (diubiquitin)的亲和力的噬菌体IC₅₀竞争ELISA的结果。

图4示出在固定化背景中测定1D8和1E3Fab特异性识别一组二 泛素蛋白质的能力的蛋白质印迹分析的结果。

图5A和5B描绘在实施例2中由1D8亲和力成熟文库分选获得 的亲和力成熟克隆的轻链和重链氨基酸序列。图5A描绘亲和力成熟 克隆1D8.3C2、1D8.3F8和1D8.4F5的轻链序列(分别为SEQ ID NO: 33-35)。图5A以SEQ ID NO:26公开1D8序列。图5B描绘亲和力 成熟克隆1D8.3C2、1D8.3F8和1D8.4F5的重链序列比对(分别为SEQ  ID NO:36-38)。图5B以SEQ ID NO:30公开1D8序列。在图5A和 5B中，每个克隆的HVR序列由带框的区域标示，其中第一框标示 HVR-L1(图5A)或HVR-H1(图5B)，第二框标示HVR-L2(图5A)或 HVR-H2(图5B)，而第三框标示HVR-L3(图5A)或HVR-H3(图5B)。 以灰色突显相对于1D8亲本序列的氨基酸变化。

图6描绘测量1D8、1D8.3C2、1D8.3F8和1D8.4F5Fab对线性 二泛素的亲和力的噬菌体IC₅₀竞争ELISA的结果。

图7A和7B描绘评估突变体亲和力成熟变体相比于亲本1E3克 隆和对照的结合特异性特征的研究的结果。在ELISA中，针对与一 组泛素蛋白质的结合测试在噬菌体上展示的亲本1E3克隆和11个单 突变体亲和力成熟变体的结合。利用与抗gD抗体的结合来评估噬菌 体上的Fab展示且未包被的孔用作阴性对照。

图8A和8B描绘评估单突变体和双突变体变体相比于亲本1E3 克隆和对照的结合特异性特征的研究的结果，如在实施例3中描述 的。在ELISA中，针对与一组泛素蛋白质的结合测试在噬菌体上展 示的亲本1E3克隆、4个单突变体亲和力成熟变体和3个双突变体亲 和力成熟变体的结合。利用与抗gD抗体的结合来评估噬菌体上的Fab 展示且未包被的孔用作阴性对照。

图9A和9B描绘1E3Fab、在实施例3中由第二1E3亲和力成熟 文库分选获得的亲和力成熟克隆(1F11和3F5)、克隆4E4中观察到的 Y102L突变和由克隆1F11和3F5掺入氨基酸变化的三突变体Fab以 及如在实施例3P中描述的Y102L突变的轻链和重链氨基酸序列。图 9A描绘1E3、1F11、3F5、Y102L和1F11/3F5/Y102L的亲和力成熟 克隆的轻链序列(分别为SEQ ID NO:25、193、194、195和94)。图 9B描绘1E3、1F11、3F5、Y102L和1F11/3F5/Y102L的亲和力成熟 克隆的重链序列比对(分别为SEQ ID NO:29、196、197、198和95)。 在图9A和9B中，靶向1E3的第二亲和力成熟文库中的氨基酸变化 的Kabat位置由带框的区域标示。以灰色突显相对于1E3亲本序列的 氨基酸变化。

图10提供亲本1E3、单突变体和双突变体IgG与线性二泛素 (1000、333、111、37和12ng每泳道的系列稀释)和K63连接的二泛 素(1000ng每泳道)的结合的蛋白质印迹分析。

图11提供亲本1E3、双突变体和三突变体IgG与线性二泛素 (1000、333、111、37和12ng每泳道的系列稀释)和K63连接的二泛 素(1000ng每泳道)的结合的蛋白质印迹分析。

图12提供Y102L、Y1012L T110A突变体以及Y102L、T110A、 3F5和1F11IgG的各种突变体组合与线性二泛素(1000、333、111、 37和12ng每泳道的系列稀释)和K63连接的二泛素(1000ng每泳道) 的结合的蛋白质印迹分析。

图13提供如在实施例3M中描述的亲本1E3、单突变体、双突 变体和三突变体IgG与线性二泛素(1000、333、111、37和12ng每 泳道的系列稀释)和K63连接的二泛素(1000ng每泳道)的结合的蛋白 质印迹分析。

图14提供1E3和1F11/3F5/Y102L IgG与线性二泛素(1000、500、 250、125、63、31和16ng/泳道，其中标示了梯度)或单泛素、K11 连接的二泛素、K48连接的二泛素和K63连接的二泛素(1μg/泳道) 的两倍系列稀释液的结合的蛋白质印迹分析。作为对照，分析抗K63 IgG，Apu3.A8与K63连接的二泛素(1000、500、250、125、63、31 和16ng/泳道，其中标示了梯度)或单泛素、线性二泛素、K11连接的 二泛素和K48连接的二泛素(1μg/泳道)的两倍系列稀释液的结合。考 马斯染色的凝胶(左上小图)提供每种所测试的泛素在凝胶中迁移的 区域的标示。

图15描绘其中单泛素、线性聚泛素2-7(长度为2至7个泛素亚 基)、K48连接的聚泛素2-7(长度为2至7个泛素亚基)、K63连接的 聚泛素2-7(长度为2至7个泛素亚基)和K11连接的聚泛素(1μg每泳 道)用泛-泛素抗体P4D1(中小图)或1F11/3F5/Y102L IgG(右小图)进 行免疫印迹的实验的结果。考马斯染色揭示了样本的组成(左小图)。 示出蛋白质印迹法的长和短暴露。

图16A和16B描绘其中用不同浓度的TNFα和在不同时间量内 用5.8μM MG132处理的HeLa S3细胞的裂解物利用杂交抗体 1F11/3F5/Y102L针对线性泛素链或利用Apu3.A8抗体针对K63连接 的泛素链进行免疫印迹的实验的结果。作为对照，在每个凝胶上运行 各250ng的纯化的线性聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7(图16A)。 为了评估NFκB途径激活的水平，针对IκBα水平对裂解物进行印迹 (图16B)。作为上样对照，针对β-微管蛋白对裂解物进行印迹。

图17描绘利用杂交抗线性聚泛素抗体1F11/3F5/Y102L、同种型 对照或抗K63抗体Apu3.A8的免疫沉淀实验的结果。在三种条件(所 有泛素链、无线性泛素链或仅线性泛素链的混合物)下于4M脲IP缓 冲液中进行IP实验。作为对照，在每个凝胶中运行各1μg的纯化的 线性聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7。

图18A和18B描绘使用线性聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7 的1:1混合物和抗线性聚泛素抗体1F11/3F5/Y102L或抗K63抗体 Apu3.A8在用IF11/3F5/Y102L(抗线性)或Apu3.A8(抗K63)进行免疫 印迹的不同浓度的脲或PBST中的免疫沉淀实验的结果。作为对照， 在每个凝胶中运行各1μg的纯化的线性聚泛素2-7和K63连接的聚 泛素2-7。图18A示出在0M、2M、4M和6M脲中的IP实验的结果。 图18B示出在6M、7M和8M脲中的IP实验的结果。

图19示出使用线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的 聚泛素和K63连接的聚泛素2-7的1:1:1:1混合物和抗线性聚泛素抗 体1F11/3F5/Y102L、同种型对照或与蛋白A珠粒交联的抗K63聚泛 素抗体Apu3.A8在不同浓度的脲中的免疫沉淀和免疫印迹实验的结 果。免疫印迹中使用的抗体为1F11/3F5/Y102L(抗线性)、2A3/2E6(抗 K11)、Apu2.07(抗K48)或Apu3.A8(抗K63)IgG。作为对照，在每个 凝胶上运行各1μg的纯化的线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48 连接的聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7。

图20示出使用线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的 聚泛素和K63连接的聚泛素2-7的1:1:1:1混合物和杂交抗线性聚泛 素抗体1F11/3F5/Y102L、同种型对照或与蛋白G珠粒交联的抗K63 聚泛素IgG抗体Apu3.A8在不同浓度的脲中的免疫沉淀和免疫印迹 实验的结果。免疫印迹中使用的抗体为1F11/3F5/Y102L(抗线性)、 2A3/2E6(抗K11)、Apu2.07(抗K48)或Apu3.A8(抗K63)IgG。作为 对照，在每个凝胶上运行各1μg的纯化的线性聚泛素2-7、K11连接 的聚泛素、K48连接的聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7。

图21A描绘线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的聚 泛素和K63连接的聚泛素2-7的1:1:1:1混合物和抗线性聚泛素抗体 1F11/3F5/Y102L、同种型对照或抗K63聚泛素抗体Apu3.A8在不同 浓度的脲中的免疫沉淀和免疫印迹实验的结果。免疫印迹中使用的抗 体为1F11/3F5/Y102L(抗线性)、2A3/2E6(抗K11)、Apu2.07(抗K48) 或Apu3.A8(抗K63)IgG。作为对照，在每个凝胶上运行各500ng纯 化的线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的聚泛素2-7和 K63连接的聚泛素2-7。

图21B描绘线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的聚 泛素和K63连接的聚泛素2-7的1:1:1:1混合物和杂交抗线性聚泛素 抗体1F11/3F5/Y102L、同种型对照或抗K63聚泛素抗体Apu3.A8在 不同浓度的脲中进行的免疫沉淀实验并且通过SDS-PAGE凝胶进行 分离和经考马斯染色的结果。标示被切除用于质谱术AQUA的区域。

图21C是标示通过质谱术AQUA鉴定的来自在图24B(区域B 和区域C)中所示的和在实施例4D中描述的1F11/3F5/Y102L免疫沉 淀的聚泛素键联的以皮摩尔计的量的图。

图21D是标示通过质谱术AQUA鉴定的来自在图24B(区域B 和区域C)中所示的1F11/3F5/Y102L免疫沉淀的聚泛素链的键联组成 的图。

图21E是标示通过质谱术AQUA鉴定的在1F11/3F5/Y102L免疫 沉淀中回收的线性链的百分比的图。

图22A描绘来自用过表达Hoil-1L和Hoip的质粒或中空载体转 染的293T细胞的裂解物的免疫印迹。如在实施例4E中描述探测印 迹的线性聚泛素、Hoil-1L、Hoip和β-微管蛋白。

图22B描绘来自用过表达Hoil-1L和Hoip的质粒或中空载体转 染的293T细胞的裂解物的免疫沉淀实验的结果。探测免疫印迹的线 性聚泛素或免疫印迹经考马斯染色的。考马斯染色的凝胶上的标示区 域被切除用于质谱术AQUA。

图22C是标示通过质谱术AQUA鉴定的在如图22B中所示的来 自Hoil-1L/Hoip过表达的细胞的1F11/3F5/Y102L免疫沉淀中的聚泛 素键联组成的图。

图22D描绘用过表达Hoil-1L和Hoip的质粒或中空载体转染的 且用抗线性聚泛素抗体1F11/3F5/Y102L染色的HeLa S3细胞的免疫 荧光。5或7个亚基(+)的重组线性聚泛素的添加竞争结合抗线性聚泛 素抗体。

图23描绘在1F11/3F5/Y102L Fab片段和线性二泛素之间形成的 复合物的共晶结构的各种视图。A)1F11/3F5/Y102L在图的底部以卡 通图示出并且线性二泛素在图的顶部在间隙填充的模型内以卡通图 描绘。标示近端和远端泛素亚基和线性键联。B)在与1F11/3F5/Y102L 相互作用的二泛素的表面上以深灰色示出线性二泛素上的表位。具有 至少25%的其隐藏在线性二泛素和1F11/3F5/Y102L的界面上的溶剂 可及表面积和/或在的Fab内的残基由单字母氨基酸代码和残基 数标示。图23B分别以SEQ ID NO379-381公开残基31-37、70-76 和60-63。C)在与二泛素相互作用的Fab的表面上以深灰色示出 1F11/3F5/Y102L Fab上的互补位。具有至少25%的其隐藏在 1F11/3F5/Y102L和二泛素的界面上的溶剂可及表面积和/或在的二泛素内的残基由单字母氨基酸代码和残基数标示。图23C分别 以SEQ ID NO378和377公开残基95-99和52-56。

图24示出在1F11/3F5/Y102L Fab片段和线性二泛素之间形成的 复合物的共晶结构的其它近视图。A)示出由重链的Gln56的侧链与 Gly75和Gly76的主链羰基之间形成的氢键的近视图。以浅灰色示出 二泛素且以深灰色示出Fab。B)轻链的Lys52与来自二泛素的α螺旋 的羧基末端的Asp32和偶极之间的静电相互作用的电势。以浅灰色示 出二泛素且以深灰色示出Fab。C)重链的Leu102与重链的框架1的 Val2和Leu4之间的疏水性相互作用。Leu102在CDR H3的羧基末端。 以浅灰色示出二泛素且以深灰色示出Fab。

本发明实施方案的详述

I.定义

出于本文中的目的，“受体人框架”是包含自人免疫球蛋白框架或 如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域 (VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架 “衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有 氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10个或 更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更 少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中， VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序 列上相同。

“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例 如，抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，否 则如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，抗体 和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y 的亲和力通常可以通过解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域 已知的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于 测量用于结合亲和力的具体的说明性和示例性的实施方案。

“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比在一 个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，此类改变导致 该抗体对抗原的亲和力改善。

本文中使用的“激动剂抗体”是模拟目标多肽的至少一项功能性 活性的抗体。

“拮抗剂抗体”或“阻断性抗体”是抑制或降低其特异性结合的抗 原的生物活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗剂抗体实质性或完全抑 制抗原的生物活性。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包 括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异 性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完 整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、 Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)； 和由抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定中将参照抗体 与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争 测定中将该抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了示 例性的竞争测定。

术语“抗线性连接的聚泛素抗体”和“结合线性连接的聚泛素的抗 体”指能够以足够亲和力结合线性连接的聚泛素，使得该抗体在靶向 线性连接的聚泛素中可作为诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施 方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗线性连接的聚泛 素抗体结合无关的、非线性连接的聚泛素蛋白质的程度小于该抗体与 线性连接的聚泛素的结合的约10%。在某些实施方案中，结合线性连 接的聚泛素的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、 ≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例 如10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗线性连接 的聚泛素抗体结合在来自不同物种的线性连接的聚泛素中保守的线 性连接的聚泛素的表位。

本文中使用的术语“抗聚泛素抗体”指能够特异性结合聚泛素分 子的抗体。

本文中使用的术语“抗泛素抗体”和“抗单泛素抗体”可互换使用， 并且指能够特异性结合泛素分子的抗体。

术语“嵌合”抗体指其中的重链和/或轻链的一部分衍生自特定的 来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种的 抗体。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大 类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分 成亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。与 不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。

本文中使用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起 细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例 如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和 Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、 阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱 (vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星 (doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮 芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制 剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者 细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体； 及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

“病症”指会受益于用本发明抗体治疗的任何疾患。这包括慢性和 急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状 况。本文中要治疗的病症的非限制性例子包括癌症和营养不良 (hypotrophy)病症，包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症。

“效应子功能”指那些可归因于抗体的Fc区且随抗体同种型而变 化的生物活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性 细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细 胞活化。

药剂(例如药物制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实 现期望的治疗或预防结果的量。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中含有恒定区的 至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。 在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸 至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存 在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依 照EU编号系统，又称作EU索引，如描述于Kabat等，Sequences of  Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。

"框架"或"FR"指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地， 可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因而，HVR 和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现： FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用， 指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所 定义的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用， 并且指已经引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包 括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍 生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞 不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞 中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体后代。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞产生的或利用人抗体全集或其 它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基 酸序列的抗体。人抗体的此定义明确地排除包含非人抗原结合残基的 人源化抗体。

“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最 常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选 集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of  Proteins of Immunological Interest,第五版，NIH Publication91-3242, Bethesda MD(1991),第1-3卷的亚组。在一个实施方案中，对于VL， 亚组是如Kabat等(见上文)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH， 亚组是如Kabat等(见上文)中的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR 的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至 少一个，并且通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有 HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR 对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以包含衍生自人抗体的 抗体恒定区的至少一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已 经经历人源化的抗体。

本文中使用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上 高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然 的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在 VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定 区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性的和/或牵涉抗原 识别。示例性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、 91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。(Chothia和Lesk,J.Mol. Biol.196:901-917(1987).)。示例性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR -L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、 L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102。 (Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版 Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991).)。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基 酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的 残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。示例 性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2 和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、 H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102(参见Almagro和Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633(2008).)。除非另有指示，否则可变域中的 HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等(见上文) 编号。

“免疫偶联物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂 偶联的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动 物(例如，牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸 如猴)、家兔、和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中， 个体或受试者是人。

“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实 施方案中，抗体纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳(例 如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交 换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见 例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离 的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分 子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。

“编码抗线性连接的聚泛素抗体的分离的核酸”指编码抗体重链 和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体 中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核 酸分子。

本文中使用的术语“线性连接的聚泛素”和“C端至N端连接的聚 泛素”可互换使用，并且指在一个泛素部分的C-末端(例如，C端甘氨 酸)与另一个泛素部分的N端α-氨基(例如，N端蛋氨酸)之间包含至 少一个异肽键的聚泛素分子。

本文中使用的“赖氨酸键联”标示在一个泛素部分与另一个泛素 部分之间的牵涉赖氨酸残基(例如，K6、K11、K27、K29、K33、K48 和/或K63)的键联。

本文中使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获 得的抗体，即，构成群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位， 除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的产生期间发 生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针 对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗 体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语 “单克隆”指示抗体获自抗体的基本上同质群的抗体的特性，而不应解 释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过多种技术来 制备要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重 组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或部分人免疫球蛋白 基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于制备单克隆抗体的此 类方法和其它示例性方法。

“裸抗体”指未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记物 偶联的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例 如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物 键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重 链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个 恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具 有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定 轻(CL)域。根据其恒定域的氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中 的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“包装说明书”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的说 明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施 用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对 序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任 何保守取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列 中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序 列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如 使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的 合适参数，包括在所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然 而，为了本文的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机 程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech， Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局，华 盛顿市,20559，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自 加利福尼亚州南旧金山的Genentech，Inc.可获得ALIGN-2程序，或 者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统， 包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序 设定且不变。

在其中采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基 酸序列A相对于(to)、与(with)或针对(against)给定氨基酸序列B的% 氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与或针对给定 氨基酸序列B的特定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下 计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评 分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。 应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等， 则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基 酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有%氨基酸序 列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“药物制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成 分的生物活性是有效的，且不含对会施用制剂的受试者具有不可接受 的毒性的另外的组分的制剂。

“药学上可接受的载体”指药物制剂中与活性成分不同的，且对受 试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、 稳定剂或防腐剂。

本文中使用的术语“聚泛素”定义为所有种类的天然人的和合成 的泛素聚合链，其属于泛素的不同聚合键联的人的和合成的类别，包 括但不限于，线性聚泛素、K6连接的聚泛素、K11连接的聚泛素、 K27连接的聚泛素、K29连接的聚泛素、K33连接的聚泛素、K48连 接的聚泛素和K63连接的聚泛素。聚泛素可以是任何长度的，且包 括至少两个泛素部分。

本文中使用的“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个 体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过 程期间进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、 减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾 病进展速率、改善或减轻疾病状态和消退或改善的预后。在一些实施 方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

在一些实施方案中，本发明本文中使用的术语“泛素”和“单泛素” 可互换使用，并且指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长 类(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然泛素，除非另 有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的泛素以及细胞中的加工所产生 的泛素的任何缩短或翻译后修饰形式，由多个泛素部分构成的分子除 外。该术语还涵盖泛素的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。 一种示例性人泛素的氨基酸序列示于SEQ ID NO:97: MQIFVTLTGKTITLEVEPSDTIENVAIQDEGIPPDQQRLIFA GQLEDGRTLSDYNIQESTLHLVLRLRGG(SEQ IV NO:97)。泛 素具有氨基酸6、氨基酸11、氨基酸27、氨基酸29、氨基酸33、氨 基酸48、和/或氨基酸63处的至少一个赖氨酸残基(在上文SEQ ID NO: 97中以粗体标示)。

本文中使用的术语“泛素途径”指细胞中的或在体外重建的、包括 泛素和/或聚泛素的生化途径。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中参与抗体与抗原结 合的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有 类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区 (HVR)。(参见例如，Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman  and Co.,第91页(2007).)。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合 特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛 选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如， Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352:624-628(1991)。

本文中使用的术语“载体”指能够使与其连接的另一种核酸增殖 的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合进接 受其引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操 作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

II.组合物和方法

一方面，本发明部分基于能够特异性识别含有第一聚泛素键联的 第一聚泛素分子但不特异性结合含有第二聚泛素键联的第二聚泛素 分子的抗体的创建。在某些实施方案中，提供特异性结合线性聚泛素 或C端至N端连接的聚泛素的抗体。本发明的抗体既可用于研究， 又可用于例如诊断或治疗例如涉及异常细胞周期进展的疾病和病症。

本发明的抗线性聚泛素抗体的独特特性使得它们特别可用于区 分细胞系统中不同连接形式的聚泛素，而不需要求助于麻烦且昂贵的 基因操作或生物物理方法诸如质谱术。本发明的抗线性连接的聚泛素 抗体可用于在体外和在体内表征特定线性聚泛素的功能和活性。本发 明的抗线性连接的聚泛素抗体还可用于确定特定线性聚泛素在疾病 的发展和发病机理中的作用。本发明的抗线性连接的聚泛素抗体还可 用于治疗其中一种或多种特定线性聚泛素受到异常调节或功能发挥 异常的疾病，而不会干扰抗聚泛素抗体对其不特异的聚泛素的正常活 性。

已描述了泛素系统参与NFκ-B途径。Karin等，Nature Rev. Immunol.5:749-759(2005)和Chen,Z.J.,Nature Cel Biol.7:758-765 (2005)。已显示促炎细胞因子对细胞的刺激导致RIP1和NEMO蛋白 质的K63连接的聚泛素化，这导致IκB激酶(IKK)的激活。Tokunaga 等，Nature Cell Biol.11:123-132(2009)。IKK然后用K48连接的聚泛 素进行聚泛素化且随后分解，导致NFκ-B的激活。同上。最近，也 显示LUBAC经由NFκ-B的线性聚泛素化激活NFκ-B途径而不是JNK 途径。同上。NF-κB也在细胞增殖和细胞周期中发挥作用。很多癌症 展现出NF-κB的异常激活并且对NF-κB的遏抑则遏抑癌症细胞增殖。 Garg和Aggarwal,Leukemia16:1053–68(2002)。线性连接的聚泛素在 蛋白质诸如NF-κB上的存在在调节NF-κB活性和细胞周期进展中发 挥重要的作用。因此，本发明的抗体和Fab提供有用的治疗手段来调 节其中细胞周期调控异常的病症和疾病状态。在一个实施方案中，本 发明的抗线性聚泛素抗体用于治疗其中细胞周期进展异常上调，导致 细胞分裂太多的疾病和病症，诸如癌症。在另一个实施方案中，本发 明的抗线性连接的聚泛素抗体用于治疗其中细胞周期进展异常下调， 导致细胞分裂太少和伴随消瘦或组织破坏的疾病和病症。此类疾病的 例子包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症(包括但不限于 Charcot MarieTooth综合征、脊髓灰质炎、肌萎缩性侧索硬化和格林- 巴利综合征(Guillain-Barre syndrome))。

本文中使用的术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定 程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病 症是癌症。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/ 增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例 如，霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤和 白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小 细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、阑尾 癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver  cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠 癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴 癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增生性病 症、及各种类型的头和颈癌。

术语“肿瘤”在本文中使用时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和 增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性 细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症” 和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“变性肌肉病症”指或描述含肌肉动物中典型特征为骨骼肌 和/或平滑肌衰退或弱化使得正常肌肉功能降低的生理疾患。变性肌 肉病症的例子包括但不限于肌营养不良、强直性肌营养不良、先天性 肌强直病、恶病质、肌肉减少症(sarcopenia)、多发性硬化、肌萎缩性 侧索硬化、艾萨克(Isaac)氏综合征、僵人综合征、家族性周期性麻痹 (familiar periodic paralyses)、肌病、肌强直、横纹肌溶解、肌肉萎缩 和各种类型的肌肉无力和肌肉强直。

术语“变性神经病症”指或描述含神经动物中典型特征为神经组 织退化或神经组织的细胞间通信退化的生理疾患。变性神经病症的例 子包括但不限于神经变性疾病(包括但不限于路易体疾病(Lewy body  disease)、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小 脑萎缩、帕金森(Parkinson)氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、 格林-巴利综合征、Carcot Marie Tooth综合征、纹状体黑质变性、由 tau病变引起或与tau病变有关的和神经细胞/组织破坏、朊病毒病、 延髓性麻痹、运动神经元疾病、痴呆和神经系统异型变性疾病(包括 但不限于卡纳万(Canavan)病、亨廷顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积 症、亚历山大(Alexander)氏病、图雷特(Tourette)氏综合征、Menkes 卷发综合征、科凯恩(Cockayne)综合征、Halervorden-Spatz综合征、 拉福拉(lafora)病、Rett综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征 和Unverricht-Lundborg综合征)。

另一方面，本发明的抗线性连接的聚泛素抗体可用作试剂来检测 和分离线性连接的聚泛素，诸如检测各种细胞类型和组织中的聚泛 素，包括测定聚泛素密度和在细胞群中和给定细胞内的分布，和基于 聚泛素的存在或量的细胞分选。在又一个方面，本发明的抗线性连接 的聚泛素抗体可用于开发具有与本发明主题抗体相似的阻断活性模 式的聚泛素拮抗剂。又例如，本发明的抗线性连接的聚泛素抗体可用 于鉴定与本文中例示的抗体结合聚泛素上基本上相同的抗原决定簇 (包括线性和构象表位)的其它抗聚泛素抗体。

本发明的抗线性连接的聚泛素抗体可用于基于涉及聚泛素的 生理途径的测定，以筛选线性连接的聚泛素功能的小分子拮抗剂。例 如，由于已知线性连接的聚泛素链对于NFκB激活是必要的(Tokunaga 等，Nature Cell Biol.11:123-132(2009))，因此可以将抗线性连接的聚 泛素抗体调节(上调或下调)经处理的细胞或组织中NFκB激活的活性 与线性连接的聚泛素的一种或多种潜在小分子拮抗剂在调节NFκB 激活中的活性比较。

A.示例性的抗线性连接的聚泛素抗体

一方面，本发明提供结合线性连接的或C端至N端连接的聚泛 素的分离的抗体。在某些实施方案中，抗线性连接的聚泛素抗体特异 性结合C端至N端连接的聚泛素，但不特异性结合单泛素。在某些 实施方案中，抗线性连接的聚泛素抗体特异性结合C端至N端连接 的聚泛素，但不特异性结合具有赖氨酸键联(即，K6-、K11-、K27-、 K29-、K33-、K48-和/或K63-键联)的聚泛素。

一方面，本发明提供包含HVR-H1区的抗线性连接的聚泛素抗 体，该HVR-H1区包含SEQ ID NO:7、10、13、16、22和73-81中 的至少一个的序列。一方面，本发明提供包含HVR-H2区的抗体， 该HVR-H2区包含SEQ ID NO:8、11、14、17、23、24和82-86中 的至少一个的序列。一方面，本发明提供包含HVR-H3区的抗体， 该HVR-H3区包含SEQ ID NO:9、12、15、18和87-93中的至少一 个的序列。

一方面，本发明提供包含HVR-H1区和HVR-H2区的抗体，该 HVR-H1区包含SEQ ID NO:7、10、13、16、22和73-81中的至少 一个的序列，且该HVR-H2区包含SEQ ID NO:8、11、14、17、23、 24和82-86中的至少一个的序列。一方面，本发明提供包含HVR-H1 区和HVR-H3区的抗体，该HVR-H1区包含SEQ ID NO:7、10、13、 16、22和73-81中的至少一个的序列，且该HVR-H3区包含SEQ ID  NO:9、12、15、18和87-93中的至少一个的序列。一方面，本发明 提供包含HVR-H2区和HVR-H3区的抗体，该HVR-H2区包含SEQ ID  NO:8、11、14、17、23、24和81-85中的至少一个的序列，且该HVR-H3 区包含SEQ ID NO:9、12、15、18和86-92中的至少一个的序列。

一方面，本发明提供包含HVR-L1区的抗体，该HVR-L1区包含 SEQ ID NO:1、4、19和50-57中的至少一个的序列。一方面，本发 明提供包含HVR-L2区的抗体，该HVR-L2区包含SEQ ID NO:2和 58-62中的至少一个的序列。一方面，本发明提供包含HVR-L3区的 抗体，该HVR-L3区包含SEQ ID NO:3、5、6、20、21和64-72中 的至少一个的序列。

一方面，本发明提供包含HVR-L1区和HVR-L2区的抗体，该 HVR-L1区包含SEQ ID NO:1、4、19和50-57中的至少一个的序列， 且该HVR-L2区包含SEQ ID NO:2和58-63中的至少一个的序列。 一方面，本发明提供包含HVR-L1区和HVR-L3区的抗体，该HVR-L1 区包含SEQ ID NO:1、4、19和50-57中的至少一个的序列，且该 HVR-L3区包含SEQ ID NO:3、5、6、20、21和64-72中的至少一个 的序列。一方面，本发明提供包含HVR-L2区和HVR-L3区的抗体， 该HVR-L2区包含SEQ ID NO:2和58-63中的至少一个的序列，且 该HVR-L3区包含SEQ ID NO:3、5、6、20、21和64-72中的至少 一个的序列。

一方面，本发明提供一种抗体，其包含下述至少一项、至少两 项、至少三项、至少四项、至少五项或所有六项：

(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:7、10、13、16、22和73-81 中的至少一个序列；

(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:8、11、14、17、23、24 和82-86中的至少一个序列；

(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:9、12、15、18和87-93 中的至少一个序列；

(iv)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:1、4、19和50-57中的 至少一个序列；

(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:2和58-63中的至少一个 序列；和

(vi)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:3、5、6、20、21和64-72 中的至少一个序列。

一方面，本发明提供一种抗体，其以高亲和力特异性结合线性连 接的聚泛素，但以实质性降低的亲和力结合具有一些其它赖氨酸键联 的聚泛素，该抗体包含下述至少一项、至少两项、至少三项、至少四 项、至少五项或所有六项：

(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:7、10、13、16、22和73-81 中的至少一个序列；

(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:8、11、14、17、23、24 和82-86中的至少一个序列；

(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:9、12、15、18和87-93 中的至少一个序列；

(iv)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:1、4、19和50-57中的 至少一个序列；

(v)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:2和58-63中的至少一个 序列；和

(vi)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:3、5、6、20、21和64-72 中的至少一个序列。

一方面，本发明提供包含如图2B、5B或9B中所示的重链HVR 序列的抗体。在一个实施方案中，所述抗体包含如图2A、5A或9A 中所示的轻链HVR序列。在一个实施方案中，所述抗体包含如图2B、 5B或9B中所示的重链HVR序列和如图2A、5A或9A中所示的轻 链HVR序列。在一个实施方案中，所述抗体包含如表5和7中所示 的轻链HVR序列。在一个实施方案中，本发明提供包含如表5和7 中所示的重链HVR序列的抗体。在一个实施方案中，所述抗体包含 如表5和7中所示的重链HVR序列和如表5和7中所示的轻链HVR 序列。

本发明的抗体的一些实施方案包含如下文SEQ ID NO:98中所 示的人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(Genentech,Inc., South San Francisco,CA,USA)(也见美国专利号6,407,213和Lee等， J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93)的轻链可变域。

1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser GlnValAla Val AlaTrp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser AlaSerLeu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly SerSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：98)(HVR残基是加下划线的)

在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变域序列在位置28、 30、31、53、66和91(分别如上文以粗体／斜体标示的A sp、Asn、Thr、 Phe、Arg和His)的一个或多个位置处被修饰。在一个实施方案中， 修饰的huMAb4D5-8序列在位置28包含Ser，在位置30包含Ser， 在位置31包含Ser，在位置53包含Ser，在位置66包含Gly，和／或 在位置91包含Tyr。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含含 有下文SEQ ID NO：99所示序列的轻链可变域：

1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys ArgAla Ser GlnValAla Val AlaTrp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile TyrSer AlaSerLeu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly SerSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys107(SEQ ID NO：99)(HVR残基是加下划线的)

相对于huMAb4D5-8，取代的残基如上以粗体／斜体标示。

本发明的抗体可包含任何合适的框架可变域序列，前提条件是基 本上保留了对线性连接的聚泛素的结合活性。例如，在一些实施方案 中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的 一个实施方案中，框架共有序列包含在位置71、73、78和／或102处 的取代。在这些抗体的一些实施方案中，位置71是A，位置73是T， 位置78是A和/或位置102是L。在一个实施方案中，这些抗体包含 huMAb4D5-8(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA, USA)(也见美国专利号6,407,213&5,821,337，和Lee等，J.Mol.Biol. (2004),340(5):1073-93)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中， 这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在一个实施方案中， 这些抗体包含SEQ ID NO:1-6、19-21和50-72中至少一个、两个或 所有的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含美国专利 号6,407,213&5,821,337中所描述的huMAb4D5-8的轻链HVR序列。 在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(SEQ ID NO:98和 99)(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA) (也见美国专利号6,407,213&5,821,337，和Lee等，J.Mol.Biol.(2004), 340(5):1073-93)的轻链可变域序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体是亲和力成熟的，以获得期望 的靶结合亲和力。在一个例子中，本发明的以高亲和力特异性结合线 性连接的聚泛素但以实质性降低的亲和力结合具有赖氨酸键联的聚 泛素的亲和力成熟抗体包含HVR-H1氨基酸位置32处的取代。在另 一个例子中，本发明的以实质性降低的亲和力特异性结合具有赖氨酸 键联的线性连接的聚泛素的亲和力成熟抗体包含HVR-H2氨基酸位 置50、54和/或56处的取代。在另一个例子中，本发明的以实质性 降低的亲和力特异性结合具有赖氨酸键联的线性连接的聚泛素的亲 和力成熟抗体包含HVR-H3氨基酸位置103处的取代。在另一个例 子中，本发明的以高亲和力特异性结合线性连接的聚泛素但以实质性 降低的亲和力结合具有其它赖氨酸键联的聚泛素的亲和力成熟抗体 包含HVR-L1氨基酸位置28、30、31和/或32处的取代。在另一个 例子中，本发明的以高亲和力特异性结合线性连接的聚泛素但以实质 性降低的亲和力结合具有其它赖氨酸键联的聚泛素的亲和力成熟抗 体包含HVR-L3氨基酸位置92、93和/或94处的取代。在另一个例 子中，本发明的以高亲和力特异性结合线性连接的聚泛素但以实质性 降低的亲和力结合具有其它赖氨酸键联的聚泛素的亲和力成熟抗体 包含HVR-L2氨基酸位置52处的取代。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:29-32、 36-38、95和196-198中的至少一个重链可变域序列。在一个实施方 案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:25-28、33-35、94和193-195 中的至少一个轻链可变域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含含 有SEQ ID NO:29-32、36-38、95和196-198中的至少一个序列的重 链可变域并且还包含含有SEQ ID NO:25-28、33-35、94和193-195 中的至少一个序列的轻链可变域。在其它实施方案中，与特定克隆编 号对应的本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含图2B、 5B或9B中对该克隆编号所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。 在其它实施方案中，与特定克隆编号对应的本发明的抗体包含轻链可 变域，该轻链可变域包含图2A、5A和9A中对该克隆编号所示的 HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。在其它实施方案中，与特定克 隆编号对应的本发明的抗体包含含有图2B、5B或9B中对该克隆编 号所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变域并且还包 含含有图2A、5A和9A中对该克隆编号所示的HVR-L1、HVR-L2 和HVR-L3序列的轻链可变域。

一方面，本发明提供一种抗体，其与任何前述抗体竞争结合线性 连接的聚泛素。一方面，本发明提供一种抗体，其结合线性连接的聚 泛素上与任何前述抗体相同的抗原决定簇。

如本文中所示，本发明的抗体特异性结合具有C端至N端键联 的分离的聚泛素。如本文中所示，在聚泛素附着于异源蛋白质时，本 发明的抗体还特异性结合具有线性C端至N端键联的聚泛素。

在任何上述实施方案中，抗线性连接的聚泛素抗体人源化的。在 一个实施方案中，抗线性连接的聚泛素抗体包含任何上述实施方案中 的HVR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共 有框架。在另一个实施方案中，抗线性连接的聚泛素抗体包含任何上 述实施方案中的HVR，且进一步包含VH，该VH包含SEQ ID NO: 29-32、36-38和95中的任一个的FR1、FR2、FR3或FR4序列。在 另一个实施方案中，抗线性连接的聚泛素抗体包含任何上述实施方案 中的HVR，并且进一步包含VL，该VL包含SEQ ID NO:25-28、33-35、 94和193-195中的任一个的FR1、FR2、FR3或FR4序列。

另一方面，抗线性连接的聚泛素抗体包含与SEQ ID NO:29-32、 26-38、95和196-198中的任一个的氨基酸序列具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一 性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列 相对于参照序列含有取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但是包 含该序列的抗线性连接的聚泛素抗体保留结合线性连接的聚泛素的 能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:29-32、36-38、95和196-198 中的任一个中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某 些实施方案中，取代、插入或缺失存在于HVR以外的区域(即，在 FR中)。任选地，抗线性连接的聚泛素抗体包含SEQ ID NO:29-32、 36-38、95和196-198中的任一个的VH序列，包括该序列的翻译后 修饰。

另一方面，提供抗线性连接的聚泛素抗体，其中所述抗体包含与 SEQ ID NO:25-28、33-35、94和193-195中的任一个的氨基酸序列 具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具 有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如，保守取代)、插入 或缺失，但是包含该序列的抗线性连接的聚泛素抗体保留结合线性连 接的聚泛素的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:25-28、33-35、 94和193-195中的任一个中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/ 或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失存在于HVR以外的 区域(即，在FR中)。任选地，抗线性连接的聚泛素抗体包含SEQ ID  NO:25-28、33-35、94和193-195中的任一个的VL序列，包括该序 列的翻译后修饰。

另一方面，提供抗线性连接的聚泛素抗体，其中所述抗体包含上 文提供的任何实施方案中的VH，以及上文提供的任何实施方案中的 VL。在一个实施方案中，所述抗体分别包含SEQ ID NO:29-32、36-38、 95和196-198中的任一个的VH序列以及SEQ ID NO:25-28、33-35、 94和193-195中的任一个的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在本发明的又一个方面，根据任何以上实施方案的抗线性连接的 聚泛素抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一个实施 方案中，抗线性连接的聚泛素抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、 scFv、双链抗体(diabody)或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体 是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或本文中定义的其它抗体类或同 种型。

提供组合物，其包含至少一种抗线性连接的聚泛素抗体或包含编 码抗线性连接的聚泛素抗体的序列的至少一种多核苷酸。在某些实施 方案中，组合物可以是药物组合物。如本文中使用的，组合物包含结 合一种或多种聚泛素的一种或多种抗体和/或包含编码结合一种或多 种聚泛素的一种或多种抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合 物可进一步包含合适的载体，诸如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲 剂，它们是本领域公知的。

在又一个方面，根据任何以上实施方案的抗线性连接的聚泛素抗 体可单一地或组合地掺入下文第1-7节中描述的任何特征：

1.抗体亲和力

在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、 ≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更少， 例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定所述用Fab型式的目 标抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量的。通 过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗 原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕获结合的抗原来测量Fab对 抗原的溶液结合亲和力(参见例如，Chen等，J.Mol.Biol. 293:865-881(1999))。为了建立测定的条件，将多孔板 (Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获用抗Fab 抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白 于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100 pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目标Fab的系列稀释液(例如，与Presta等， Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一 致)混合。然后将目标Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例 如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板，于 室温温育(例如，1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1%聚山梨 醇酯20洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液 (MICROSCINT-20^TM；Packard)，然后在TOPCOUNT ^TM伽马计数器 (Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结 合之20%的浓度用于竞争性结合测定。

根据另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定使用 或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ) 于25℃使用例如固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量 的。简言之，根据供应商的说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)- 碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚 糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约 10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以 封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流 速在含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST) 中注入Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单一对一 朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software3.2版) 通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。 平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如，Chen等，J.Mol.Biol. 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定，结合速率 超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分 光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系 列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯 的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH7.2中20nM 抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝ 340nm，16nm带通)的升高或降低。正如本领域普通技术人员会理解 的，也容易获得用于靶抗原对芯片表面的其它偶联化学(例如，链霉 亲合素/生物素、疏水性相互作用或二硫化物化学)来代替上文所述的 胺偶联方法(CM5芯片)。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包 括但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段，及下 文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat. Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün， 于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和 Moore编，(Springer-Verlag,New York)，第269-315页(1994)；还参见 WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救 受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片 段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双链抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的 或双特异性的。参见例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等， Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体也描述于Hudson等，Nat. Med.9:129-134(2003)。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻 链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体 (Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如，美国专利号6,248,516B1)。

如本文中所描述的，可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗 体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的产生 来制备抗体片段。

3.嵌合的和人源化的抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗 体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可 变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔或非人灵长类，诸如猴 的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类别转换的” 抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括 其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体 人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲 和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例 如，CDR(或其部分)衍生自非人抗体，而FR(或其部分)衍生自人抗 体序列。任选地，人源化抗体还会包含人恒定区的至少一部分。在一 些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例 如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体 特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front. Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步描述于例如Riechmann等， Nature332:323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321 和7,087,409；Kashmiri等，Methods36:25-34(2005)(描述了SDR (a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修 表面”)；Dall’Acqua等，Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)； 以及Osbourn等，Methods36:61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer, 83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合 (best-fit)”方法选择的框架区(参见例如，Sims等J.Immunol.151:2296 (1993))；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的 框架区(参见例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285 (1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞 突变的)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Front. Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(参见 例如，Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等， J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领 域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体描述于van Dijk 和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg, Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动 物已经修饰为响应抗原性攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的 完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替 换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物 的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因 座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg, Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利号6,075,181 和6,150,584，其描述了XENOMOUSE^TM技术；美国专利号5,770,429， 其描述了技术；美国专利号7,041,870，其描述了K-M 技术，和美国专利申请公布号US 2007/0061900，其描述了 技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰 来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于产生 人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(参见例如， Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody  Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker, Inc.,New York,1987)；和Boerner等，J.Immunol.,147:86(1991).)。 经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括描述于例如美国 专利号7,189,826(描述了自杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和 Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)的那 些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein, Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和 Brandlein,Methods和Findings in Experimental and Clinical  Pharmacology,27(3):185-91(2005)。

也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域 序列产生人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组 合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

5.文库衍生的抗体

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来 分离本发明的抗体。例如，用于产生噬菌体展示文库并对此类文库筛 选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法 综述于例如Hoogenboom等，Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien等编，Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步描述于例 如McCafferty等，Nature348:552-554；Clackson等，Nature352: 624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks 和Bradbury，Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编，Human  Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)； Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl. Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol. Methods284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚 合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对 所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如描述于Winter等，Ann.Rev. Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以 Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的 高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如，自人)克隆 天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对大范围的非自身和还 有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等，EMBO J,12:725-734 (1993)描述。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段， 并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外 实现重排来合成制备天然文库(naive library)，如由Hoogenboom和 Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人抗体噬菌体文 库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公布号 2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、 2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或 人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双 特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的 单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对线性连接的聚 泛素，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗 体可以结合线性连接的聚泛素的两个不同表位。也可以使用双特异性 抗体来将细胞毒剂定位于表达线性连接的聚泛素的细胞。双特异性抗 体可以制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的 两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello, Nature305:537(1983)),WO93/08829，以及Traunecker等，EMBO J. 10:3655(1991))和“突起-入-空穴(knob-in-hole)”工程化(参见例如，美 国专利号5,731,168)。也可以通过以下方法制备多特异性抗体：用于 制备抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如，美国专 利号4,676,980，和Brennan等，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸 拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等，J.Immunol., 148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗 体”技术(参见例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等， J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如在例如Tutt等J.Immunol.147: 60(1991)中描述的制备三特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化 改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段还包括包含结合线性连接的聚泛素及另一 种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如 US2008/0069820)。

7.抗体变体

在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。 例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以 通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来 制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列 内的残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代 的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特 征，例如，抗原结合。

a)取代、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸取代的抗体变 体。用于取代诱变的目标位点包括HVR和FR。保守取代在表1中在 “保守取代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“示例性取代”的 标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将 氨基酸取代引入目标抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留 /改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

表1

初始残基 示例性取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln Asp(D) Glu；Asn Glu Cys(C) Ser；Ala Ser Gln(Q) Asn；Glu Asn Glu(E) Asp；Gln Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val；Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取的残基：Gly、Pro；

(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代会需要用这些类别之一的成员取代另一个类别的。

一类取代变体牵涉取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个 或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲 本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如，改善)(例如升高的亲和 力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。 示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体 展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地产生。 简言之，使一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展 示，并对其筛选特定的生物活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。 可以对HVR“热点(hotspot)”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经 历突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol. 207:179-196(2008))，和/或对SDR(a-CDR)作出此类变化，其中对所 得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择 进行的亲和力成熟已经描述于例如Hoogenboom等，Methods in  Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编，Human Press,Totowa,NJ, (2001).)。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易 错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)中的任何一种将多样性引入 为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴 定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉 HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随 机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结 合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生取代、插入 或缺失，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可 以对HVR做出保守变化(例如，如本文中提供的保守取代)，其不实 质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在 上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未 改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸取代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法 称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science，244： 1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电 荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)鉴定，并用中性或带负电荷 的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作 用是否受到影响。可以在对初始取代表明功能敏感性的氨基酸位置引 入进一步的取代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴 定抗体与抗原间的接触点。作为取代的候选，可以靶向或消除此类接 触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残 基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列 内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗 体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT) 或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖 基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个 糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或去除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变附着于其的碳水化合物。 由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双链寡糖 (biantennary oligosaccharide)，其一般通过N-键联附着于Fc区的CH2 域的Asn297。参见例如，Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖 可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、 半乳糖和唾液酸，以及附着于双链寡糖结构“茎干”中的GlcNAc的岩 藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创 建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或 间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻 糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通 过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘 露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩 藻糖的量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如描述于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约位置297(Fc区残基的Eu 编号)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列 变化而位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即，在位置294和 位置300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。 参见例如，美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的” 或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108； WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704； US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742； WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)； Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖 基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO 细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利 申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams 等，尤其在实施例11中)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移 酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki等Biotech. Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688 (2006)；和WO2003/085107)。

进一步提供了具有二等分型寡糖的抗体变体，例如，其中附着于 抗体Fc区的双链寡糖是通过GlcNAc进行二等分的。此类抗体变体 可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体 的例子描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号 6,602,684(Umana等)；和US2005/0123546(Umana等)。还提供了在 附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗 体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764 (Raju,S.)。

c)Fc区变体

在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提 供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一 个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例 如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应子功能 的抗体变体，所述效应子功能使其成为用于如下应用的期望候选物， 其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和 ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定 以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体 (FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活 性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞NK细 胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在 Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上 的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估目标分子的ADCC活 性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362(参见例 如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和 Hellstrom,I等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)； 5,821,337(参见Bruggemann,M.等，J.Exp.Med.166:1351-1361 (1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞 术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(Cell Technology,Inc.Mountain  View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison, WI)。对于此类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天 然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内例如在动物模型(诸如公开 于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)的动物模 型)中评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认 抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了 评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等， J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等，Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来进行FcRn 结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，Petkova,S.B.等，Int’l. Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、 270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号 6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297 和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297 取代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体(参见 例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields等，J.Biol. Chem.9(2):6591-6604(2001).)。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多 处氨基酸取代，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU 编号)处的取代的Fc区。

在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善 的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如描 述于美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等J.Immunol. 164:4178-4184(2000)。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗 体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责 将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)和Kim 等，J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区与 FcRn结合的一处或多处取代的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基 238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、 356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或 多处具有取代，例如，Fc区残基434的取代的那些(美国专利号 7,371,826)。

还可参见Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利 号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351(其涉及Fc区 变体的其它例子)。

d)半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能期望创建半胱氨酸工程化改造的抗体， 例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。 在具体的实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用 半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位 点，并且可以用于将抗体与其它部分，诸如药物部分或接头-药物部 分偶联，以创建免疫偶联物，如本文中进一步描述的。在某些实施方 案中，可以用半胱氨酸取代下列残基中的任一个或多个：轻链的 V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU 编号)。可以如例如美国专利号7,521,541所述产生半胱氨酸工程化改 造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本 领域已知的且易于获得的额外非蛋白质性质部分。适合于抗体衍生化 的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包 括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、 葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三 噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚 糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧 乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。 由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合 物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体上 的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一种聚合物，那么它们 可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍 生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特 性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性 加热的非蛋白质性质部分的偶联物。在一个实施方案中，非蛋白质性 质部分是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102: 11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对 普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质部分加热至邻近抗体-非蛋 白质性质部分的细胞被杀死的温度的波长。

B.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如描述于美国专 利号4,816,567。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗 线性连接的聚泛素抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体的 VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/ 或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种 载体(例如，表达载体)。在又一实施方案中，提供了包含此类核酸的 宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下 列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的 氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载 体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所 述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实 施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴 样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制 备抗线性连接的聚泛素抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗 体的条件下培养包含编码如上文提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且 任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。

对于抗线性连接的聚泛素抗体的重组产生，将编码抗体(例如如 上文所描述的)的核酸分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细 胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序将此类核酸容易地分 离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针 能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因)。

用于克隆或表达抗体编码载体的合适的宿主细胞包括本文中所 描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是在不 需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表 达，参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523(还可参 见Charlton,Methods in Molecular Biology,248卷(B.K.C.Lo编， Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述了抗体片段 在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌 细胞糊(细胞团糊)分离，并可以进一步纯化。

除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是用于抗体编码 载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致 产生具有部分或完全人的糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见 Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等，Nat.Biotech. 24:210-215(2006)。

用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无 脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。 已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用 于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如，美国专利号 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(其描述了用 于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生 长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其 它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293 细胞，如描述于例如Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼年仓 鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如描述于例如 Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴 肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法 罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如描述于例如Mather 等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；和FS4细 胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞， 包括DHFR-CHO细胞(CHO)(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合 于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和 Wu,Methods in Molecular Biology,248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press, Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。

C.测定

可以通过本领域中已知的多种测定对本文中提供的抗线性连接 的聚泛素抗体鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物活性。

1.结合测定和其它测定

一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的 方法诸如ELISA、蛋白质印迹等来进行。

另一方面，可使用竞争测定来鉴定与例如任何Fab或本文中所述 的抗体诸如1E3、1D8、1F4、1A10、1D8.3C2、1D8.3F8.1D8.4F5、 1F11、2A2、2C11、2H5、3E4、4C9、4E4、4G7、3F5、3A7和4C10 或本文中所述的杂交抗体例如4E4/T110A、4C9/T110A、4G7/Y102G、 1F11/3F5、1F11/3E4.1F11/4G7、2C11/3E4、2C11/3F5、2C11/4G7、 2H5/3E4、2H5/3F5、2H5/4G7、1F11/3F5/Y102L竞争结合线性连接的 聚泛素的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与用于结合 线性连接的聚泛素的任何Fab或本文中所述的抗体诸如1E3、1D8、 1F4、1A10、1D8.3C2、1D8.3F8.1D8.4F5、1F11、2A2、2C11、2H5、 3E4、4C9、4E4、4G7、3F5、3A7和4C10或本文中所述的杂交抗体 例如4E4/T110A、4C9/T110A、4G7/Y102G、1F11/3F5、1F11/3E4. 1F11/4G7、2C11/3E4、2C11/3F5、2C11/4G7、2H5/3E4、2H5/3F5、 2H5/4G7、1F11/3F5/Y102L所结合的表位相同的表位(例如，线性或 构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细示例性方法提供于 Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular  Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。

在一种示例性竞争测定中，在包含结合线性连接的聚泛素的第一 标记抗体(例如，用于结合线性连接的聚泛素的抗体1E3、1D8、1F4、 1A10、1D8.3C2、1D8.3F8.1D8.4F5、1F11、2A2、2C11、2H5、3E4、 4C9、4E4、4G7、3F5、3A7和4C10或杂交抗体4E4/T110A、4C9/T110A、 4G7/Y102G、1F11/3F5、1F11/3E4.1F11/4G7、2C11/3E4、2C11/3F5、 2C11/4G7、2H5/3E4、2H5/3F5、2H5/4G7、1F11/3F5/Y102L)和第二 未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争与线性连接的聚泛素的结合的 能力)的溶液中温育固定化线性连接的聚泛素。第二抗体可存在于杂 交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但不包含第二未标记 抗体的溶液中温育固定化线性连接的聚泛素。在允许第一抗体结合线 性连接的聚泛素的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与 固定化线性连接的聚泛素缔合的标记物的量。如果测试样本中与固定 化线性连接的聚泛素缔合的标记物的量相对于对照样本实质性降低， 那么这指示第二抗体与第一抗体竞争结合线性连接的聚泛素。参见 Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual14章(Cold  Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

2.活性测定

一方面，提供了用于鉴定具有生物活性的抗线性连接的聚泛素抗 体的测定。生物活性可包括例如调节细胞或组织中线性连接的聚泛素 化的蛋白质的降解速率，及调节细胞的细胞周期进展速率。还提供了 在体内和/或在体外具有此类生物活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物活性。

D.免疫偶联物

本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化疗剂或药 物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动 物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素偶联的本文中的抗线 性连接的聚泛素抗体的免疫偶联物。

在一个实施方案中，免疫偶联物是抗体-药物偶联物(ADC)，其中 抗体与一种或多种药物偶联，所述药物包括但不限于美登木素生物碱 (maytansinoid)(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥里斯他汀(auristatin)诸如单甲基奥里斯他汀药物部分 DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588 以及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin) 或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、 5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等， Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等，Cancer Res. 58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多 柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等，Current Med.Chem.13:477-523 (2006)；Jeffrey等，Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)； Torgov等，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.&Med.Chem. Letters12:1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.45:4336-4343 (2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)； 紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、 替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)； 和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与酶活性毒素或其片段偶 联的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A 链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白 (abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(sarcin)、油桐(Aleutites  fordii)蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana) 蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻 疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis) 抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素 (restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉 烯族化合物(trichothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫偶联物包含与放射性原子偶联以形成 放射性偶联物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于产 生放射性偶联物。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、 Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在使用放射性偶联物进行检 测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123， 或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物， 诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、 钆、锰或铁。

可以使用以下多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂 的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥 珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨 基硫烷(iminothiolane,IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如盐酸己二酰 亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊 二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生 物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6- 二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如， 可以如Vitetta等，Science238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免 疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂。参见 WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割 接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接 头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Res.52： 127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文中的免疫偶联物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制 备的此类偶联物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、 HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、 SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、 磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4- 乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如，来自Pierce  Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗线性连接的聚泛素抗体 可用于检测生物样本中线性连接的聚泛素的存在。本文中使用的术语 “检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样本包括细胞 或组织，诸如但不限于肿瘤细胞、肌肉细胞或神经细胞。

在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗线性连 接的聚泛素抗体。在又一方面，提供了检测生物样本中线性连接的聚 泛素的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗线性连 接的聚泛素抗体结合聚泛素或聚泛素化蛋白质的条件下使生物样本 与如本文中所描述的抗线性连接的聚泛素抗体接触，并检测是否在抗 线性连接的聚泛素抗体与聚泛素或聚泛素化蛋白质之间形成复合物。 此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗线性连 接的聚泛素抗体来选择适合用抗线性连接的聚泛素抗体治疗的受试 者，例如其中线性连接的聚泛素是一种用于选择患者的生物标志。

可使用本发明的抗体来诊断的示例性病症包括细胞周期相关疾 病或病症，其可以是与异常升高的细胞周期进展有关的疾病或病症或 与异常降低的细胞周期进展有关的疾病或病症。一方面，与异常升高 的细胞周期进展有关的疾病或病症是癌症。另一方面，与异常降低的 细胞周期进展有关的疾病或病症是例如变性肌肉病症或变性神经病 症。

在某些实施方案中，提供了经标记的抗线性连接的聚泛素抗体。 标记物包括但不限于直接检测的标记物或部分(诸如荧光、发色、电 子致密、化学发光和放射性标记物)以及例如经由酶反应或分子相互 作用间接检测的部分，诸如酶或配体。示例性的标记物包括但不限于 放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I、荧光团诸如稀土螯合物或荧 光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤 光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号 4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱 性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如， 葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶 诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸 如HRP偶联)、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、 自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基等。

F.药物制剂

通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学上 可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A. 编(1980))以冻干制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗线性 连接的聚泛素抗体的药物制剂。一般地，药学上可接受的载体在所采 用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括但不限于缓冲剂，诸如 磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸； 防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲 烃铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对 羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和 间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋 白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基 酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸； 单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂， 诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离 子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面 活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性的药学上可接受的载 体进一步包括间质药物分散剂诸如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋 白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如 rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性 sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公布号 2005/0260186和2006/0104968。一方面，将sHASEGP与一种或多种 另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体 制剂包括描述于美国专利号6,171,586和WO2006/044908的那些，后 一种制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的 活性成分，优选具有彼此没有不利影响的互补活性的那些化合物。例 如，可能希望进一步提供一种或多种化疗剂。此类活性成分适于以有 效用于所需目的的量而组合存在。

活性成分可包埋于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的 微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸 甲酯)微胶囊)，包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、 微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包埋在粗乳剂中。此类技术公 开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980) 中。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有 抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例 如膜或微胶囊。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如 通过透过无菌滤膜过滤。

G.治疗性方法和组合物

可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗线性连接的聚泛 素抗体。

一方面，提供了作为药物使用的抗线性连接的聚泛素抗体。在另 外的方面，提供了在治疗与异常细胞周期调控有关的病症(包括但不 限于增殖病症诸如癌症和营养不良病症，包括但不限于变性肌肉病症 和变性神经病症)中使用的抗线性连接的聚泛素抗体。在某些实施方 案中，提供了在治疗方法中使用的抗线性连接的聚泛素抗体。在某些 实施方案中，本发明提供了在治疗患有与异常细胞周期调控有关的病 症的个体的方法中使用的抗线性连接的聚泛素抗体，所述方法包括对 个体施用有效量的抗线性连接的聚泛素抗体。在一个此类实施方案 中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种例如，如下文 所描述的另外的治疗剂。在另外的实施方案中，本发明提供了在调节 细胞周期调控中使用的抗线性连接的聚泛素抗体使得细胞周期进展 速率得到调节。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中调节细胞 周期进展速率的方法中使用的抗线性连接的聚泛素抗体，所述方法包 括对个体施用有效量的抗线性连接的聚泛素抗体以调节细胞周期进 展并由此调节细胞分裂速率。依照任何上述实施方案的“个体”优选是 人。

在又一个方面，本发明提供了抗线性连接的聚泛素抗体在制造或 制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗与异常细胞周 期调控有关的病症(包括但不限于增殖病症诸如癌症和营养不良病 症，包括但不限于变性肌肉病症和变性神经病症)。在又一个实施方 案中，药物在治疗与异常细胞周期调控有关的病症的方法中使用，所 述方法包括对患有此类病症的个体施用有效量的药物。在一个此类实 施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另例如 如下文所描述的外的治疗剂。在又一个实施方案中，药物用于调节细 胞周期进展速率。在又一个实施方案中，药物用于在个体中调节细胞 周期进展速率的方法，所述方法包括对个体施用有效量的药物以调节 细胞分裂速率。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。

在又一个方面，本发明提供了用于治疗与异常细胞周期调控有关 的病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对患有此类与异常 细胞周期调控有关的病症的个体施用有效量的抗线性连接的聚泛素 抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效 量的至少一种如下文所描述的另外的治疗剂。依照任何上述实施方案 的“个体”可以是人。

在又一个方面，本发明提供药物制剂，其包含本文中提供的任何 抗线性连接的聚泛素抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一 个实施方案中，药物制剂包含本文中提供的任何抗线性连接的聚泛素 抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本 文中提供的任何抗线性连接的聚泛素抗体和至少一种例如如下文所 描述的另外的治疗剂。

可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如， 可以与至少一种另外的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案 中，另外的治疗剂是化疗剂。

“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷 化剂类，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺；磺酸烷基酯 诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)； 氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、 美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙烯亚胺类(ethylenimines) 和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙 撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺 (triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 番多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚 (dronabinol，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)； 秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱 (camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨 菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin； CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来 新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸 (podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素类 (cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀 (dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和 CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)； sarcodictyin；海绵素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺 (cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、 氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide  hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆 甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、 尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀 (carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫 司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生 素类卡奇加利车霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl. Ed.Engl.33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A； 埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团 和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、 放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸 (azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔 比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、 色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素 (daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗 啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星 (epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉 素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、 培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素 (puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑 菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌 苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代 谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲 叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙 (trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤 (mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧 啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿 苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、 氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈 他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷 (mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补 充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖 苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)； 恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群 (bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛 (demecolcine)；亚丝醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋 铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)； 硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明 (lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素 (maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托 蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)； 喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)； 洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼 (procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)； 雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺 (spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌 (triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(trichothecenes)(尤 其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌 素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)； 二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷 (pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派 (thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如，紫杉醇 (paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、 ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，白蛋白改造的纳米颗粒 剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois) 和多西他塞(doxetaxel)(Rorer,Antony, France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) 6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤； 铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)铂； 依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌 (mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂 (oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine) 米托蒽醌(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺 霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)； 拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素 A(retinoids)，诸如维甲酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine) 任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以 及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、 长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(用奥沙利铂 (ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸(leucovovin)的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激 素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以 是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)， 包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔 芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司 酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌 激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如黄体 化激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如和醋酸 亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布 舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸 如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺 (bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶 抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦 (exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏 罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲 唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类 (bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或 )、依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、 唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、 阿伦膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐 (pamidronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞 膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞 嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制粘着细胞增殖的信号途经 中涉及的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras 和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基 因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子 抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学上可接受的盐、 酸或衍生物。

上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗 剂包含在相同或不同制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施 用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行本发明的抗体的 施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。

可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内和鼻内，及(若期 望用于局部治疗的话)病灶内施用来施用本发明的抗体(和任何另外 的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮 下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，诸如静脉内 或皮下注射进行，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文中涵 盖各种给药方案，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施 用、推注施用和脉冲输注。

本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、给药 及施用。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特 定哺乳动物、个体患者的临床状态、病因、药剂递送部位、施用方法、 施用日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一 种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药剂一起配制。此类其它药 剂的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及 其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量并使用本文中所描 述的施用途径使用，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任 何剂量并通过凭经验确定的/经临床确定为合适的任何途径使用。

在制备和施用抗体中要考虑本发明的抗体的结合靶的位置。当结 合靶为细胞内分子时，对于要被引入其中结合靶所处的细胞中的抗体 或其抗原结合片段提供了本发明的某些实施方案。在一个实施方案 中，本发明的抗体可以在细胞内表达为胞内抗体。如本文中所使用的， 术语“胞内抗体”指如Marasco,Gene Therapy4:11-15(1997)； Kontermann,Methods34:163-170(2004)；美国专利号6,004,940和 6,329,173；美国专利申请公布号2003/0104402以及PCT公布号 WO2003/077945中所述的，一种在细胞内表达并且能与靶分子选择 性结合的抗体或其抗原结合部分。胞内抗体的细胞内表达受将编码期 望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺少野生型前导序列和通常与编码 该抗体或抗原结合片段的基因相关的分泌信号)引入靶细胞中的影 响。可使用将核酸引入细胞中的任何标准方法，包括但不限于显微注 射、弹道式注射(ballistic injection)、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体以 及使用携带有目标核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和痘苗病 毒载体进行转染。可将一种或多种编码本发明的抗聚泛素抗体的全部 或部分的核酸递送给靶细胞，使得一种或多种胞内抗体得以表达，所 述胞内抗体能够在细胞内与聚泛素结合并调节一条或多条聚泛素介 导的细胞途径。

在另一个实施方案中，提供了内在化的抗体。抗体可具有某些增 强将抗体递送入细胞中的特性，或可被修饰以具有上述特性。用于实 现其的技术是本领域已知的。例如，已知抗体的阳离子化能促进其被 细胞摄取(参见例如，美国专利号6,703,019)。脂质转染或脂质体也可 用于将抗体递送入细胞中。在使用抗体片段的情况中，与靶蛋白的结 合域特异性结合的最小抑制性片段通常是有利的。例如，基于抗体的 可变区序列，可设计保留与靶蛋白序列结合的能力的肽分子。上述肽 可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。参见例如，Marasco等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893(1993)。

可通过本领域已知的方法增强调节多肽进入靶细胞。例如，某些 序列如来源于HIV Tat或触角足(Antennapedia)同源结构域蛋白的那 些序列能够指导异源蛋白穿过细胞膜的有效摄入。参见例如，Chen 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:4325-4329(1999)。

当结合的靶位于脑中时，本发明的某些实施方案提供了抗体或其 抗原结合片段以穿过血脑屏障。某些神经变性疾病与血脑屏障透过性 的增加有关，使得抗体或抗原结合片段可被容易地引入脑中。当血脑 屏障保持完整时，存在着一些用于转运分子穿过该血脑屏障的本领域 已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法以及基于受体 和通道的方法。

将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的物理方法包括但不 限于完全绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括 但不限于直接注射入脑中(参见例如，Papanastassiou等，Gene Therapy 9:398-406(2002)；间质输注/对流增强的递送(convection-enhanced  delivery)(参见例如，Bobo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:2076-2080 (1994))，和在脑中移植递送装置(参见例如，Gill等，Nature Med.9: 589-595(2003)；和Gliadel Wafers^TM,Guildford Pharmaceutical)。在屏 障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见例如，美国专利公布 号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高渗的甘露醇(Neuwelt,E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,1&2卷, Plenum Press,N.Y.(1989)))、通过如缓激肽或透化剂A-7透化(参见例 如，美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)和用含 有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经 细胞(参见例如，美国专利公布号2003/0083299)。

基于脂质的将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的方法包 括但不限于将抗体或抗原结合片段封装到连接有与血脑屏障的血管 内皮上受体结合的抗体结合片段的脂质体中(参见例如，美国专利申 请公布号20020025313)，以及将抗体或抗原结合片段包被在低密度脂 蛋白颗粒(参见例如，美国专利申请公布号20040204354)或载脂蛋白 E(参见例如，美国专利申请公布号20040131692)。

将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的基于受体和通道的 方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的透过性 (参见例如，美国专利申请公布号2002/0065259、2003/0162695和 2005/0124533)；激活钾通道(参见例如，美国专利申请公布号 2005/0089473)；抑制ABC药物转运体(参见例如，美国专利申请公布 号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种或多种转铁蛋白 受体的活性(参见例如，美国专利申请公布号2003/0129186)和使抗体 阳离子化(参见例如，美国专利号5,004,697)。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其 它另外的治疗剂联合使用时)的合适剂量将取决于所要治疗的疾病的 类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所施用抗体的预防或治疗 目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的 斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用给患者。取决于 疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的 抗体可作为首次候选用量施用给患者，无论是例如通过一次或多次单 独的施用或通过连续输注。取决于上述提及的因素，一个典型的日剂 量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的 重复施用，取决于病情，治疗应通常持续直至出现疾病症状的期望遏 制为止。抗体的一个示例性剂量应为约0.05mg/kg-约10mg/kg。因此， 可将一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们 的任何组合)的剂量施用给患者。上述剂量可间歇施用，如每周或每 三周施用一次(例如使得患者接受约2至约20个，或者例如约6个剂 量的抗体)。可施用初始较高的负荷剂量，接着施用一个或多个较低 的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定容易地监 测该治疗的进展。

应当理解，可以替代抗线性连接的聚泛素抗体或者除抗线性连接 的聚泛素抗体外使用本发明的免疫偶联物进行任何上述制剂或治疗 性方法。

H.制品

在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预 防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与 容器联合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射 器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器 容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断病况的组 合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射 针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性 剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗选择的病 况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中 组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器， 其中组合物包含另外的细胞毒性或另外的治疗性药剂。在本发明的此 实施方案中的制品可以进一步包含包装说明书，其指示组合物可用于 治疗特定的病况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器， 其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸 盐缓冲盐水、林格氏(Ringer’s)溶液和葡聚糖溶液。它可以进一步包含 从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过 滤器、针和注射器。

应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫偶联物来代替或补 充抗线性连接的聚泛素抗体。

III.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提 供的一般描述，可以实践各种其它实施方案。

实施例1：抗线性连接的聚泛素抗体的分离和表征

A)抗原产生

用于分选噬菌体展示文库的抗原为线性二泛素(Boston  Biochem)。线性二泛素是两个泛素通过第一泛素的羧基末端与第二泛 素的氨基末端之间的肽键连接的头对尾融合物。

B)天然文库分选

对天然YSGX Fab噬菌体展示文库针对线性二泛素进行四轮分 选。四轮分选后未观察到富集(见表2)。YSGX Fab噬菌体展示文库在 所有三个重链CDR和轻链CDR L3中含有随机化氨基酸(参见美国公 布的专利申请号2005-0106667和Fellouse F.等JMB373:924-40 (2007))，并且基于人源化抗体4D5。

对天然共有轻链YSGX Fab噬菌体展示文库针对线性二泛素进 行四轮分选。4轮分选后观察到25倍富集(见表2)。共有轻链YSGX  Fab噬菌体展示文库在如对于YSGX文库描述的所有三个重链CDR 中含有随机化氨基酸(参见美国公布的专利申请号2005-0106667和 Fellouse F.等JMB373:924-40(2007))，然而轻链序列作为人源化抗体 4D5的修饰形式固定。

对天然VH Fab噬菌体展示文库针对线性二泛素进行四轮分选。 四轮分选后观察到800倍富集(见表1)。VH Fab噬菌体展示文库在所 有三个重链CDR中含有随机化氨基酸(见美国公布的专利申请号 2005/0119455和Lee C.W.等JMB340:1073-93(2004))，并且基于人源 化抗体4D5。

将线性二泛素(Boston Biochem)固定在96孔Maxisorb免疫板 (NUNC)上。将板于4℃用5μg/mL线性二泛素在50mM碳酸钠缓冲 液(pH9.6)中包被过夜。将经包被的板于25℃在振摇下用200μL/孔含 有0.05%Tween20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBST)中的2.5%牛乳封 闭1小时。用1/5体积的20%聚乙二醇(PEG)/2.5M NaCl自甘油储液 沉淀天然噬菌体文库，重悬浮于2.5%牛乳/PBST中并于25℃温育1 小时同时封闭平板。1小时后，将封闭缓冲液自板倾倒出并且加入100 μL/孔在2.5%牛乳/PBST中的噬菌体，并在振摇下于25℃温育4小时。 结合后，通过手动填充各孔且在洗涤之间倒出缓冲液而用PBST洗板 十次。将噬菌体于25℃在振摇下用150μL/孔50mM HCl/500mM KCl 洗脱30分钟。用150μL/孔的1M Tris(pH7.5)中和洗脱液并随后在 XL1-Blue(Agilent)大肠杆菌(E.coli)中添加M13K07辅助噬菌体来繁 殖。

扩增的噬菌体用于如上所述的另外几轮针对线性二泛素的选择。 在第2轮至第4轮中，将不同形式的可溶性泛素添加至噬菌体用于反 选择。在第2轮中，使用10μg/mL可溶性单泛素(Boston Biochem)。 在第3轮至第4轮中，使用各10μg/mL的可溶性单泛素(Boston  Biochem)、K11连接的二泛素(Genentech)、K48连接的聚泛素2-7 (Boston Biochem)和K63连接的聚泛素2-7链(Boston Biochem)。与未 包被的孔比较，通过比较用线性二泛素回收的噬菌体的数量来计算第 2轮至第4轮的富集。在第2轮至第4轮中观察到共有轻链文库和 VH文库但不是YSGX文库的富集(见表2)。

表2

筛选来自第2轮VH文库分选的96个单独克隆、来自第3轮VH 文库分选的192个克隆、来自第4轮VH文库分选的96个克隆和来 自第4轮共有轻链文库分选的192个克隆。因为对于YSGX文库未 观察到富集，所以自该文库未筛选出克隆。将单独克隆以96孔形式 在1mL含有50μg/mL羧苄青霉素和1x10¹⁰个噬菌体/mL M13K07辅 助噬菌体的2YT肉汤中于37℃在振摇下生长过夜。通过以3000rpm 旋转10分钟使细胞沉淀。在高通量噬菌体点酶联免疫吸附测定 (ELISAs)中使用来自那些培养基的上清液用于结合线性二泛素 (Boston Biochem)、单泛素(Boston Biochem)、K11连接的二泛素 (Genentech)、K48连接的聚泛素2-7(Boston Biochem)、K63连接的聚 泛素2-7(Boston Biochem)、抗gD抗体(Genentech)或未包被的孔。所 有Fab文库在轻链上含有羧基末端gD标签，这允许通过抗gD抗体 结合来评估展示水平。将这组泛素蛋白质固定在384孔Maxisorb免 疫板(NUNC)上。将板于4℃用2μg/mL每一种蛋白质在50mM碳酸 钠缓冲液(pH9.6)中包被过夜。将经包被的板于25℃在振摇下用60 μL/孔PBST中的2.5%牛乳封闭1小时。1小时后，将封闭缓冲液自 板倾倒出并且加入20μL/孔的PBST和10μL/孔的噬菌体上清液。将 板于25℃在振摇下温育1小时。通过手动填充各孔且倒出洗涤缓冲 液而用PBST洗板六次。抗M13辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(GE  Healthcare)在PBST中的1:5,000稀释液用于检测噬菌体结合。加入 30μL/孔的二次稀释液且将板于25℃在振摇下温育30分钟。然后将 板用PBST洗涤六次和用PBS洗涤两次，均为手动。所结合的二抗 使用TMB底物(KPL)检测，之后用等体积的1M磷酸淬灭。于450nm 读取吸光度。

自共有轻链文库鉴定出数种弱线性二泛素特异性结合物(见图 1)。对这些克隆的轻链和重链可变域进行测序。鉴定出两个独特序列 (1F4(SEQ ID NO:27和31)和1A10(SEQ ID NO:28和31))，但是基于 轻链序列确定这些克隆(1F4)之一实际上来自不含有固定轻链的 YSGX文库(见图2A)。自VH文库鉴定出数个显示强线性二泛素结合 且对K63连接的聚泛素的结合较弱的克隆(见图1)。对这些VH文库 克隆的重链可变域进行测序。基于VH文库设计，预期CDR H1、CDR  H2和CDR H3序列是克隆特异性的，而重链框架序列应为相同的。 由于文库设计，预期整个轻链序列(框架和CDR)是不变的。CDR L1 序列是RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:1)，CDR L2序列是SASFLYS (SEQ ID NO:2)，且CDR L3序列是QQSYTTPPT(SEQ ID NO:3)。鉴 定出两个独特重链序列(1D8(SEQ ID NO:30)和1E3(SEQ ID NO:29)) (见图2B)。

C)噬菌粒至单价Fab展示的转化

为了亲和力成熟目的，将来自VH文库的1D8和1E3噬菌粒克 隆从二价Fab-拉链形式转化成单价Fab展示。使用Kunkel诱变去除 CH1恒定域末端与基因III(gpIII)始端之间的亮氨酸拉链(参见Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488(1985))。将诱变寡核苷酸F220-delzip (TCTTGTGACAAAACTCACAGTGGCGGTGGCTCTGGT)(SEQ ID  NO:100)与1μg1D8或1E3噬菌粒Kunkel DNA组合。

为了亲和力成熟目的，将分别来自共有轻链文库和YSGX文库 的1A10和1F4克隆由二价Fab-C形式转化成单价Fab展示。使用K unkel诱变去除CH1恒定域末端与gpIII之间的半胱氨酸。将诱变寡 核苷酸F1120-delCGRP(TGTGACAAAACTCACCTCAGTGGCGGT GGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAG)(SEQ ID NO:1 01)与1μg1A10或1F4噬菌粒Kunkel DNA组合。使用所得单价F ab噬菌粒来产生噬菌体用于IC₅₀ELISAs。

D)噬菌体IC₅₀ELISAs

在IC₅₀ELISA中测试展示1D8、1E3、1A10和1F4的单价Fab 的噬菌体以得到对于线性二泛素的相对亲和力的估值。进行初始滴度 ELISA以测定会实现信号OD₄₅₀=0.5的噬菌体的量。将线性二泛素 (Boston Biochem)固定在96孔Maxisorb免疫板(NUNC)上。将线性二 泛素于4℃以1μg/mL在50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中包被过夜。 将经包被的板于25℃在振摇下用200μL/孔PBST中的2.5%牛乳封闭 1小时。在PBST中的2.5%牛乳中制备噬菌体的12个两倍系列稀释 液，从OD₂₆₈=4.0至OD₂₆₈=0.002。1小时后，将封闭缓冲液自板倾倒 出且加入100μL/孔的每种噬菌体稀释液，并于25℃在振摇下温育15 分钟。然后使用洗板机用PBST洗板六次。抗M13噬菌体-HRP偶联 的二抗(GE Healthcare)在PBST中的1:5000稀释液用于检测噬菌体结 合。加入100μL/孔的二次稀释液且将板于25℃在振摇下温育30分 钟。然后使用洗板机用PBST洗板12次和手动用PBS洗涤两次。所 结合的二抗使用TMB底物(KPL)检测，之后用等体积的1M磷酸淬 灭。于450nm读取吸光度。OD₄₅₀=0.5时的噬菌体的浓度为噬菌体的 OD₂₆₈=1.0(对于克隆1F4)，OD₂₆₈=0.125(对于克隆1D8)和OD₂₆₈=0.5(对 于克隆1E3)。对于克隆1A10，甚至在噬菌体OD₂₆₈=4.0时OD₄₅₀仅 为0.376。这种结合相当弱，并且因此不进一步研究克隆1A10。将可 溶性线性二泛素的两倍系列稀释液(对于克隆1F4，10μM至5nM)和 可溶性线性二泛素的三倍系列稀释液(对于克隆1D8和1E3，10μM 至56pM)+在PBST中的2.5%牛乳中的所选噬菌体浓度于25℃在振 摇下温育1小时。然后通过使混合物与已用1μg/mL线性二泛素包被 并用PBST中的2.5%牛乳封闭的96孔Maxisorb免疫板温育，来测量 在每种线性二泛素浓度下未结合的噬菌体的量。将噬菌体/线性二泛 素混合物于25℃在振摇下于板上温育15分钟。然后使用洗板机用 PBST洗板六次。抗M13噬菌体-HRP偶联的二抗(GE Healthcare)在 PBST中的1:5000稀释液用于检测噬菌体结合。加入100μL/孔的二 次稀释液且将板于25℃在振摇下温育30分钟。然后使用洗板机用 PBST洗板12次和手动用PBS洗板两次。所结合的二抗使用TMB底 物(KPL)检测，之后用等体积的1M磷酸淬灭。于450nm读取吸光 度。将吸光度针对可溶性线性二泛素浓度作图并显示对于1F4IC₅₀大 于10μM(见图3)，对于1D8IC₅₀接近5μM(见图3)，而对于1E3IC₅₀为80nM(见图3)。

E)Fab产生

在大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)启动子的控制下表达衍生自Fab 噬菌体展示文库的克隆。轻链和重链均含有氨基末端细菌stII信号序 列以允许在大肠杆菌中分泌且自单一噬菌粒载体表达。将重链羧基末 端框内融合至M13细菌噬菌体的基因产物III(gpIII)的C端，这允许 在噬菌体上展示单价Fab片段。为了表达可溶性Fab，将终止密码子 在Fab的CH1恒定域的末端与gpIII的始端之间引入1D8和1E3单 价噬菌粒。使用Lightning定点诱变试剂盒(Agilent)使 用诱变寡核苷酸：

5’-FabdelzipTAA

(CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATAAAGTGGCGGTGG CTCTGGTTCCGGTG)(SEQ ID NO:102)和

3’-FabdelzipTAA

(CACCGGAACCAGAGCCACCGCCACTTTATGTGTGAGTT TTGTCACAAGATTTGGG)(SEQ ID NO:103)来插入终止密码子。将 所得可溶性Fab表达质粒转化进大肠杆菌株62A7(Genentech)并在含 有羧苄青霉素的固体琼脂上涂板。使用单一菌落接种25mL含有50 μg/mL羧苄青霉素的2YT肉汤。使培养物于37℃生长过夜并使用5 mL接种500mL具有50μg/mL羧苄青霉素的完全C.R.A.P.培养基 (3.57g(NH4)2SO4、0.71g柠檬酸钠2H2O、1.07g KCl、5.36g酵母 提取物(经证明的)、5.36g Hycase SF(Sheffield)，通过添加KOH调节 pH至7.3并且用超纯水调节体积至872mL，高压灭菌，冷却至55℃， 向其添加(每L)110mL1M MOPS(pH7.3),11mL50%葡萄糖和7mL 1M MgSO4)。使培养物于30℃在振摇下生长24小时。通过离心收获 细胞并将沉淀贮存于-20℃下。通过在35mL含有10μg/mL DNA酶I (Invitrogen)、0.2mg/mL溶菌酶(USB)和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF) 的冷洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)+150mM NaCl)(Calbiochem) 中重悬浮细胞沉淀来纯化Fab。通过快速涡旋使沉淀重悬浮。为了实 现完全裂解将细胞于25℃温育15分钟。通过离心使细胞碎片沉淀并 将裂解液上样在用冷洗涤缓冲液预平衡的1mL蛋白A-sepharose(GE  Healthcare)柱上。用50mL冷洗涤缓冲液洗涤柱，用3mL0.1M乙酸 洗脱，且用150μL1M Tris(pH11.0)中和。使用Amicon Ultra-15离 心过滤器单元(10kDa截留，Millipore)浓缩Fab。以分光光度法测定 所得Fab浓度(1OD₂₈₀=1.5mg/mL)。

F)Fab蛋白质印迹法

在蛋白质印迹法中测试1D8和1E3Fab(来自实施例1E)与线性二 泛素(Boston Biochem)、单泛素(Boston Biochem)、K11连接的二泛素 (Genentech)、K48连接的二泛素(Boston Biochem)和K63连接的二泛 素(Boston Biochem)的结合。将1μg每一种蛋白质在含有还原剂的1X  LDS缓冲液(Invitrogen)中于70℃加热十分钟并在4-12%NuPAGE Bis  Tris1.0mm凝胶上于MES缓冲液(Invitrogen)中一式两份地运行。在 恒定30V下通过在10%甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen) 中的湿转移将凝胶转移至0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)持续1.5小 时。通过于25℃在振摇下在PBST中的5%牛乳中温育1.5小时来封 闭膜上的非特异性结合位点。然后将膜于25℃在振摇下在PBST中 5%牛乳中的5μg/mL1D8或1E3Fab中温育1小时。将膜在PBST中 在振摇下洗涤三次。通过将膜于25℃在振摇下在山羊抗人Fab片段 特异性HRP偶联的二抗(Sigma Aldrich)在PBST中5%牛乳中的 1:10000稀释液中温育1小时，来检测Fab。然后将膜在PBST中洗 涤三次，之后在PBS中洗涤1次。使用Super SignalWest Pico化学发 光底物(Thermo Scientific)、接着使印迹对薄膜曝光来检测二抗。1E3 Fab仅检测线性二泛素，而不是单泛素、K11连接的二泛素、K48连 接的二泛素或K63连接的二泛素(见图4)。通过蛋白质印迹法1D8Fab 未检测到任何形式的泛素(见图4)。

G)分离的1D8和1E3Fab的亲和力分析

通过表面等离振子共振(SPR)使用BIACORE^TM3000(GE  Healthcare)分析1D8和1E3Fab(来自实施例1E)的亲和力。使用制造 商供应的胺偶联方案将约120个共振单位(RU)的线性二泛素(Boston  Biochem)、K48连接的二泛素(Boston Biochem)和K63连接的二泛素 (Boston Biochem)分别固定在CM5芯片的流动室2、流动室3和流动 室4上。流动室1被激活且在不固定蛋白质的情况下用乙醇胺封闭， 以用于减法参照(reference subtraction)。使用HBST作为运行缓冲液， 在每个流动室上注入(总共60μL，以30μL/分钟的流速)1E3Fab在 10mM Hepes(pH7.2)、150mM NaCl和0.01%Tween20(HBST)中的 两倍系列稀释液(0.5-500nM)。记录每个流动室的信号且减去参照信 号。探测不同的再生条件。即使用10mM HCl芯片表面也不会完全 再生回到基线。当测试10mM甘氨酸(pH1.7)时，这改变芯片表面且 降低结合容量。

使用Fab捕获方法在BIACORE^TM3000(GE Healthcare)上测试替 代性方法。使用制造商供应的胺偶联方案将约11,000共振单位(RU) 的抗人Fab捕获抗体(GE Healthcare)固定在CM5芯片的流动室1和2 上。以10μL/分钟的流速在流动室2上注入10μL10mM Hepes(pH 7.2)、150mM NaCl和0.01%Tween20(HBST)中的10μg/mL Fab，导 致捕获约430RU的Fab。流动室1在它上面仅有捕获抗体以充当减 法参照。在流动室1和2上注入(总共60μL，以30μL/分钟的流速) 线性二泛素(Boston Biochem)或K63连接的二泛素(Boston Biochem) 在HBST中的两倍系列稀释液(1-1000nM)。记录每个流动室的信号 且减去参照信号。在4分钟的解离时段后，以30μL/分钟的流速用 30μL10mM甘氨酸(pH2.1)的两次注射再生芯片表面。数据难以拟合 至任何结合模型，因为二泛素不完全从芯片解离。此外，解离速率非 常快并且即使在所用的二泛素最高浓度下结合并未达到稳态。因此， 难以估算这些Fab的K_D。

实施例2-1F4、1D8和1E3的亲和力成熟

A)终止模板产生

将TAA终止密码子分别插入到CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR  H3或CDR L3和H3两者中(分别产生L1、L2、L3、H3和L3/H3终 止模板)，用于使用Kunkel诱变的文库合成。通过要求修复终止以获 得全长Fab表达和噬菌体上的展示，终止密码子促成特定CDR环内 的多样性。将下文所列的终止密码子诱变寡核苷酸与1μg相应的单 价噬菌粒Kunkel DNA组合。所得单价Fab噬菌粒终止模板用于亲和 力成熟文库产生。

对于克隆1D8和1E3，用于在轻链CDR L1内位置24(Kabat编 号)插入TAA终止密码子的CDR L1终止诱变寡核苷酸是4D5LC1.st op(GTCACCATCACCTGCTAAGCCAGTCAGGATGTG)(SEQ ID  NO:104)。对于克隆1D8和1E3，用于在轻链CDR L2内位置50(Ka bat编号)插入TAA终止密码子的CDR L2终止诱变寡核苷酸是4D5 LC2.stop(GAAGCTTCTGATTTACTAAGCATCCTTCCTCTAC)(SE Q ID NO:105)。对于克隆1D8和1E3，用于在轻链CDR L3内位置 89(Kabat编号)插入TAA终止密码子的CDR L3终止诱变寡核苷酸是 4D5LC3.stop(GCAACTTATTACTGTTAACAATCTTATACTACTC) (SEQ ID NO:106)。用于在克隆1D8的重链CDR H3内位置95(Kab at编号)插入TAA终止密码子的CDR H3终止诱变寡核苷酸是VH3. 1D8.H3stop(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTTAAGCCGGGTCCCGC TTGTTGTCG)(SEQ ID NO:107)。用于在克隆1E3的重链CDR H3 内位置98(Kabat编号)插入TAA终止密码子的CDR H3终止诱变寡 核苷酸是413Vh5SRo6(GAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCG TGAGGCCTCGTAACTGCCCCCCTACGTTATGGACTACTGGGGTC AAGGAACACTAGTC)(SEQ ID NO:108)。

对于克隆1F4，用于在轻链CDR L1内位置27(Kabat编号)插入 TAA终止密码子的CDR L1终止诱变寡核苷酸是CLC.L1stop(CAT CACCTGCCGTGCCAGTTAATCCGTGTCCAGCGCTGTAG)(SEQ I D NO:109)。对于克隆1F4，用于在轻链CDR L2内位置52(Kabat 编号)插入TAA终止密码子的CDR L2终止诱变寡核苷酸是CLC.L2 stop(CTTCTGATTTACTCGGCATAAAGCCTCTACTCTGGAGTC) (SEQ ID NO:110)。对于克隆1F4，用于在轻链CDR L3内位置90(K abat编号)插入TAA终止密码子的CDR L3终止诱变寡核苷酸是CL  C4.1F4.L3stop(GCAACTTATTACTGTCAGTAATATTATTATTATTCT CCG)(SEQ ID NO:111)。用于在克隆1F4的重链CDR H3内位置9 4(Kabat编号)插入TAA终止密码子的CDR H3终止诱变寡核苷酸是 CLC4.1F4.H3stop(GCCGTCTATTATTGTGCTTAAGGTTACGTTTG GAAAGGTG)(SEQ ID NO:112)。

B)亲和力成熟文库产生

对于每一个克隆(1F4、1D8和1E3)产生总共10个亲和力成熟文 库。通过Kunkel诱变产生所有文库(参见Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci. USA82:488(1985))。在软随机化的情况下，合成简并寡核苷酸使得野 生型残基会保留50%的机会而50%的机会编码其余19种氨基酸之 一。为了实现软随机化，设计寡核苷酸，使得某些核苷酸位置70% 的机会被所示碱基占据且10%的机会被其它3种碱基之一占据 (Gallop等，J.Med.Chem.37:1233(1994))。对于在特定碱基处包括此 类软随机化的跟在后面的那些寡核苷酸，软随机化的百分比由该碱基 位置处存在的数字来标示。数字“5”表示碱基腺嘌呤在该位置存在 70%的机会，而碱基鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶每一种存在10%的机 会。类似地，数字“6”指鸟嘌呤，“7”指胞嘧啶，而“8”指胸腺嘧啶，其 中在每一种情况中，其它3种碱基每一种只存在10%的机会。在硬随 机化(hard randomization)的情况中，合成简并寡核苷酸，使得会容许 在天然人抗体内的某些位置处找到的氨基酸多样性。在这种情况中， 使用简并密码子，其中字母“R”编码鸟嘌呤或腺嘌呤，“Y”编码胸腺 嘧啶或胞嘧啶，“M”编码腺嘌呤或胞嘧啶，“K”编码鸟嘌呤或胸腺嘧 啶，“S”编码鸟嘌呤或胞嘧啶，“W”编码腺嘌呤或胸腺嘧啶，“H”编码 腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，“B”编码鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶，“V” 编码鸟嘌呤、胞嘧啶或腺嘌呤，“D”编码鸟嘌呤、腺嘌呤或胸腺嘧啶， 且“N”编码鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。

对于1F4产生了十个文库，并指定为L1、L2、L3、L1/L2/L3、 H3、L3/H3、L1/H2、L2/H1、H2/H3和L3/H1/H2。1F4L1文库硬随 机化轻链的位置28-33(Kabat编号)以允许在天然人抗体内的这些位 置处找到的氨基酸多样性。L1诱变寡核苷酸F111-L1(ACCTGCCGT GCCAGTCAGRDTRKTRVWANWTHTGTAGCCTGGTATCAACAGA AAC)(SEQ ID NO:113)和F202-L1(ACCTGCCGTGCCAGTCAGR DTRKTRVWANWT HTCTGGCCTGGTATCAACAGAAAC)(SEQ I D NO:114)以1:2的比例混合(产生“L1寡聚物混合物”)并且与20μg 1F4L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过K unkel诱变产生文库。

1F4L2文库硬随机化轻链位置50、53和55(Kabat编号)以允许 在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。将L2诱变寡核 苷酸F201-L2(CCGAAGCTTCTGATTTA CKBGGCATCCAVCCTCT ACTCTGGAGTCCCT)(SEQ ID NO:115)和F203-L2(CCGAAGCTT CTGATTTACKBGGCATCCAVCCTCGMATCTGGAGTCCCTTCTCG C)(SEQ ID NO:116)以1:1的比例混合(产生“L2寡聚物混合物”)并且 与20μg1F4L2终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合 以通过Kunkel诱变产生文库。

1F4L3文库硬随机化轻链位置91-96(Kabat编号)以允许在天然 人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻链位 置。诱变寡核苷酸F133a(GCAACTTA TTACTGTCAGCAATMTDM CRVTNHTCCTYKGACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO:11 7)、F133b(GCAACTTATTACTGTCAGCAATMTDMCRVTNHTC CT TWTACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO:118)、F133c(GCA ACTTATT ACTGTCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTYKGACGTTCG GACAGGGTACC)(SEQ ID NO:119)、F133d(GCAACTTATTACTG TCAGCAASRTDMCRVTNHTCCTT WTACGTTCGGACAGGGTAC C)(SEQ ID NO:120)约1:1:1:1比例混合，产生“L3硬寡聚物混合物。” 诱变寡核苷酸F563-L3soft1(ACTTATTACTGTCAGCAA8788575775 77CCT777ACGTTCGGACAGGGTACC)(SEQ ID NO:121)、F564-L3 soft2(ACTTATTACTGTCAGCAA878857577577CCTTWTACGT TC GGACAGGGTACC)(SEQ ID NO:122)和F565-L3soft3(ACTTATTA CTGTCAGCAA878857577577CCTYKGACGTTCGGACAGGGTAC C)(SEQ ID NO:123)以1:0.5:1比例混合，产生“L3软寡聚物混合物。” “L3硬寡聚物混合物、”“L3软寡聚物混合物”和诱变寡核苷酸1F4.L3s oft(GCAACTTATTACTGTCAG CAA857857857857878CCG788ACG TTCGGACAGGGTACCAAG)(SEQ ID NO:124)然后以1:1:1比例混 合(产生“L3总寡聚物混合物”)并且与20μg1F4L3终止模板的Kun kel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1F4H3文库软随机化重链位置95、97、99、100和100a(Kabat 编号)。将诱变寡核苷酸CLC.1F4.H3soft (GACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGC668TAC688TGG555668678 ATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC)(SEQ ID NO:125)与20μg1F4 H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel 诱变产生文库。

1F4L3/H3文库硬随机化轻链位置91-96(Kabat编号)以允许在天 然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻链 位置。其也软随机化重链位置95、97、99、100和100a(Kabat编号)。 将上述的“L3总寡聚物混合物”和诱变寡核苷酸CLC.1F4.H3soft(SEQ  ID NO:126)以1:1比例混合并且与20μg1F4L3/H3终止模板的 Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1F4L1/H2文库硬随机化轻链位置28-33(Kabat编号)以允许在 天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其也软随机化重链 位置50、52、53、54和58(Kabat编号)。将上述的“L1寡聚物混合 物”和诱变寡核苷酸CLC4.1F4.H2soft(GGTAAGGGCCTGGAATGG GTTGCA878ATT857TCT857857AG CTATACT878TATGCCGATAGC GTCAAGGGCCG)(SEQ ID NO:126)以1:1比例混合并且与20μg 1F4L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过K unkel诱变产生文库。

1F4L2/H1文库硬随机化轻链位置50、53和55(Kabat编号)以 允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其也软随机 化重链位置30-33(Kabat编号)。将上述的“L2寡聚物混合物”和诱变 寡核苷酸CLC4.1F4.H1soft(GCAGCTTCTGGCTTCAACTTT8578788 57857ATGCACTGGGTGCGTCAGGCC)(SEQ ID NO:127)以1:1比 例混合并且与20μg1F4L2终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中 描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1F4H2/H3文库软随机化重链位置50、52、53、54、58、95、97、 99、100和100a(Kabat编号)。将上述的诱变寡核苷酸CLC4.1F4.H2soft (SEQ ID NO:126)和CLC4.1F4.H3soft(SEQ ID NO:125)以1:1比例混 合并且与20μg1F4H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的) 组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1F4L1/L2/L3文库硬随机化轻链位置28-33、50、53和55(Kabat 编号)以允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其 也硬随机化轻链位置91-96(Kabat编号)以允许在天然人抗体内的这 些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻链位置。“L1寡聚物 混合物”、“L2寡聚物混合物”和“L3总寡聚物混合物”以1:1:1比例混 合并且与20μg1F4L3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的) 组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1F4L3/H1/H2文库硬随机化轻链位置91-96(Kabat编号)以允许 在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些 轻链位置。其也软随机化重链位置30-33、50、52、53、54和58(Kabat 编号)。将上述的“L3总寡聚物混合物”、CLC4.1F4.H1soft(SEQ ID  NO:127)和CLC4.1F4.H2soft(SEQ ID NO:126)以1:1:1比例混合并且 与20μg1F4L3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合 以通过Kunkel诱变产生文库。

对于1D8产生了十个文库，并指定为L1、L2、L3、L1/L2/L3、 H3、L3/H3、L1/H2、L2/H1、H2/H3和L3/H1/H2。1D8L1文库硬随 机化轻链位置28-33(Kabat编号)以允许在天然人抗体内的这些位置 处找到的氨基酸多样性。将上述的L1诱变寡核苷酸F111-L1(SEQ ID  NO:113)和F202-L1(SEQ ID NO:114)以1:2的比例混合(产生“L1寡聚 物混合物”)并且与20μg1D8L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A 中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1D8L2文库硬随机化轻链位置50、53和55(Kabat编号)以允许 在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。将上述的L2诱 变寡核苷酸F201-L2(SEQ ID NO:115)和F203-L2(SEQ ID NO:116)以 1:1的比例混合(产生“L2寡聚物混合物”)并且与20μg1D8L2终止模 板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生 文库。

1D8L3文库硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号)以允许在 天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻 链位置。将上述的诱变寡核苷酸F133a(SEQ ID NO:117)、F133b(SEQ  ID NO:118)、F133c(SEQ ID NO:119)和F133d(SEQ ID NO:120)以约 1:1:1:1比例混合，产生“L3硬寡聚物混合物”。将上述的诱变寡核苷 酸F563-L3soft1(SEQ ID NO:121)、F564-L3soft2(SEQ ID NO:122)和 F565-L3soft3(SEQ ID NO:123)以1:0.5:1比例混合，产生“L3软寡聚 物混合物”。将“L3硬寡聚物混合物”和“L3软寡聚物混合物”然后以 1:1比例混合并且与20μg1D8L3终止模板的Kunkel DNA(实施例 2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1D8H3文库软随机化重链位置96-100c(Kabat编号)。将诱变寡 核苷酸VH3.1D8.H3soft(GCCGTCTATTATTGTGCTCG TGAG678668878565788788878688ATGGACTACTGGGGTCAAGGA ACC)(SEQ ID NO:128)与20μg1D8H3终止模板的Kunkel DNA(实 施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1D8L3/H3文库硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号)以允 许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这 些轻链位置。其也软随机化重链位置96-100c(Kabat编号)。将上述的 “L3软寡聚物混合物”、“L3硬寡聚物混合物”和诱变寡核苷酸 VH3.1D8.H3soft(SEQ ID NO:128)以0.5:0.5:1比例混合并且与20μg 1D8L3/H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过 Kunkel诱变产生文库。

1D8L1/H2文库硬随机化轻链位置28-33(Kabat编号)以允许在 天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其也软随机化重链 位置50、52、53、54和58(Kabat编号)。将上述的“L1寡聚物混合 物”和诱变寡核苷酸VH3.1D8.H2soft(GGTAAGGGCCTGGAATGGG TTGCT668ATT878CCT857668GGTTATACT657TATGCCGATAGCG TCAAGGGCCG)(SEQ ID NO:129)以1:1比例混合并且与20μg1D8 L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kun kel诱变产生文库。

1D8L2/H1文库硬随机化轻链位置50、53和55(Kabat编号)以 允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其也软随机 化重链位置30-33(Kabat编号)。将上述的“L2寡聚物混合物”和诱变 寡核苷酸VH3.1D8.H1soft(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC5776578 57657ATTCACTGGGTGCGTCAGGCC)(SEQ ID NO:130)以1:1比 例混合且与20μg1D8L2终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中 描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1D8H2/H3文库软随机化重链位置50、52、53、54、58和96-100c (Kabat编号)。将上述的诱变寡核苷酸VH3.1D8.H2soft(SEQ ID  NO:129)和VH3.1D8.H3soft(SEQ ID NO:128)以1:1比例混合并且与 20μg1D8H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以 通过Kunkel诱变产生文库。

1D8L1/L2/L3文库硬随机化轻链位置28-33、50、53和55(Kabat 编号)以允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其 也硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号)以允许在天然人抗体内 的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻链位置。将“L1 寡聚物混合物”、“L2寡聚物混合物”、“L3硬寡聚物混合物”和“L3软 寡聚物混合物”以1:1:0.5:0.5比例混合并且与20μg1D8L3终止模板 的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文 库。

1D8L3/H1/H2文库硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号) 以允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机 化这些轻链位置。其也软随机化重链位置30-33、50、52、53、54和 58(Kabat编号)。将上述的“L3硬寡聚物混合物”、“L3软寡聚物混合 物”、VH3.1D8.H1soft(SEQ ID NO:130)和VH3.1D8.H2soft(SEQ ID  NO:129)以0.5:0.5:1:1比例混合并且与20μg1D8L3终止模板的 Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

对于1E3产生了十个文库，并指定为L1、L2、L3、L1/L2/L3、 H3、L3/H3、L1/H2、L2/H1、H2/H3和L3/H1/H2。1E3L1文库硬随 机化轻链位置28-33(Kabat编号)以允许在天然人抗体内的这些位置 处找到的氨基酸多样性。将上述的L1诱变寡核苷酸F111-L1(SEQ ID  NO:113)和F202-L1(SEQ ID NO:114)以1:2的比例混合(产生“L1寡聚 物混合物”)并且与20μg1E3L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A 中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3L2文库硬随机化轻链位置50、53和55(Kabat编号)以允许 在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。将上述的L2诱 变寡核苷酸F201-L2(SEQ ID NO:115)和F203-L2(SEQ ID NO:116)以 1:1的比例混合(产生“L2寡聚物混合物”)并且与20μg1E3L2终止模 板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生 文库。

1E3L3文库硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号)以允许在 天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻 链位置。将上述的诱变寡核苷酸F133a(SEQ ID NO:117)、F133b(SEQ  ID NO:118)、F133c(SEQ ID NO:119)和F133d(SEQ ID NO:120)以约 1:1:1:1比例混合，产生“L3硬寡聚物混合物”。将上述的诱变寡核苷 酸F563-L3soft1(SEQ ID NO:121)、F564-L3soft2(SEQ ID NO:122)和 F565-L3soft3(SEQ ID NO:123)以1:0.5:1比例混合，产生“L3软寡聚 物混合物”。将“L3硬寡聚物混合物”和“L3软寡聚物混合物”然后以 1:1比例混合并且与20μg1E3L3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A 中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3H3文库软随机化重链位置95、97、98、99和100a(Kabat 编号)。将诱变寡核苷酸VH4.1E3.H3soft(GACACTGCCGTCTATTAT TGTGCTCGT577TGG788788565TGG688ATGGACTACTGGGGTCA AGGAACCCTG)(SEQ ID NO:131)与20μg1E3H3终止模板的Ku nkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3L3/H3文库硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号)以允 许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这 些轻链位置。其也软随机化重链位置95、97、98、99和100a(Kabat 编号)。将上述的“L3软寡聚物混合物”、“L3硬寡聚物混合物”和诱变 寡核苷酸VH4.1E3.H3soft(SEQ ID NO:131)以0.5:0.5:1比例混合并且 与20μg1E3L3/H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组 合以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3L1/H2文库硬随机化轻链位置28-33(Kabat编号)以允许在 天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其也软随机化重链 位置50、52、53、54和58(Kabat编号)。将上述的“L1寡聚物混合 物”和诱变寡核苷酸VH4.1E3.H2soft(GGTAAGGGCCTGGAATGGG TTGCT878ATT577CCT878878GGTTCTA CT657TATGCCGATAGCG TCAAGGGCCG)(SEQ ID NO:132)以1:1比例混合并且与20μg1E 3L1终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Ku nkel诱变产生文库。

1E3L2/H1文库硬随机化轻链位置50、53和55(Kabat编号)以 允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其也软随机 化重链位置30-33(Kabat编号)。将上述的“L2寡聚物混合物”和诱变 寡核苷酸VH4.1E3.H1soft(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTC8785585 77857ATTAGCTGGGTGCGTCAGGCC)(SEQ ID NO:133)以1:1比 例混合并且与20μg1E3L2终止模板的Kunkel DNA(实施例2A 中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3H2/H3文库软随机化重链位置50、52、53、54、58、95、97、 98、99和100a(Kabat编号)。将上述的诱变寡核苷酸VH4.1E3.H2soft (SEQ ID NO:132)和VH4.1E3.H3soft(SEQ ID NO:133)以1:1比例混合 并且与20μg1E3H3终止模板的Kunkel DNA(实施例2A中描述的) 组合以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3L1/L2/L3文库硬随机化轻链位置28-33、50、53和55(Kabat 编号)以允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性。其 也硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号)以允许在天然人抗体内 的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机化这些轻链位置。将“L1 寡聚物混合物”、“L2寡聚物混合物”、“L3硬寡聚物混合物”和“L3软 寡聚物混合物”以1:1:0.5:0.5比例混合并且与20μg1E3L3终止模板 的Kunkel DNA(实施例2A中描述的)以通过Kunkel诱变产生文库。

1E3L3/H1/H2文库硬随机化轻链位置91-94和96(Kabat编号) 以允许在天然人抗体内的这些位置处找到的氨基酸多样性或软随机 化这些轻链位置。其也软随机化重链位置30-33、50、52、53、54和 58(Kabat编号)。将上述的“L3硬寡聚物混合物”、“L3软寡聚物混合 物”、VH4.1E3.H1soft(SEQ ID NO:133)和VH4.1E3.H2soft(SEQ ID  NO:132)以0.5:0.5:1:1比例混合并且与20μg1E3L3终止模板的 Kunkel DNA(实施例2A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

将诱变反应电穿孔入电感受态XL1-Blue(Agilent)大肠杆菌并于 37℃在振摇下在25mL SOC培养基回收45分钟。取出20微升并且 将十倍系列稀释液涂板在含有羧苄青霉素的固体琼脂板上并于37℃ 生长过夜以测定文库大小。将剩余的培养物转移至500mL含有50 μg/mL羧苄青霉素和1x10¹⁰个噬菌体/mL M13K07辅助噬菌体的2YT 肉汤中。将细胞于37℃在振摇下感染1小时。加入50μg/mL卡那霉 素并将培养物于37℃在振摇下再生长7小时。然后将温度变为30℃ 并使培养物再生长22小时。文库各自含有至少约9.5x10⁹个菌落形 成单位(CFU)。通过2轮用1/5体积的20%聚乙二醇(PEG)/2.5M NaCl 沉淀，自培养物上清液纯化噬菌体。

C)亲和力成熟文库分选

1F4、1D8和1E3亲和力成熟文库经历4轮分选。第1轮平行分 选10个子文库中的每一个，然后合并第2-4分选。第1轮是基于板 的分选，其中线性二泛素固定在96孔Maxisorb免疫板(NUNC)上。 将板于4℃用5μg/mL线性二泛素(Boston Biochem)在50mM碳酸钠 缓冲液(pH9.6)中包被过夜。将经包被的板于25℃在振摇下用200μL/ 孔的含有0.05%Tween20的PBS(PBST)中的2.5%牛乳封闭1小时。 将噬菌体文库在PBST中的2.5%牛乳稀释至OD=2.0并且加入30 μg/mL K63连接的聚泛素2-7(Boston Biochem)用于反选择。1小时后， 将封闭缓冲液自板倾倒出并且加入100μL/孔的噬菌体，并在振摇下 于25℃温育3小时。结合后，通过手动填充各孔且在洗涤之间倒出 缓冲液而用PBST洗板20次。将噬菌体于25℃在振摇下用150μL/ 孔50mM HCl/500mM KCl洗脱30分钟。用150μL/孔的1M Tris(pH 7.5)中和洗脱液并随后在XL1-Blue(Agilent)大肠杆菌中添加M13K07 辅助噬菌体来繁殖。

扩增的噬菌体用于在基于板的分选中进行另外几轮针对线性二 泛素的选择。基于溶液的分选不可能，因为线性二泛素的生物素化干 扰Fab结合。以三种方式提高后几轮分选的严格性：通过将30μg/mL 可溶性单泛素、K11连接的聚泛素、K48连接的聚泛素2-7和K63连 接的聚泛素2-7添加至噬菌体用于反选择；通过增加洗板的次数和持 续时间；和通过减少所用噬菌体的量和噬菌体结合的持续时间。完全 像第一轮分选那样进行第二轮分选，只是扩展所添加的可溶性泛素以 包括上文列出的链、所用噬菌体的量为OD₂₆₈=1.0、噬菌体结合的持 续时间减少至2小时，以及洗板次数增加至30次。完全像第二轮分 选那样进行第三轮分选，只是噬菌体结合的持续时间减少至1.5小时 和洗板次数增加至40次，接着于25℃在振摇下进行另外4次洗涤(每 次15分钟)，其中每次15分钟洗涤之间有五次快速的洗涤。完全像 第三轮分选那样进行第四轮分选，只是所用噬菌体的量降至 OD₂₆₈=0.5、噬菌体结合的持续时间减少至1小时，以及洗涤包括40 次快速洗涤，接着于37℃在振摇下进行4次各15分钟的洗涤。与未 包被的孔比较，通过比较用线性二泛素回收的噬菌体的数量来计算第 2轮至第4轮的富集。对于所有三个文库在第2轮至第4轮中均观察 到富集(见表3)。

表3

4轮分选后，自1F4第3轮分选、1D8第2轮分选、1D8第3轮 分选、1D8第4轮分选和1E3第3轮分选挑选96个单独克隆并且以 96孔形式在1mL含有50μg/mL羧苄青霉素和1x10¹⁰个噬菌体/mL  M13K07辅助噬菌体的2YT肉汤中生长。在高通量噬菌体点ELISA 中使用来自那些培养物的上清液用于结合线性二泛素(Boston  Biochem)、单泛素(Boston Biochem)、K11连接的二泛素(Genentech)、 K48连接的二泛素(Boston Biochem)、K63连接的二泛素(Boston  Biochem)、抗gD抗体(Genentech)或未包被的孔(实施例1B中描述的)。 来自1F4第3轮分选的所有克隆均为非常弱的线性二泛素结合物，显 示OD₄₅₀小于0.4，因此未进行研究。来自1D8第2轮分选的93个克 隆为线性二泛素特异性的，但是测序揭示所有均是亲本野生型1D8 序列。来自1D8第3轮分选的48个克隆为线性二泛素特异性的，但 是测序揭示其中仅有2个是亲本野生型1D8序列。两个非亲本克隆 1D8.3C2(SEQ ID NO:33和36)和1D8.3F8(SEQ ID NO:34和37)(见 图5A和5B)如实施例1D中所述通过噬菌体IC₅₀ELISA进行测试并 且显示对于线性二泛素具有低μM范围的IC₅₀，比1D8只有略微改善 (见图6)。来自1D8第4轮分选的94个克隆显示与线性二泛素和K63 连接的二泛素的强结合(对于线性二泛素OD₄₅₀大于1.0，对于K63连 接的二泛素OD₄₅₀大于0.5)，并且因此未进行研究。仅有一个克隆 1D8.4F5(SEQ ID NO:35和38)(见图5A和5B)显示强线性二泛素结 合和弱K63连接的二泛素结合(对于K63，OD₄₅₀约1.3,OD₄₅₀约0.1)。 也如实施例1D中所述通过ELISA测量1D8.4F5的噬菌体IC₅₀并且测 定为约2μM，比亲本克隆1D8仅仅略好(见图6)。来自1E3第3轮 分选的33个克隆为线性二泛素特异性的，但是它们均为非常弱的结 合物(OD₄₅₀小于0.5)，并且因此未进行研究。另外的27个克隆显示 与线性二泛素较强的结合(OD₄₅₀大于0.5但小于1.0)，但是它们也显 示与K63连接的二泛素增加的结合(OD₄₅₀大于0.1)，并且因此未进行 研究。

实施例3-1E3的第二亲和力成熟

A)终止模板产生

将TAA终止密码子分开地插入到CDR L1、CDR L2、CDR L3、 CDR H1、CDR H2和CDR H3(分别产生L1、L2、L3、H1、H2和 H3终止模板)，用于使用Kunkel诱变的文库合成。通过要求修复终 止以获得全长Fab表达和在噬菌体上展示，终止密码子促成特定CDR 环内的多样性。将下文所列的终止密码子诱变寡核苷酸与1μg1E3 单价噬菌粒Kunkel DNA组合。所得单价Fab噬菌粒终止模板用于亲 和力成熟文库产生。

用于在1E3轻链的CDR L1内位置31(Kabat编号)插入TAA终 止密码子的诱变寡核苷酸是E3.L1stop(GCCAGTCAGGATGTG TC CTAAGCTGTAGCCTGGTATCAAC)(SEQ ID NO:134)。用于在1E3 轻链CDR L2内位置53(Kabat编号)插入TAA终止密码子的诱变寡 核苷酸是E3.L2stop(CTGATTTACTCGGCATCCTAACTCTACTCTG GAGTCCCTTC)(SEQ ID NO:135)。用于在1E3轻链CDR L3内位 置93(Kabat编号)插入TAA终止密码子的诱变寡核苷酸是E3.L3stop (CTTATTACT GTCAGCAATCTTATTAAACTCCTCCCACGTTCGGA CAG)(SEQ ID NO:136)。用于在1E3轻链CDR H1内位置32(Kaba t编号)插入TAA终止密码子的诱变寡核苷酸是E3.H1stop(GGCTTC ACCTTC AGTAATTAATATATTAGCTGGGTGCGTC)(SEQ ID NO: 137)。用于在1E3轻链CDR H2内位置54(Kabat编号)插入TAA终 止密码子的诱变寡核苷酸是E3.H2stop(GTTGCTTCTATTACTCCTT AAAGCGGTTCTACTGACTATG)(SEQ ID NO:138)。用于在1E3轻 链CDR H3内位置99(Kabat编号)插入TAA终止密码子的诱变寡核 苷酸是E3.H3stop(GCTCGTACCTGGTTGCTCTAATGGGTTATGGA CTACTGG)(SEQ ID NO:139)。

B)单一位置NNK文库产生

由于在1F4和1D8的亲和力成熟方面的第一次尝试仅导致亲和 力适度改善，而IC₅₀仍处于低μM范围，所以关注具有80nM的初始 IC₅₀的克隆1E3。在1E3亲和力成熟方面的第一尝试产生许多显示与 线性连接的和K63连接的二泛素的强结合的克隆。因此采取不同方 法以通过限定掺入单一克隆的突变次数来使K63连接的二泛素结合 降至最低。利用单一位置NNK随机化以一次向一个CDR掺入单一 氨基酸变化。产生指定为L1、L2、L3、H1、H2和H3的六个单一 CDR文库，其中允许任何一个克隆中的单一残基保留野生型残基或 变为其它19种氨基酸中的任一种。

L1文库使用NNK密码子单独地硬随机化轻链位置28-34(Kabat 编号)以考虑到所有20种氨基酸。将L1诱变寡核苷酸

E3.L1.1

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGNNKGTGTCCACTGCTG TAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:140)、

E3.L1.2

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATNNKTCCACTGCTGTAGCC TGGTATC AACAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:141)、

E3.L1.3

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGNNKACTGCTGTAGCC TGGTATCA ACAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:142)、

E3.L1.4

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCNNKGCTGTAGCC TGGTATCAA CAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:143)、

E3.L1.5

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTNNKGTAGCC TGGTATCA ACAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:144)、

E3.L1.6

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTGCTNNKGCC TGGTATCAA CAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:145)和

E3.L1.7

(CATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGTCCACTGCTGTANNK TGGTATCAA CAGAAACCAGG)(SEQ ID NO:146)以1:1:1:1:1:1:1比 例混合并且与20μg1E3L1终止模板的Kunkel DNA(实施例3A中描 述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

L2文库使用NNK密码子单独地硬随机化轻链位置50-56(Kabat 编号)以考虑到所有20种氨基酸。将L2诱变寡核苷酸

E3.L2.1

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACNNKGCATCCTTCCTCTACTCTG GAGTCCCTTCTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:147)、

E3.L2.2

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGNNKTCCTTCCTCTACTCTGG AGTCCCTT CTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:148)、

E3.L2.3

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCANNKTTCCTCTACTCTGG AGTCCCTT CTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:149)、

E3.L2.4

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCNNKCTCTACTCTGG AGTCCCTT CTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:150)、

E3.L2.5

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCNNKTACTCTGG AGTCCCTT CTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:151)、

E3.L2.6

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCNNKTCTGG AGTCCCTT CTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:152)和

E3.L2.7

(GCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACNNKGG AGTCCCTT CTCGCTTCTCTG)(SEQ ID NO:153)以1:1:1:1:1:1:1比 例混合并且与20μg1E3L2终止模板的Kunkel DNA(实施例3A中描 述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

L3文库使用NNK密码子单独地硬随机化轻链位置91-96(Kabat 编号)以考虑到所有20种氨基酸。将L3诱变寡核苷酸

E3.L3.1

(GCAACTTATTACTGTCAGCAANNKTATACTACTCCTCCCACG TTCGGACAGGGTACCAAG)(SEQ ID NO:154)、

E3.L3.2

(GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTNNKACTACTCCTCCCACGTT CGGACA GGGTACCAAG)(SEQ ID NO:155)、

E3.L3.3

(GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATNNKACTCCTCCCACGTT CGGACA GGGTACCAAG)(SEQ ID NO:156)、

E3.L3.4

(GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTNNKCCTCCCACGTT CGGACA GGGTACCAAG)(SEQ ID NO:157)、

E3.L3.5

(GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTACTNNKCCCACGTT CGGACA GGGTACCAAG)(SEQ ID NO:158)和

E3.L3.6

(GCAACTTATTACTGTCAGCAATCTTATACTACTCCTNNKACGTT CGGACA GGGTACCAAG)(SEQ ID NO:159)以1:1:1:1:1:1比例混合 并且与20μg1E3L3终止模板的Kunkel DNA(实施例3A中描述的) 组合以通过Kunkel诱变产生文库。

H1文库使用NNK密码子单独地硬随机化重链位置30-35(Kabat 编号)以考虑到所有20种氨基酸。将H1诱变寡核苷酸

E3.H1.1

(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCNNKAATACTTATATTAGCT GGGTGCGTCAGGCCCCG)(SEQ ID NO:160)、

E3.H1.2

(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTNNKACTTATATTAGCTGGGT GCG TCAGGCCCCG)(SEQ ID NO:161)、

E3.H1.3

(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATNNKTATATTAGCTGGGT GCG TCAGGCCCCG)(SEQ ID NO:162)、

E3.H1.4

(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTNNKATTAGCTGGGT GCG TCAGGCCCCG)(SEQ ID NO:163),

E3.H1.5

(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTTATNNKAGCTGGGT GCG TCAGGCCCCG)(SEQ ID NO:164)和

E3.H1.6

(GCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGTAATACTTATATTNNKTGGGT GCG TCAGGCCCCG)(SEQ ID NO:165)以1:1:1:1:1:1比例混合并且 与20μg1E3H1终止模板的Kunkel DNA(实施例3A中描述的)组合 以通过Kunkel诱变产生文库。

H2文库使用NNK密码子单独地硬随机化重链位置49-58(Kabat 编号)以考虑到所有20种氨基酸。将H2诱变寡核苷酸

E3.H2.1

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTNNKTCTATTACTCCTTCTAGCG GTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID  NO:166)、

E3.H2.2

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTNNKATTACTCCTTCTAGCG GTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID  NO:167)、

E3.H2.3

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTNNKACTCCTTCTAGCG GTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID  NO:168)、

E3.H2.4

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTNNKCCTTCTAGCG GTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID  NO:169)、

E3.H2.5

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTNNKTCTAGCG GTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID  NO:170)、

E3.H2.6

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTNNKAGCG GTTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID  NO:171)、

E3.H2.7

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTNNKGG TTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID NO:172)、

E3.H2.8

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCNN KTCTACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID NO:173)、

E3.H2.9

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGG TNNKACTG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID NO:174)、

E3.H2.10

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGG TTCTNNKG ACTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID NO:175) 和

E3.H2.11

(GGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTCTATTACTCCTTCTAGCGG TTCTACT NNKTATGCCGATAGCGTCAAGGGC)(SEQ ID NO:176) 以1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合并且与20μg1E3H2终止模板的 Kunkel DNA(实施例3A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

H3文库使用NNK密码子单独地硬随机化重链位置95-102 (Kabat编号)以考虑到所有20种氨基酸。将H3诱变寡核苷酸

E3.H3.1

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTNNKTGGTTGCTCCGGTGGGTTAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:177)、

E3.H3.2

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCNNKTTGCTCCGGTGGGTTAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:178)、

E3.H3.3

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGNNKCTCCGGTGGGTTAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:179)、

E3.H3.4

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGNNKCGGTGGGTTAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:180)、

E3.H3.5

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCNNKTGGGTTAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:181)、

E3.H3.6

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGNNKGTTAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:182)、

E3.H3.7

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGNNKAT GGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:183)、

E3.H3.8

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTNN KGACTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:184)、

E3.H3.9

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTAT GNNKTAC TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:185)和

E3.H3.10

(GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTGGTTGCTCCGGTGGGTTAT GGACNNKT GGGGTCAAGGAACCCTGGTC)(SEQ ID NO:186)以 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1比例混合并且与20μg1E3H3终止模板的Kunkel  DNA(实施例3A中描述的)组合以通过Kunkel诱变产生文库。

将诱变反应电穿孔入电感受态XL1-Blue(Agilent)大肠杆菌并于 37℃在振摇下在25mL SOC培养基中回收45分钟。取出20微升并 且将十倍系列稀释液涂板在含有羧苄青霉素的固体琼脂板上并于37 ℃生长过夜以测定文库大小。将剩余的培养物转移至500mL含有50 μg/mL羧苄青霉素和1x10¹⁰个噬菌体/mL M13K07辅助噬菌体的2YT 肉汤。将细胞于37℃在振摇下感染1小时。加入50μg/mL卡那霉素 并使培养物于37℃在振摇下再生长7小时。然后将温度变为30℃并 使培养物再生长22小时。文库各自含有至少约1.5x10¹⁰个菌落形成 单位(CFU)。通过2轮用1/5体积的20%聚乙二醇(PEG)/2.5M NaCl 沉淀，自培养物上清液纯化噬菌体。

对来自六个文库中的每一个的64个单独克隆进行测序以确保文 库中准确地反映设计的氨基酸多样性。文库均如所设计的那样。

C)亲和力成熟文库分选

使6个CDR NNK亲和力成熟文库平行地经历针对线性二泛素或 K63连接的二泛素的3轮分选。将板于4℃用5μg/mL线性二泛素 (Boston Biochem)或K63连接的二泛素(Boston Biochem)在50mM碳 酸钠缓冲液(pH9.6)中包被过夜。将经包被的板于25℃在振摇下用200 μL/孔的含有0.05%Tween20的PBS(PBST)中的2.5%牛乳封闭1小 时。将噬菌体文库在PBST中的2.5%牛乳中稀释至OD=1.0。1小时 后，将封闭缓冲液自板倾倒出并且加入100μL/孔的噬菌体，并在振 摇下于25℃温育1.5小时。结合后，通过手动填充各孔且在洗涤之间 倒出缓冲液而用PBST洗板10次。将噬菌体于25℃在振摇下用100 μL/孔的50mM HCl/500mM KCl洗脱30分钟。用100μL/孔的1M Tris(pH7.5)中和洗脱液并随后在XL1-Blue(Agilent)大肠杆菌中添加 M13K07辅助噬菌体来繁殖。

扩增的噬菌体用于在基于板的分选中进行另外几轮针对线性二 泛素或K63连接的二泛素的选择。基于溶液的分选不可能，因为线 性二泛素的生物素化干扰1E3Fab结合。以两种方式提高后几轮分选 的严格性：通过增加洗板的次数和持续时间；和通过减少所用噬菌体 的量和噬菌体结合的持续时间。完全像第一轮分选那样进行第二轮分 选，只是所用噬菌体的量为OD₂₆₈=0.5、以及洗板次数增加至21次， 其中最后一次洗涤于25℃在振摇下温育5分钟。完全像第二轮分选 那样进行第三轮分选，只是噬菌体结合的持续时间减少至1小时和洗 板次数增加至30次。对于线性二泛素分选，接着于25℃在振摇下进 行另外4次洗涤(每次15分钟)，其中每次15分钟洗涤之间有五次快 速的洗涤。然后在振摇下于25℃进行1小时洗涤，之后五次快速的 洗涤。与未包被的孔比较，通过比较用线性二泛素或K63连接的二 泛素回收的噬菌体的数量来计算第2轮和第3轮的富集。对于针对线 性二泛素分选的所有六个文库在第2轮和第3轮中均观察到强富集， 其中对于K63连接的二泛素仅观察到适度富集(见表4)。

表4

3轮分选后，对于来自线性二泛素第2轮分选、线性二泛素第3 轮分选和K63连接的二泛素第3轮分选的6个文库中的每一个挑选 64个单独克隆并且以96孔形式在1mL含有50μg/mL羧苄青霉素和 1x10¹⁰个噬菌体/mL M13K07辅助噬菌体的2YT肉汤中生长。如前所 述(实施例1B)来自那些培养物的上清液用于高通量噬菌体点ELISA 中用于结合1μg/mL包被的线性二泛素(Boston Biochem)、K63连接 的二泛素(Boston Biochem)、抗gD抗体(Genentech)或未包被的孔。也 对这些克隆的可变域进行测序(见表5-线性二泛素和表6-K63连接 的二泛素)。对H3克隆的测序揭示了除期望突变之外，T110A突变也 存在于靶向文库设计中的随机化的区域外部的一些克隆中。这可能归 因于寡核苷酸合成错误或诱变错误。

D)单一点竞争噬菌体ELISA

进行单一点竞争噬菌体ELISA以测定哪个克隆对线性二泛素的 亲和力与亲本1E3克隆相比有最大的改善。使用来自噬菌体点ELISA 的噬菌体上清液(实施例3C)。如对于IC₅₀ELISA所述(实施例1D)进 行竞争ELISA，只是使用噬菌体上清液替代纯化的噬菌体以及仅使用 单一浓度(25nM)的可溶性线性二泛素(Boston Biochem)。也在不添加 任何可溶性线性二泛素的情况下对每个克隆进行竞争以测定缺少任 何竞争抗原下的噬菌体结合信号。在25nM线性二泛素存在下结合的 百分比抑制计算为[1-(25nM线性二泛素的OD₄₅₀/无线性二泛素的 OD₄₅₀)]x100%。1E3亲本克隆显示在25nM线性二泛素存在下可变 的结合的百分比抑制范围为20%至75%抑制(见表5)。这归因于在缺 少任何竞争可溶性线性二泛素下结合线性二泛素的OD₄₅₀的可变性。 通过噬菌体IC₅₀ELISA选择显示60百分比抑制或更高的克隆或在线 性二泛素分选中分离多次的那些，用于进一步分析。

下文表5示出来自分离自1E3L1、L2、L3、H1、H2和H3NNK 文库分别针对线性二泛素的分选的克隆的CDR L1、L2、L3、H1、 H2和H3序列。还显示来自竞争点ELISA的在缺少和存在25nM可 溶性线性二泛素下的OD₄₅₀信号。在存在25nM线性二泛素下的结合 的百分比抑制计算为[1-(25nM线性二泛素的OD₄₅₀/无线性二泛素的 OD₄₅₀)]x100%。下表6示出来自分离自1E3L1、L2、L3、H1、H2 和H3NNK文库的分别针对K63连接的二泛素的克隆的CDR L1、L2、 L3、H1、H2和H3序列。

表5按出现次序分别以SEQ ID NO1、56、199、200、200、57、 201、202、202、203、204、204-207、207、208、50、50、50、50、 50、50、209、209、54、54、54、54、210、55、55、53、211、212、 212、212-214、52、52、215、215、215、216、216、217、217、217、 218、1、1、1、1、1、1、1、1、1、1、1、1、1、1和1公开CDR L1 序列。表5按出现次序分别以SEQ ID NO2、59、59、58、58、58、 219、60、60、60、60、60、60、60、60、60、60、220、220、220、 220、221、221-223、223-226、226、226、62、227、228、228、229、 61、61、230-233、233-237、237、238、238、238、239、239、239、 2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2和2公开CDR L2序列。表5按 出现次序分别以SEQ ID NO3、6、6、240、240、240-242、66、66、 66、66、243、68、244、244-247、247、248、248、248、70、64、 64、64、64、249、250、250、71、71、251、72、72、72、72、72、 72、72、69、65、65、65、252、252、252、252、252、67、67、67、 67、67、67、67、67、253、3、3、3、3和254公开CDR L3序列。 表5按出现次序分别以SEQ ID NO255、256、73、79、79、257、257、 75、75、75、75、77、77、77、77、77、77、77、258、258、259、 81、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、 78、76、76、76、76、76、76、76、76、76、76、80、80、80、260、 260、255、255、255、255、255、255、255、255、255、255、255、 255和255公开CDR H1序列。表5分别按出现次序分别以SEQ ID NO 8、17、84、261、261、261、261、261-263、85、83、83、264、82、 82、82、82、82、82、82、82、82、82、82、86、8、8、8、8、8、8、 8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、8、 8、8、8、8、8、8、8、8、8、8和8公开CDR H2序列。表5按出 现次序分别以SEQ ID NO265-269、269、270-273、273、273、273、 273、273、273、273、273、273、273、273、273、273、273、273、 273、273、273、273、273、273、273、273、273、273、273、273、 273、273、274、274、274、274、274-278、278、278、278-281、281、 282、282、282、282、265、265、265、265、265、265和265公开 CDR H3序列。

表5-L1NNK第3轮分选线性

表5(续)-L2NNK第3轮分选线性

表5(续)-L3NNK第3轮分选线性

表5(续)-H1NNK第3轮分选线性

表5(续)-H2NNK第3轮分选线性

表5(续)-H3NNK第3轮分选线性

表6按出现次序分别以SEQ ID NO1、283、50、50、50、50、 50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、 50、50、284、54、285、285-288、55、55、55、53、289、289、290、 290、290、290、290、290-294、327、295、295、295、295-297、297、 1、1、1、1、1、1和1公开CDR L1序列。表6按出现次序分别以 SEQ ID NO2、298、299、60、60、300、302-305、305-307、307、 307-309、309、309、310、310-314、314、314、314、314、314、314、 314、314、314、314、315、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、 2、2、2、2和2公开CDR L2序列。表6按出现次序分别以SEQ ID NO 3、6、6、6、6、6、316-318、318、319、66、66、320、321、321、 321、321-324、324、324、325、301、326、301、326、382、328、 328、329、64、64、330、330、331、331、331、331、331、71、71、 71、71、71、71、332、69、333、333、67、67、67、67、67、334、 334、334、335、335、335、3、3、3和3公开CDR L3序列。表6 按出现次序分别以SEQ ID NO255、336、337、337、337、337、337、 337、337、337、337、337、337、337、337-340、340-343、343、343、 343、343、343、344、344、344、344、344、344、81、81、81、81、 81、81、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、74、 74、76、76、76、76、76、76、76、76、76、76和255公开CDR H1 序列。表6按出现次序分别以SEQ ID NO8、346、347、345、348、 349、349、349、349、349、349、349、349、349、349、349、349、 349-351、351、351、351、352、352、352、353、353、353、353、 353、353、353、353、353、353、353、353、353、353、353、353、 353、353、353、353、353、353、353、353、353、353、353、353、 353、353、353、353、353、354、8、8、8、8、8和8公开CDR H2 序列。表6按出现次序分别以SEQ ID NO355-358、358、359、359-362、 362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、 362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、 362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、362、 362-367、355、355、355、355、355、355、355、355、355和355 公开CDR H3序列。“O”是赭石终止TAA且“q”是琥珀终止TAG，其 可例如借助于使用阻抑基因tRNA细胞系被Gln(Q)替代。

表6-L1NNK第3轮分选K63二泛素选择的克隆

表6(续)-L2NNK第3轮分选K63二泛素选择的克隆

表6(续)-L3NNK第3轮分选K63二泛素选择的克隆

表6(续)-H1NNK第3轮分选K63二泛素选择的克隆

表6(续)-H2NNK第3轮分选K63二泛素选择的克隆

表6(续)-H3NNK第3轮分选K63二泛素选择的克隆

E)噬菌体IC₅₀ELISA

如实施例1D中描述的，在噬菌体IC₅₀ELISA中测试来自L1文 库的8个克隆、来自L2文库的6个克隆、来自L3文库的9个克隆、 来自H1文库的9个克隆、来自H2文库的5个克隆和来自H3文库 的7个克隆。使用8个线性二泛素(Boston Biochem)的三倍系列稀释 液(500nM至0.23nM)。在每个实验中包括WT1E3克隆用于比较。 1E3的IC₅₀值随实验不同而变化，但是可鉴定显示对线性二泛素的亲 和力比亲本克隆高的克隆。试图鉴定具有改善的对线性二泛素的亲和 力和最小的K63二泛素结合的突变体，通过考虑它们与亲本1E3相 比是否已改善IC₅₀值、它们是否在K63连接的二泛素分选(实施例3C) 中被分离、以及它们在噬菌体点ELISA(实施例3C)中结合K63连接 的二泛素的信号而缩小在IC₅₀ELISA中测试的克隆。与1E3相比具 有改善的IC₅₀值的克隆在线性二泛素分选中被分离多次但在K63连 接的二泛素分选中未被分离并且在点ELISA中显示无K63连接的二 泛素结合(OD₄₅₀小于0.1)，则选择那些克隆用于进一步分析(1F11、 2A2、2C11、2H5、3E4、4C9、4E4和4G7)(见表7)。如果具有改善 的IC₅₀的在线性二泛素分选中被分离多次的克隆在K63连接的二泛 素分选中仅被分离一次，并且在噬菌体点ELISA中显示无K63连接 的二泛素结合，那么其被认为用于进一步分析(3F5)(见表7)。在线性 二泛素分选和K63连接的二泛素分选中均被分离多次的克隆3A7和 4C10被选择用作阴性对照。在噬菌体特异性ELISA中进一步测试这 些11个克隆和1E3。下文表7示出来自1E3L1、L2、L3、H1、H2 和H3NNK文库分别针对线性二泛素的分选的克隆的CDR L1、L2、 L3、H1、H2和H3序列被噬菌体IC₅₀ELISA进一步表征。给出IC₅₀和相比于亲本1E3IC₅₀的倍数改善。在噬菌体点ELISA中，与K63 连接的二泛素的结合被定义为具有大于0.1的OD₄₅₀。在噬菌体点竞 争ELISA中也示出在25nM可溶性线性二泛素存在下结合的百分比 抑制。标示了每个克隆在文库分选中针对线性二泛素或K63连接的 二泛素被分离的次数。

表7按出现次序分别以SEQ ID NO1、1和50-57公开CDR L1 序列。表7按出现次序分别以SEQ ID NO2和58-63公开CDR L2序 列。表7按出现次序分别以SEQ ID NO3、3、64、65、3和66-72公 开CDR L3序列。表7按出现次序分别以SEQ ID NO255和73-81公 开CDR H1序列。表7按出现次序分别以SEQ ID NO8和82-86公开 CDR H2序列。表7按出现次序分别以SEQ ID NO368-372、368和 373-375公开CDR H3序列。

F)噬菌体特异性ELISA

在噬菌体特异性ELISA中针对单泛素(Boston Biochem)、线性二 泛素(Boston Biochem)、K11连接的二泛素(Genentech)、K48连接的 二泛素(Boston Biochem)、K63连接的二泛素(Boston Biochem)、抗gD 抗体(Genentech)或未包被的孔测试1F11、2A2、2C11、2H5、3E4、 4C9、4E4、4G7、3F5、3A7和4C10以及亲本克隆1E3。将这组泛素 蛋白质固定在96孔Maxisorb免疫板(NUNC)上(见图7A和7B)。将板 于4℃用1μg/mL每种蛋白质在50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中包被 过夜。将经包被的板于25℃在振摇下用200μL/孔的PBST中的2.5% 牛乳封闭1小时。在PBST中的2.5%牛乳中制备噬菌体的6个两倍 系列稀释液，从OD₂₆₈=1.0至OD₂₆₈=0.03。1小时后，将封闭缓冲 液自板倾倒并且加入100μL/孔的噬菌体系列稀释液。将板于25℃在 振摇下温育1小时。然后使用洗板机用PBST洗涤六次。使用抗M13 辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(GE Healthcare)在PBST中的 1:5,000稀释液用于检测噬菌体结合。加入100μL/孔的二次稀释液且 将板于25℃在振摇下温育1.25小时。然后将板使用洗板机用PBST 洗涤六次和手动用PBS洗涤两次。所结合的二抗使用TMB底物(KPL) 检测，之后用等体积的1M磷酸淬灭。于450nm读取吸光度。

在线性二泛素分选和K63连接的二泛素分选中被分离多次的克 隆3A7和4C10用作阴性对照。两者均在噬菌体OD₂₆₈=1.0时显示显 著的K63连接的结合(对于3A7和4C10分别为OD₄₅₀=0.44和OD₄₅₀=0.5)(见图7A和7B)。在K63连接的二泛素分选中被分离两次的2A2 示出中等水平的K63连接的结合(在噬菌体OD₂₆₈=1.0时OD₄₅₀=0.2)。 所有其它克隆显示极少的K63连接的二泛素结合(在噬菌体OD₂₆₈=1.0 时OD₄₅₀<0.16)。

G)克隆轻链/重链双突变体

选择相比于亲本1E3显示改善的IC₅₀(实施例3E)并且在噬菌体 特异性ELISA中显示极少的K63连接的二泛素结合(实施例3F)的克 隆，供作进一步考虑。这些包括轻链突变体1F11、2C11和2H5和重 链突变体3E4、3F5和4G7。为了观察是否存在亲和力改善的累加效 应，构建联合不同轻链和重链突变的组合的双突变体。轻链可变域通 过用EcoRV和KpnI消化噬菌粒而去除，然后使用相同位点被克隆进 各种重链突变体噬菌粒中。

H)双突变体噬菌体IC₅₀ELISA

在如前所述的噬菌体IC₅₀ELISA中，将双突变体1F11/3E4、 1F11/3F5、1F11/4G7、2C11/3E4、2C11/3F5、2C11/4G7、2H5/3E4、 2H5/3F5和2H5/4G7与其各自单突变体和亲本1E3比较(实施例1D 和3E)。双突变体1F11/3F5和2H5/3F5显示亲和力相比于其单独的单 突变体具有累加性改善(见表8)。2C11/3F5为边界线累加作用。该特 定测定中的单突变体3F5给出IC₅₀(9nM)低于能使2C11/3F5(10nM 的IC₅₀)看似无累加作用的其它两个实验(12或13nM)。因此，还选择 2C11/3F5供作进一步考虑。

表8

I)双突变体噬菌体特异性ELISA

在如实施例3F的噬菌体特异性ELISA中，将双突变体1F11/3F5、 2C11/3F5和2H5/3F5与其各自单突变体和亲本1E3比较。所有双突 变体显示极少的K63连接的二泛素结合(在噬菌体OD₂₆₈=1.0时 OD₄₅₀<0.1)(见图8A和8B)。

J)双突变体Fab生成

通过如实施例1E中所述在CH1域末端将TAA终止密码子插入 到噬菌粒中，将亲本克隆(1E3)、单突变体(1F11、2C11、2H5、3F5) 和双突变体(1F11/3F5、2C11/3F5、2H5/3F5)克隆为Fab表达构建体。 这些Fab在大肠杆菌中表达且如实施例1E所述进行纯化。

K)转化为IgG形式

如人免疫球蛋白(IgG)一样，亲本克隆(1E3)、单突变体(1F11、 2C11、2H5、3F5)和双突变体(1F11/3F5、2C11/3F5、2H5/3F5)也在 HEK293细胞中表达。通过将Fab可变域克隆进编码人κIgG1的重链 和轻链的pRK哺乳动物表达构建体中来产生表达构建体(Gorman等， DNA Prot.Eng.Tech.2:3-10(1990))。通过如实施例1E中对于Fab纯 化所述的标准方法在蛋白质A-琼脂糖柱上经亲和色谱法纯化IgG。

L)双突变体Biacore

使用BIACORE^TM3000(GE Healthcare)和如实施例1G中描述的 直接结合，通过表面等离振子共振(SPR)分析双突变体Fab(来自实施 例3J)的亲和力。使用制造商供应的胺偶联方案将约150共振单位(RU) 的线性二泛素(Boston Biochem)、K48连接的二泛素(Boston Biochem) 和K63连接的二泛素(Boston Biochem)分别固定在CM5芯片的流动室 2、流动室3和流动室4上。流动室1被激活且在不固定蛋白质的情 况下用乙醇胺封闭，以用于减法参照。即使用10mM甘氨酸(pH1.7)， 芯片表面也不会完全再生回到基线并且观察到RU的增加，这表明芯 片表面发生变化。

利用来自实施例3K的IgG使用IgG捕获方法在BIACORE^TM3000(GE Healthcare)上测试替代性方法。使用制造商供应的胺偶联方 案将约8,000共振单位(RU)的抗人Fc捕获抗体(GE Healthcare)固定在 CM5芯片的流动室1和2上。以30μL/分钟的流速在流动室2上注 入60μL10mM Hepes中的1μg/mL IgG(pH7.2)、150mM NaCl和 0.01%Tween20(HBST)，导致捕获约750RU的IgG。流动室1在它 上面仅有捕获抗体以充当减法参照。在流动室1和2上注入(总共60 μL，以30μL/分钟的流速)线性二泛素(Boston Biochem)或K63连接的 二泛素(Boston Biochem)在HBST中的两倍系列稀释液(3.9-500nM)。 记录每个流动室的信号且减去参照信号。在4分钟的解离时段后，以 30μL/分钟的流速用15μL3M MgCl₂的一次注入使芯片表面再生。与 Fab捕获Biacore实验非常类似(见实施例1G)，数据难以拟合至任何 结合模型，因为二泛素不完全从芯片解离。此外，解离速率非常快并 且即使在所用的二泛素最高浓度下结合并未达到稳态。因此，难以估 算这些IgG的KD。

M)具有双突变体的纯化的二泛素的蛋白质印迹法

为了对双突变体的亲和力和特异性排序，在蛋白质印迹法中测试 实施例3K中描述的IgG结合与线性二泛素(Boston Biochem)和K63 连接的二泛素(Boston Biochem)的结合。将1μg K63连接的二泛素和 5个线性二泛素(1000、333、111、37、12ng)在含还原剂的1X LDS 缓冲液(Invitrogen)中的三倍系列稀释液于70℃加热十分钟并且在 4-12%NuPAGE Bis Tris1.0mm凝胶上于MES缓冲液(Invitrogen)中运 行。凝胶在恒定30V下通过在10%甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液 (Invitrogen)中的湿转移对0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)转移1小时。 通过于25℃在振摇下在PBST中的5%牛乳中温育1小时来封闭膜上 的非特异性结合位点。然后将膜于25℃在振摇下在PBST中的5%牛 乳中的1μg/mL1E3、1F11、2C11、2H5、3F5、1F11/3F5、2C11/3F5 或2H5/3F5IgG中温育1小时。将膜在PBST中在振摇下洗涤三次。 通过将膜于25℃在振摇下在山羊抗人Fc片段特异性IR染料800CW 偶联的二抗(Rockland Immunochemicals)在PBST中的5%牛乳中的 1:10,000稀释液中温育30分钟，来检测IgG。然后将膜在PBST中洗 涤三次，之后在PBS中洗涤1次。使用LI-COR Odyssey红外成像系 统(LI-COR Biosciences)检测二抗并定量。

单突变体1F11和3F5的灵敏度比亲本1E3相当更高，而单突变 体2C11和2H5仅有略微改善(见图10)。双突变体1F11/3F5的灵敏度 比各自单突变体具有累加性改善，而2C11/3F5和2H5/3F5比单独3F5 没有好多少。

N)克隆三突变体

为了观察亲和力的进一步改善是否可通过组合三个突变来实现， 产生1F11/2C11/3F5和1F11/2H5/3F5三突变体。将诱变寡核苷酸5’- 1F11S52K(CCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCAAAGTTCCTCTA CTCTGGAGTCCC)(SEQ ID NO:187)和3’-1F11S52K(GGGACTC CAGAGTAG AGGAACTTTGCCGAGTAAATCAGAAGCTTCGG)(S EQ ID NO:188)与来自实施例3K的2C11或2H5pRK轻链构建体组 合并且使用Lightning定点诱变试剂盒(Agilent)产生双 突变体轻链。然后三突变体通过组合双突变体轻链pRK构建体和3F 5重链pRK构建体而产生并且IgG在HEK293细胞中表达且如实施 例3K中所述进行纯化。

O)具有三突变体的纯化的二泛素的蛋白质印迹法

为了对三突变体1F11/2C11/3F5和1F11/2H5/3F5的亲和力和特异 性排序，如实施例3M中所述在蛋白质印迹法中测试实施例3N中描 述的IgG与线性二泛素(Boston Biochem)和K63连接的二泛素(Boston  Biochem)的结合。1F11/2C11/3F5和1F11/2H5/3F5的灵敏度均未高于 双突变体1F11/3F5(见图11)。

P)克隆另外的三突变体

当制备双突变体时最初并未考虑一个H3突变体4E4(相比于实施 例3E中的亲本1E3显示改善的IC₅₀值)，因为其在特异性ELISA中 具有少量的K63连接的二泛素结合(在噬菌体OD₂₆₈=1.0时OD₄₅₀=0.16，见实施例3F)。因为迄今为止所测试的IgG突变体无一在蛋 白质印迹法中显示任何K63连接的二泛素结合，所以对4E4克隆进 一步分析。4E4为H3克隆，其实际上含有两个突变，紧邻CDR H3 的Y102L和于框架4中的T110A。为了测定无意T110A突变是否对 亲和力具有任何影响，在1E3亲本重链或突变体3F5重链的上下文 中制备Y102L单突变体和Y102L T110A双突变体重链。为了插入Y 102L突变，将诱变寡核苷酸5’-Y102L(CGGTGGGTTATGGACCTG TGGGGTCAAGGAACCCTGGTC ACCGTCTCCTCGGCCTCC)(SE Q ID NO:189)和3’-Y102L(GGAGGCCGAGGAGA CGGTGACCAG GGTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACCG)(SEQ ID NO:1 90)与1E3或3F5IgG重链pRK表达构建体组合并且使用Lightning定点诱变试剂盒(Agilent)合成突变体。为了插入Y102L T110A突变，将诱变寡核苷酸5’-Y102L T110A(CGGTGGGTTATG GACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCGCGGTCTCCTCGGCCT CC)(SEQ ID NO:191)和3’-Y102L T110A(GGAGGCCGAGGAGA CCGCGACCAGG GTTCCTTGACCCCACAGGTCCATAACCCACCG) (SEQ ID NO:192)与1E3或3F5IgG重链pRK表达构建体组合并 且使用Lightning定点诱变试剂盒(Agilent)合成突变 体。将所得重链IgG pRK构建体与亲本1E3或突变体1F11轻链IgG pRK构建体组合并且所得IgG在HEK293细胞中表达且如实施例3 K中所述进行纯化。

然后如实施例3M中所述，在用于结合线性或K63连接的二泛素 的蛋白质印迹法中一起比较这些突变体(Y012L与Y102L T110A、 3F5/Y102L与3F5/Y102L T110A、1F11/Y102L与1F11/Y102L T110A 和1F11/3F5/Y102L与1F11/3F5/Y102L T110A)。一般而言，与单独 Y102L相比，具有与Y102L组合的T110A突变并未显著改善灵敏度 (见图12)。也由噬菌体IC₅₀，已知单独T110A(克隆4E1)相比于亲本 1E3未改善亲和力(见表7)。因此，考虑单独的Y102L突变用于进一 步分析。

然后如实施例3M中所述，在用于结合线性或K63连接的二泛素 的蛋白质印迹法中将三突变体1F11/3F5/Y102L和亲本1E3、每个单 突变体(1F11、3F5、Y102L)以及双突变体(1F11/3F5、1F11/Y102L、 3F5/Y102L)一起比较。三突变体对于结合线性二泛素的灵敏度比亲本 克隆1E3、所有单突变体以及所有双突变体更高(见图13)。此外，其 显示未与K63连接的二泛素结合，这指示维持特异性。

实施例4-亲和力成熟的抗线性聚泛素抗体的表征

A)纯化的二泛素链的IgG蛋白质印迹法

在蛋白质印迹法中测试1E3亲本和1F11/3F5/Y102L IgG的检测 纯二泛素链的能力。将1μg至16ng的7个线性二泛素(Boston  Biochem)两倍系列稀释液和含还原剂(Invitrogen)的1X LDS缓冲液 (Invitrogen)中各1μg的单泛素(Boston Biochem)、K11连接的二泛素 (Genentech)、K48连接的二泛素(Boston Biochem)和K63连接的二泛 素(Boston Biochem)于70℃加热十分钟并且在4-12%Bis Tris NuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上于MES缓冲液(Invitrogen)中一式三份地运 行。一条凝胶通过SimplyBlue考马斯染色(Invitrogen)进行染色以检测 所有蛋白质。为了获得亲和力概念的比较，第二蛋白质印迹法用抗 K63抗体Apu3.A8(其对于K63连接的二泛素具有已知的8.7nM的 KD(见Newton,K.等(2008)Cell134:668-678)进行。对于这种蛋白质 印迹法，1μg至16ng的7个K63连接的二泛素(Boston Biochem)两 倍系列稀释液和各1μg的单泛素(Boston Biochem)、线性二泛素 (Boston Biochem)、K11连接的二泛素(Genentech)和K48连接的二泛 素(Boston Biochem)均如上所述在凝胶上运行。将三条凝胶在恒定30 V下通过在10%甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的湿转 移分别转移到0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)持续1小时。通过于25 ℃在振摇下在PBST中的5%牛乳中温育1小时来封闭膜上的非特异 性结合位点。然后将膜于25℃在振摇下在PBST中5%牛乳中的1 μg/mL1E3、1F11/3F5/Y102L或Apu3.A8中温育1小时。将膜在PBST 中在振摇下洗涤三次。通过将膜于25℃在振摇下在PBST中5%牛乳 的山羊抗人Fcγ-特异性HRP-偶联F(ab’)2二抗(Jackson  Immunoresearch)的1:10000稀释液中温育1小时，来检测IgG。然后 将膜在PBST中洗涤三次，之后在PBS中洗涤1次。使用Super Signal  West Pico化学发光底物(Thermo Scientific)、接着使印迹对胶片曝光 来检测二抗。

1E3检测限为约250ng线性二泛素(见图14)。相比之下， 1F11/3F5/Y102L的灵敏度高得多并且可检测少至31ng的线性二泛 素。此外1F11/3F5/Y102L为高度特异性，显示未结合于任何其它形 式的所测试的泛素。为了比较，Apu3.A8(具有8.7nM的K_D)的检测 限为约62ng。因此，1F11/3F5/Y102L对于线性二泛素的K_D可能在 低nM范围内。

B)纯化的聚泛素链的IgG蛋白质印迹法

针对线性二泛素抗原产生线性特异性抗体，于是它们可能识别键 联自身或近端和远端泛素上由于自线性键联造成的二泛素构象而紧 邻放置的周围表面残基。因为二泛素是抗原的最小识别单元且线性聚 泛素是二泛素作为重复“单体”单元的高分子链，所以抗体也应结合聚 泛素形式。为了检查其，在蛋白质印迹法中测试1F11/3F5/Y102L IgG 的检测纯聚泛素链的能力。将含还原剂(Invitrogen)的1X LDS缓冲液 (Invitrogen)中各1μg的单泛素(Boston Biochem)、线性聚泛素2-7 (Enzo Lifesciences)、K11连接的聚泛素(Genentech)、K48连接的聚泛 素2-7(Boston Biochem)和K63连接的聚泛素2-7(Boston Biochem)于 70℃加热十分钟并且在4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm凝胶 (Invitrogen)上于MES缓冲液(Invitrogen)中一式三份地运行。一条凝 胶通过SimplyBlue考马斯染色(Invitrogen)进行染色以检测所有蛋白 质。使其它两条凝胶在恒定30V下在10%甲醇和1X NuPAGE转移 缓冲液(Invitrogen)中通过湿转移分别转移到0.2μm硝酸纤维素 (Invitrogen)持续1小时。通过于25℃在振摇下在PBST中的5%牛乳 中温育1小时来封闭膜上的非特异性结合位点。然后将膜于25℃在 振摇下在PBST中5%牛乳中的1μg/mL1F11/3F5/Y102L IgG或小鼠 泛泛素抗体P4D1(非键联特异性，Santa Cruz Biotechnology)的1:200 稀释液中温育1小时。将膜在PBST中在振摇下洗涤三次。通过将膜 于25℃在振摇下在山羊抗人Fcγ特异性HRP-偶联F(ab’)2二抗 (Jackson Immunoresearch)在PBST中的5%牛乳中的1:10000稀释液中 温育1小时，来检测1F11/3F5/Y102L IgG。通过将膜于25℃在振摇 下在山羊抗小鼠Fcγ-特异性HRP-偶联F(ab’)2二抗(Jackson  Immunoresearch)在PBST中的5%牛乳中的1:10000稀释液中温育1 小时，来检测P4D1IgG。然后将膜在PBST中洗涤三次，之后在PBS 中洗涤1次。使用Super Signal West Pico化学发光底物(Thermo  Scientific)、接着使印迹对胶片曝光来检测二抗。对照泛泛素抗体P4D1 识别单泛素、线性聚泛素2-7(尽管较弱)、K11连接的聚泛素、K48 连接的聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7，但是1F11/3F5/Y102L IgG 仅识别线性聚泛素(见图15)。因此，正如线性二泛素一样， 1F11/3F5/Y102L抗体可检测含有线性键联的聚泛素链，但不识别其 它键联的聚泛素链。

C)TNFα处理的细胞裂解液的IgG蛋白质印迹法

使HeLa S3细胞在补充有如下物质的50:50F-12:杜尔贝科氏改 良伊格尔培养基(DMEM)中的悬浮培养物中生长：DMEM10%胎牛血 清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、1%甘氨酸/次黄嘌呤/胸腺嘧啶(GHT)溶 液和1%青霉素/链霉素。实验前一天，将细胞分裂成1:2。使细胞生 长过夜直至达到0.38x106个细胞/mL的密度(98%存活)。将细胞分 到三个烧瓶中，每个烧瓶1.5L细胞。烧瓶1用5.8μM MG132(Cayman  Chemicals)预处理10分钟。烧瓶2和3未接受预处理。在时间零时， 烧瓶2和3也用5.8μM MG132处理。此外在时间零时，烧瓶1和3 用100ng/mL TNFα(Shenandoah Biotechnology)处理而烧瓶2用500 ng/mL TNFα处理。在时间零、5分钟和20分钟时，从每个烧瓶移除 444mL细胞，于4℃以800rpm旋转5分钟，并且抽吸上清液。将细 胞用40mL冷PBS直接洗涤，于4℃以800rpm沉淀5分钟，并且抽 吸上清液。将每份沉淀于4℃在摇晃下于13mL冷裂解缓冲液(20mM Tris(pH7.5),150mM NaCl、1mM EDTA,1%Triton X-100、10mM N- 乙基马来酰亚胺(NEM),25μM MG132,50mM NaF、完全蛋白酶抑制 剂混合片(Roche)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合片(Roche))中裂解10 分钟。通过于4℃以10,000x g旋转5分钟使碎片沉淀。将裂解液于 4℃在摇晃下用133μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)预澄清1小时。 通过以2000rpm旋转5分钟使珠粒沉淀。除去上清液且将其贮存于 -80℃下。

已表明线性聚泛素链在NFκB途径中起信号传导作用。因此，在 蛋白质印迹法中用1F11/3F5/Y102L探测上述裂解物。将含还原剂 (Invitrogen)的1X LDS样本缓冲液(Invitrogen)中的13μL每一种裂解 物于70℃加热十分钟并且在4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm凝胶 (Invitrogen)上于MES缓冲液(Invitrogen)中一式两份地运行。作为特 异性对照，在凝胶上运行250ng纯化的线性连接的聚泛素链(Enzo  Lifesciences)和K63连接的聚泛素链(Boston Biochem)。将凝胶在恒定 30V下通过在10%甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的湿 转移单独地转移到0.45μm硝酸纤维素(Invitrogen)持续1小时。通过 于25℃在振摇下在PBST中的5%牛乳中温育1小时来封闭膜上的非 特异性结合位点。然后将膜于25℃在振摇下在PBST中5%牛乳中的 1μg/mL1F11/3F5/Y102L或Apu3.A8抗K63中温育1小时。将膜在 PBST中在振摇下洗涤三次。通过将膜于25℃在振摇下在山羊抗人 Fcγ-特异性HRP-偶联F(ab’)2二抗(Jackson Immunoresearch)在PBST 中5%牛乳中的1:10,000稀释液中温育1小时，来检测IgG。然后将 膜在PBST中洗涤三次，之后在PBS中洗涤1次。使用Super Signal  West Pico化学发光底物(Thermo Scientific)、接着使印迹对胶片曝光 来检测二抗。进行另外的蛋白质印迹法以通过探测IκBα水平来评估 NFκB途径的激活。在TNFα信号传导时，这导致泛素化以及NFκB、 IκBα的抑制剂的降解。将含5μL含还原剂(Invitrogen)的1X LDS样 本缓冲液(Invitrogen)中的上述裂解物于70℃加热十分钟并且在 4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm凝胶(Invitrogen)上于MES缓冲液 (Invitrogen)中一式两份地运行。将凝胶在恒定30V下通过在20%甲 醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的湿转移转移到Invitrolon  PVDF(Invitrogen)持续2小时。将膜于25℃在振摇下在PBST中的5% 牛乳中封闭1小时，然后于4℃在振摇下用抗IκBα(Cell Signaling)和 抗β-微管蛋白(Cell Signaling)抗体的1:1000稀释液作为上样对照探测 过夜。第二天，将印迹在振摇下于PBST中洗涤三次。通过将膜于25 ℃在振摇下在山羊抗兔Fcγ-特异性HRP-偶联F(ab’)2二抗(Jackson  Immunoresearch)在PBST中5%牛乳中的1:10,000稀释液中温育1小 时，来检测IgG。然后将膜在PBST中洗涤三次，之后在PBS中洗涤 1次。使用Super Signal West Pico化学发光底物(Thermo Scientific)、 接着使印迹对胶片曝光来检测二抗。

在用100ng/mL TNFα刺激且未用MG132预处理的细胞中，线性 聚泛素链的量从时间零至5分钟至20分钟递增(见图16A)。相比之下， 在所有三个时间点大大丰裕的K63连接的聚泛素链显示从零至5分 钟的增加，然后在20分钟时下降到起始水平。在用500ng/mL TNFα 刺激且未用MG132预处理的细胞中，线性聚泛素链显示从零至20 分钟递增的相同模式，但是每个时间点时的线性链的丰裕度相比于用 100ng/mL TNFα处理的细胞有所增加。相比之下，K63连接的链显 示与用100ng/mL TNFα处理的细胞相同的模式和丰裕度。在用5.8 μM MG132和然后100ng/mL TNFα预处理10分钟的细胞中，线性连 接的和K63连接的链两者的水平在三个时间点时保持相当恒定。IκBα 的印迹显示在所有三个实验条件下激活NFκB途径，正如在随着时间 流逝的TNFα处理时IκBα的降解所证明，但是在缺少MG132预处理 下激活的程度则更大(见图16B)。这表明1F11/3F5/Y102L可识别内源 性线性聚泛素链并且表明这些链在TNFα刺激时于HeLa S3细胞中上 调。

D)线性聚泛素链的免疫沉淀

测试1F11/3F5/Y102L IgG以观察其是否能够免疫沉淀线性聚泛 素链。作为阳性对照，还使用Apu3.A8抗K63抗体监测K63连接的 链的免疫沉淀。作为阴性对照，不相关的人κIgG1抗体用作同种型对 照。测试三种免疫沉淀(IP)条件。在含有所有链的反应1中，混合各 2μg的单泛素(Boston Biochem)、线性聚泛素2-7(Enzo Lifesciences)、 K11连接的聚泛素(Genentech)、K48连接的聚泛素2-7(Boston  Biochem)和K63连接的聚泛素2-7(Boston Biochem)。在缺少线性链 的反应2中，混合各2μg的单泛素、K11连接的聚泛素、K48连接 的聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7。反应3由单独2μg线性聚泛 素2-7链组成。将每个反应在500μL的4M脲IP缓冲液(4M脲、20 mM Tris(pH7.5)、135mM NaCl、1%Triton X-100、10%甘油、1mM EDTA、1.5mM MgCl₂)中稀释。将反应于25℃在旋转下用50μL蛋 白A Dynabeads(Invitrogen)预澄清3小时。然后在磁力表座(magnetic  stand)上捕获珠粒并且将上清液转移至新管。将20μg1F11/3F5/Y102L 抗线性、Apu3.A8抗K63或同种型对照IgG添加至每一个IP反应并 且于25℃在旋转下温育过夜。第二天，将100μL蛋白A Dynabeads 添加至每一个反应并且于25℃在旋转下捕获IgG15分钟。然后将珠 粒用1mL每一种4M脲IP缓冲液洗涤三次，之后用1mL每一种PBS 洗涤两次。在最后洗涤期间，将珠粒转移至新管以避免洗脱结合于管 壁的任何蛋白质。将珠粒重悬浮于30μL含还原剂(Invitrogen)的1X LDS样本缓冲液(Invitrogen)中并且于70℃加热10分钟以洗脱免疫沉 淀的蛋白质。然后在磁力表座上捕获珠粒且将上清液对分，一式两份 地上样至两条4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm凝胶(Invitrogen)上。作 为阳性和阴性对照，也在凝胶上运行各1μg纯化的线性聚泛素2-7 (Enzo Lifesciences)和K63连接的聚泛素2-7(Boston Biochem)。使凝 胶在MES缓冲液(Invitrogen)中运行，然后在恒定30V下通过在10% 甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中的湿转移分别转移到 0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)持续1小时。通过于25℃在振摇下在 PBST中的5%牛乳中温育1小时来封闭膜上的非特异性结合位点。 然后将膜于25℃在振摇下在PBST中5%牛乳中的1μg/mL 1F11/3F5/Y102L或Apu3.A8抗K63中温育1.5小时。将膜在PBST 中在振摇下洗涤三次。通过将膜于25℃在振摇下在山羊抗人Fcγ-特 异性HRP-偶联F(ab’)2二抗(Jackson Immunoresearch)在PBST中5% 牛乳中的1:10,000稀释液中温育1小时，来检测IgG。然后将膜在 PBST中洗涤三次，之后在PBS中洗涤1次。使用Super Signal West  Pico化学发光底物(Thermo Scientific)、接着使印迹对胶片曝光来检测 二抗。1F11/3F5/Y102L能够在4M脲中免疫沉淀线性聚泛素链，但是 在这些条件下并非特异的，因为其也能够下拉K63连接的链(见图 17)。

为了测定不同浓度的脲是否可帮助改善特异性，在不同的缓冲液 条件下进行免疫沉淀。将各2μg的线性聚泛素2-7和K63连接的聚 泛素2-7混合并且用500μL含有0、2、4或6M脲的IP缓冲液(20mM Tris(pH7.5)、135mM NaCl、1%Triton X-100、10%甘油、1mM EDTA, 1.5mM MgCl₂)稀释。使用500μL PBST进行另外的IP。将反应于25 ℃在旋转下用50μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)预澄清30分钟。 然后在磁力表座上捕获珠粒并且将上清液转移至新管。将20μg 1F11/3F5/Y102L抗线性或Apu3.A8抗K63IgG添加至每一个IP反应 并且于25℃在旋转下温育1小时。接下来，将100μL蛋白A Dynabeads添加至每一个反应并且于25℃在旋转下捕获IgG15分钟。 然后将珠粒用1mL每一种在IP中使用的相应缓冲液(0、2、4或6M 脲IP缓冲液或PBST)洗涤三次，之后用1mL每一种PBS洗涤两次。 在最后洗涤期间，将珠粒转移至新管以避免洗脱结合于管壁的任何蛋 白质。将珠粒重悬浮于20μL含还原剂(Invitrogen)的1X LDS样本缓 冲液(Invitrogen)中并且于70℃加热10分钟以洗脱免疫沉淀的蛋白 质。然后在磁力表座上捕获珠粒且将上清液对分，一式两份地上样到 两条4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm凝胶(Invitrogen)上。作为阳性和 阴性对照，也在凝胶上运行各1μg的纯化的线性聚泛素2-7和K63 连接的聚泛素2-7。使凝胶在MES缓冲液(Invitrogen)中运行，然后在 恒定30V下通过在10%甲醇和1X NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen) 中的湿转移分别转移到0.2μm硝酸纤维素(Invitrogen)持续1小时。 通过于25℃在振摇下在PBST中的5%牛乳中温育1小时来封闭膜上 的非特异性结合位点。然后将膜于25℃在振摇下在PBST中5%牛乳 中的1μg/mL1F11/3F5/Y102L或Apu3.A8抗K63中温育1小时。将 膜在PBST中在振摇下洗涤三次。通过将膜于25℃在振摇下在山羊抗 人Fcγ-特异性HRP-偶联F(ab’)2二抗(Jackson Immunoresearch)在 PBST中5%牛乳中的1:10000稀释液中温育1小时，来检测IgG。然 后将膜在PBST中洗涤三次，之后在PBS中洗涤1次。使用Super  Signal West Pico化学发光底物(Thermo Scientific)、接着使印迹对胶片 曝光来检测二抗。因为脲在IP缓冲液中的浓度增加，所以 1F11/3F5/Y102L IP变得更有特异性(见图18A)。在6M脲时，几乎很 少的K63连接的聚泛素被1F11/3F5/Y102L IgG下拉并且其仍能够下 拉显著量的线性聚泛素。

为了观察甚至更高浓度的脲是否可进一步改善特异性，使用6、 7或8M脲IP缓冲液重复IP。将各2μg的线性聚泛素2-7和K63连 接的聚泛素2-7混合并且用500μL含有6、7或8M脲的IP缓冲液(20 mM Tris(pH7.5)、135mM NaCl、1%Triton X-100、10%甘油、1mM EDTA,1.5mM MgCl₂)稀释。将反应于25℃在旋转下用50μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)预澄清15分钟。然后在磁力表座上捕获珠粒并 且将上清液转移至新管。将20μg1F11/3F5/Y102L抗线性、Apu3.A8 抗K63或同种型对照IgG添加至每一个IP反应并且于25℃在旋转下 温育1小时。接下来，将100μL蛋白A Dynabeads添加至每一个反 应并且于25℃在旋转下捕获IgG15分钟。然后将珠粒用1mL每一 种在IP中使用的相应缓冲液(6、7或8M脲IP缓冲液)洗涤三次，之 后用1mL每一种PBS洗涤两次。在最后洗涤期间，将珠粒转移至新 管以避免洗脱结合于管壁的任何蛋白质。将珠粒重悬浮于30μL含还 原剂(Invitrogen)的1X LDS样本缓冲液(Invitrogen)中并且于70℃加热 10分钟以洗脱免疫沉淀的蛋白质。然后在磁力表座上捕获珠粒且将 上清液对分，一式两份地上样到两条4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm 凝胶(Invitrogen)上。作为阳性和阴性对照，也在凝胶上运行各1μg 的纯化的线性聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7。使凝胶在MES 缓冲液(Invitrogen)中运行并且如前述段落中所述进行蛋白质印迹法。 一个印迹用1F11/3F5/Y102L探测以检测线性链，而另一个印迹用 Apu3.A8抗K63探测以检测K63连接的链。在6M脲中，几乎很少 量的K63连接的链被1F11/3F5/Y102L下拉，正如前述IP中所观察到 的(见图18B)。在7M脲中，1F11/3F5/Y102L表现得就像同种型对照 一样并且未下拉任何K63连接的链，但是其与存在于起始材料的相 比仍保留IP大量线性聚泛素的能力。然而，在8M脲中被 1F11/3F5/Y102L下拉的线性链的量急剧减少。因此，7M脲是冲击在 不降低K63连接的链的情况下下拉大量线性链的平衡的最特定条件。

在前述IP中，将下拉中所用的IgG的重链从珠粒洗脱并且通过 蛋白质印迹法中使用的二抗检测。该条带往往可掩盖下拉材料的带。 为了使印迹更干净以及为了完全确定无K63连接的链被下拉，使IgG 与珠粒在IP之前交联。将20μg1F11/3F5/Y102L或同种型对照IgG 于25℃在旋转下用200μL PBST中的蛋白A Dynabeads温育30分钟。 在磁力表座上捕获珠粒并且用800μL偶联缓冲液(20mM磷酸钠(pH 7.5),150mM NaCl)洗涤两次。将IgG偶联的珠粒重悬浮于1mL偶联 缓冲液中的5mM辛二酸双(磺基琥珀酰亚氨基)酯(BS3)并且于25℃ 在旋转下温育30分钟以发生交联。当将IgG交联至珠粒时IP反应开 动。将各4μg的线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的聚 泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7混合并且用500μL含有0、4或7M 脲的IP缓冲液(20mM Tris(pH7.5)、135mM NaCl、1%Triton X-100、 10%甘油、1mM EDTA,1.5mM MgCl₂)稀释。将混合物于25℃在旋 转下用50μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)预澄清45分钟。30分钟 后，通过添加48μL1M Tris(pH7.5)并且于25℃在旋转下温育15分 钟来淬灭交联反应。将交联的珠粒用800μL含有相应量的在IP中使 用的脲(即0、4或7M脲)的IP缓冲液洗涤三次。洗涤后，将IgG交 联的珠粒重悬浮于预澄清的IP反应中并且于25℃在旋转下温育1小 时。然后将IgG交联的珠粒用1mL含有相应量的脲的IP缓冲液洗涤 三次，之后用1mL PBS洗涤两次。在最后洗涤期间，将珠粒转移至 新管以避免洗脱结合于管壁的任何蛋白质。将珠粒重悬浮于50μL含 还原剂(Invitrogen)的1X LDS样本缓冲液(Invitrogen)中并且于70℃加 热10分钟以洗脱免疫沉淀的蛋白质。然后在磁力表座上捕获珠粒且 将上清液分份，且一式四份地上样到于4-12%Bis Tris NuPAGE1.0 mm凝胶(Invitrogen)上。作为阳性和阴性对照，也在凝胶上运行各1μg 的纯化的线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连接的聚泛素和 K63连接的聚泛素2-7。使凝胶在MES缓冲液(Invitrogen)中运行并且 在本实施例中上文所述进行蛋白质印迹法。一个印迹用 1F11/3F5/Y102L探测以检测线性链，一个印迹用2A3/2E6抗K11探 测以检测K11连接的链，一个印迹用Apu2.07抗K48探测以检测K48 连接的链，而一个用Apu3.A8抗K63探测以检测K63连接的链。当 将IP中材料的量与存在于起始输入中的材料的量比较时，与用游离 IgG(在前述段落中随后被捕获在珠粒上)进行的IP相比，整体上用 1F11/3F5/Y102L的每个IP中下拉的线性聚泛素少很多(见图19)。这 可能是归因于这样的事实，即1F11/3F5/Y102L是除Fc域中的常见结 合位点之外还含有重链可变域中的第二蛋白A结合位点的人IgG1 VH3亚组的成员。因此，在抗原结合之前IgG至蛋白A珠粒的预偶 联和交联可减少该抗体的结合容量。在这些预偶联和交联条件下4M 脲是其中1F11/3F5/Y102L能够在不降低任何K11-、K48-或K63连接 的链的情况下下拉线性链的最特定条件。

为了观察下拉的线性链中的减少是否归因于重链可变域中另外 的蛋白A结合位点，使用交联至蛋白G珠粒的IgG进行IP。蛋白G 也在人IgG1上具有两个结合位点，但均在恒定域(CH1和Fc)中。如 上所述重复IP，只是使用蛋白G Dynabeads(Invitrogen)来预偶联和交 联IgG。与用交联至蛋白A的IgG的实验相比，每种条件下被 1F11/3F5/Y102L下拉的线性聚泛素链多得多(见图20)。在4M脲下 过暴露抗K63印迹时，少量的K63连接的链被1F11/3F5/Y102L下拉。 因此，当1F11/3F5/Y102L预偶联至蛋白G珠粒时7M脲看似是最特 定条件，但是这以下拉的线性聚泛素比用游离IgG(随后被捕获在珠粒 上)进行IP时(与图18B比较)少为代价的。蛋白G珠粒至CH1域的 预偶联和交联也可能通过邻近VH域的空间位阻减少与线性聚泛素 的结合，但是与预偶联和交联蛋白A珠粒至VH域相比显著更少。

使用游离IgG以及随后用蛋白A珠粒捕获的IP使用具有不同键 联的聚泛素链的混合物作为底物进行重复并且通过蛋白质印迹法和 质谱术进行更宽泛的分析。将各2μg的线性聚泛素2-7(Boston  Biochem)、K11连接的聚泛素(Genentech)、K48连接的聚泛素2-7 (Boston Biochem)和K63连接的聚泛素2-7(Boston Biochem)混合并且 用500μL含有0、4、5、6或7M脲的IP缓冲液(20mM Tris(pH7.5)、 135mM NaCl、1%Triton X-100、10%甘油、1mM EDTA、1.5mM MgCl₂)稀释。一式两份地进行每一个IP，一份用于蛋白质印迹法且另 一份用于质谱术分析。将反应于25℃在旋转下用50μL蛋白A Dynabeads(Invitrogen)预澄清15分钟。然后在磁力表座上捕获珠粒并 且将上清液转移至新管。将20μg1F11/3F5/Y102L抗线性或同种型对 照IgG添加至每一个IP反应并且于25℃在旋转下温育1小时。接下 来，将100μL蛋白A Dynabeads添加至每一个反应并且于25℃在旋 转下捕获IgG15分钟。然后将珠粒用1mL每一种在IP中使用的相 应缓冲液(0、4、5、6或7M脲IP缓冲液)洗涤三次，之后用1mL每 一种PBS洗涤两次。在最后洗涤期间，将珠粒转移至新管以避免洗 脱结合于管壁的任何蛋白质。将珠粒重悬浮于50μL具有还原剂 (Invitrogen)的1X LDS样本缓冲液(Invitrogen)中并且于70℃加热10 分钟以洗脱免疫沉淀的蛋白质。然后在磁力表座上捕获珠粒且将上清 液分份，且一式四份地上样到4-12%Bis Tris NuPAGE1.0mm凝胶 (Invitrogen)上用于蛋白质印迹法。作为阳性和阴性对照，也在凝胶上 运行各500ng的纯化的线性聚泛素2-7、K11连接的聚泛素、K48连 接的聚泛素2-7和K63连接的聚泛素2-7。在4-12%Bis Tris NuPAGE 1.0mm凝胶(Invitrogen)上运行另一组的IP用于质谱术AQUA分析。 使凝胶在MES缓冲液(Invitrogen)中运行并且在本实施例中如上文所 述进行蛋白质印迹法。印迹用1F11/3F5/Y102L抗线性聚泛素、 2A3/2E6抗K11连接的聚泛素、Apu2.07抗K48连接的聚泛素和 Apu3.A8抗K63聚泛素抗体(见图21A)探测。用于质谱术AQUA的 其它凝胶用SimplyBlue考马斯安全染色(Coomasie Safe  stain)(Invitrogen)进行染色(见图21B)。在缺少脲下，F11/3F5/Y102L 能够IP所有键联的链(见图21A)。当脲在IP缓冲液中的浓度增加时， 1F11/3F5/Y102L IP变得更具特异性。在7M脲时无K11连接的、K48 连接的或K63连接的聚泛素被1F11/3F5/Y102L IgG下拉并且其相对 于起始输入仍能够下拉大量线性聚泛素。

切除考马斯染色的凝胶的B区和C区，进行凝胶内胰蛋白酶消 化，并且通过质谱术AQUA进行分析(见图21B)。将凝胶块使用50mM 碳酸氢铵/50%甲醇脱色，然后用乙腈(ACN)干燥。为了容许有效摄取 胰蛋白酶，将凝胶块与20ng/μL在50mM碳酸氢铵/5%ACN中稀释 的改良测序级胰蛋白酶(Promega,Madison WI)一起在冰上温育2小 时。消化于37℃下进行过夜并通过添加50%ACN/5%甲酸(FA)来终 止。将同位素标记的内部标准肽(1pmol)添加至每一个样本，之后进 行两轮提取(第1轮-50%ACN/5%FA第2轮-100%ACN)。将经过提 取的肽完全干燥，并且重悬浮于10%ACN/5%FA/0.01%H2O2至少 30分钟，之后进行质谱分析。将样本直接上样到Thermo AQUASIL C18柱(2.1X150mm)上并使用Agilent1200毛细管LC以200μl/min 的流速在5%至90%缓冲液B(98%ACN/0.1%FA)的26分钟梯度上分 开。在ABI4000QTRAP上使用分段多重反应监测(MRM)方法进行质 谱检测，用于检测覆盖泛素序列的经标记的和未标记的肽两者。通过 使用ABI Multiquant1.1软件比较经标记形式和未标记形式的每一种 肽之间的峰面积来进行定量。通过测量对应于泛素的7个赖氨酸与氨 基末端的修饰的–GG签名肽的丰裕度，确认7M脲是用于免疫沉淀线 性聚泛素链的最特定条件(见图21C和21D)。在7M脲中，抗体能够 回收存在于来自含有较长链(四泛素至七泛素)的B区的输入中的线性 链的67%，但是其在回收在区域C中发现的短链(二泛素和三泛素) 方面的效率较低，仅回收2%线性链(见图21E)。这可能是归因于来自 二价抗体的亲合力和在较长链中发现的多个键联。

E)LUBAC的过表达

线性泛素装配复合物(LUBAC)是已显示装配线性聚泛素链的E3 连接酶(Kirisako,T.等(2006)EMBO J.25:4877-4887)。合成该复合物 的两个成员Hoil-1L和Hoip的开放阅读框(ORF)(Blue Heron  Biotechnology)并且将其克隆到含有双向CMV启动子的pBI-CMV1 哺乳动物表达载体(Clonetech)中。使用限制酶位点MluI和EcoRV将 Hoil-1L克隆到多个克隆位点(MCS)1中并且将Hoip克隆到使用限制 酶位点EcoRI和PstI的MCS2中。通过对ORF测序来验证构建体。 将所得构建体pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip或中空载体转移至293T细胞 中。在转染前两天将293T细胞以1:20分到20块10cm板中，并于 37℃在5%CO2中生长。转染当天，对于要转染的每一个质粒将150 μL Lipofectamine2000稀释到在2.5mL不含血清的Opti-MEM培养基 中。也将50μg pBI-CMV1中空载体或pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip稀释 到2.5mL不含血清的Opti-MEM培养基中。将这些稀释液于25℃温 育5分钟。将经稀释的Lipofectamine和经稀释的DNA组合，通过倒 转轻轻混合，并于25℃温育30分钟。然后将500μL DNA/Lipofectamine混合物添加至每一块10cm板(每一个质粒10块 板)。转染后48小时收集培养基并且将细胞从板上刮下来。将细胞于 4℃以10,000rpm旋转10分钟。除去上清液并且将细胞在40mL冷 PBS中洗涤。将细胞于4℃以10,000rpm旋转10分钟。除去上清液 并且将细胞重悬浮于4mL含有8M脲、50mM Tris(pH7.5)、25mM NaCl、10μL/mL HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific)、5 mM EDTA和2mM NEM的裂解缓冲液中。将裂解液短暂超声处理以 降低粘度，然后于-80℃冷冻。为了测定Hoil-1L和Hoip是否过表达 以及这是否导致线性聚泛素链装配增加，通过蛋白质印迹法分析裂解 物。将1μL每一份裂解液与含有还原剂的LDS样本缓冲液混合，然 后上样到4-12%NuPAGE Bis Tris1.0mm凝胶(Invitrogen)且在MES 缓冲液(Invitrogen)中以一式四份地运行。将凝胶在30V下在含有10% 甲醇的1X NuPAGE转移缓冲液中分别转移到0.45μm硝酸纤维素持 续2小时。将膜于25℃在振摇下在含PBST中5%牛乳中封闭1小时， 然后在一抗中温育。第一印迹用1μ/mL在PBST中5%牛乳中的 1F11/3F5/Y102L抗线性聚泛素IgG探测。第二印迹用抗 Hoil-1L/RBCK抗体(Abcam ab38540)在PBST中5%牛乳中的1:500稀 释液探测。第三印迹用1μg/mL在PBST中5%牛乳中的抗 Hoip/RNF31抗体(Abcam ab85294)探测。第四印迹用抗β-微管蛋白抗 体(Cell Sigaling9F3#2128)在PBST中5%牛乳中的1:1000稀释液探 测。将印迹1、2和3于25℃在振摇下在其各自一抗中温育1小时。 将抗β-微管蛋白印迹于4℃在旋转下温育过夜。然后将印迹在 PBST0.05中洗涤三次，然后于25℃在振摇下在二抗在PBST中5% 牛乳中的1:10,000稀释液中温育1小时。抗线性聚泛素印迹用山羊抗 人F(ab)’2-HRP二抗(Jackson Immunoresearch)探测并且其它三个印迹 用山羊抗兔F(ab)’2-HRP二抗(Jackson Immunoresearch)探测。接着将 印迹用PBST洗涤三次，然后用PBS洗涤一次。使用Super Signal West  Pico化学发光底物(Thermo Scientific)、接着使印迹对胶片曝光来检测 二抗。抗β-微管蛋白印迹显示，在转染中使用等量的细胞并且当量数 的裂解液上样到凝胶上(见图22A)。抗Hoil-1L和抗Hoip印迹显示当 转染pBI-CMV1-Hoil1L-Hoip时，Hoil-1L和Hoip两者均相对于两种 蛋白质的内源性水平被过表达。最终，正如预期的，Hoil-1L和Hoip 的过表达导致线性聚泛素链水平急剧增加。考虑到这些被 1F11/3F5/Y102L IgG检测，则指示该抗体可识别内源性、用酶方法合 成的线性聚泛素链。

除通过蛋白质印迹法探测这些裂解物之外，也进行线性聚泛素的 免疫沉淀。将500μL上述裂解物用71μL50mM Tris(pH7.5)、25mM  NaCl稀释至7M脲。然后，将裂解物于25℃在旋转下用200μl在7M 脲、50mM Tris(pH7.5)、25mM NaCl中的蛋白A Dynabeads (Invitrogen)预澄清1小时。用磁力表座上捕获珠粒并且将上清液转移 至新管。然后将预澄清的裂解物以14,000rpm旋转5分钟以使任何沉 淀成团粒。将上清液转移至新管并且加入40μg1F11/3F5/Y102L IgG 或同种型对照IgG。然后于25℃在旋转下将免疫沉淀温育过夜。第二 天，通过于25℃在旋转下添加200μL在7M脲、50mM Tris(pH7.5)、 25mM NaCl中的蛋白A Dynabeads15分钟来捕获IgG。在磁力表座 上捕获珠粒并且用1mL7M脲、50mM Tris(pH7.5)、25mM NaCl洗 涤5次，然后用1mL PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，将珠粒转移 至新管以避免洗脱结合于管壁的任何蛋白质。然后将珠粒重悬浮于 30μl含还原剂的1X LDS样本缓冲液(Invitrogen)并且于70℃洗脱10 分钟。运行两条4-12%NuPAGE Bis Tris1.0mm凝胶：一条用于蛋白 质印迹法，而另一条用于考马斯染色以用于质谱术AQUA分析。对 于蛋白质印迹法，运行10%每一个IP以及0.1%每一份裂解液。对于 质谱术，运行90%每一个IP以及1%每一份裂解液。如上文段落中所 述进行用1F11/3F5/Y102L的蛋白质印迹法，只是转移进行1小时。 用于质谱术AQUA分析的凝胶用简单蓝色安全染色剂(Simply Blue  Safe Stain)(Invitrogen)染色。蛋白质印迹法显示，1F11/3F5/Y102L IgG 可免疫沉淀来自细胞裂解物的线性聚泛素链(见图22B)。自LUBAC 过表达裂解物下拉的链比自单独载体下拉的多，这与过表达LUBAC 时存在非常高水平的线性链一致。

切除所标示的凝胶的高分子量区(见图22B)并且如上文实施例 4D中所述进行质谱术AQUA。在载体对照样本中，在输入样本中未 鉴定出线性聚泛素键联(见表9)。大部分所鉴定的聚泛素链具有K48 和K63键联。

表9

与此一致的是，在用抗线性抗体或同种型对照抗体的IP中无线 性聚泛素被下拉。在LUBAC过表达的细胞中，线性聚泛素键联的水 平达到4808pmol，其与K63键联(5075pmol)丰裕度方面类似。当抗 线性抗体用于IP时，其显著富集线性键联，其中一些另外的K11、 K48和K63键联被下拉(见图22C)。这有可能归因于存在混合键联链 或用具有不同键联的多个同源链修饰的底物，因为分别仅有7pmol  K48键联和4pmol K63键联被来自载体对照细胞的抗线性抗体下拉 (见表9)。此外，在用同种型对照抗体的IP中仅1pmol K48键联和无 K68键联从LUBAC过表达的细胞鉴定出，指示这些键联仅仅不是粘 性的。这表明抗线性抗体能够富集内源性线性聚泛素链(见图22C)。

为了测定1F11/3F5/Y102L对于免疫荧光是否有功能性，用抗体 染色过表达Hoil-1L和Hoip的HeLa细胞。将HeLa细胞(5,000个细 胞/100μl/孔)接种于透明底部的黑壁96孔板中并且生长24h。根据制 造商的方案使用lipofectamine2000将细胞用Hoil/Hoip质粒转染18 小时。将细胞用PBS漂洗，用冰冷甲醇于-20℃固定10分钟，用PBS/0.1 %Triton X-100于室温透化5min，然后用PBS/0.3%Triton X-100/5% BSA于室温封闭1小时。将线性泛素抗体(1μg/ml)在存在或缺少聚- 泛素链(5μg/ml)下于室温温育1小时，然后使用该抗体于室温标记细 胞1小时。用PBS/0.05%Triton X-100进行6次洗涤(每次10min)后， 将细胞用DyLight488-偶联的驴抗人抗体(1:500,Jackson  ImmunoResearch Laboratories)于室温染色1小时。然后将细胞用含有 0.05%Triton X-100的PBS洗涤6次(每次10分钟)，用Hoechst (1:10,000)于室温染色10min并且用PBS洗涤。将板用黑色密封覆盖 并且使用ImageXpress Micro成像系统成像。当用1F11/3F5/Y102L染 色时未转染细胞不显示任何信号，但是过表达Hoil-1L和Hoip的细 胞显示胞质点状染色模式(见图22D)。这种染色对于线性聚泛素链是 特异的，因为其可通过添加重组线性聚泛素被封闭。

实施例5-Fab与线性二泛素的结合的结构分析

为了更好地理解抗线性Fab与线性聚泛素的相互作用，使 1F11/3F5/Y102L Fab与线性二泛素共结晶。在大肠杆菌中表达 1F11/3F5/Y102L的Fab片段并且如上文实施例1E中所述经蛋白A柱 对其纯化。Fab经5mL SP HiTrap柱(GE Healthcare)在20mM2-(N- 吗啉基)乙磺酸(MES)(pH5.5)(具有20mM MES(pH5.5)的0-100%线 性梯度)、0.5M NaCl中进一步纯化。将含有Fab片段的级分混合并 且经320mL S75分级柱(GE Healthcare)在25mM Tris(pH7.5)、150 mM NaCl中运行。将含有Fab片段的级分混合并且浓缩至22mg/mL。

两个泛素亚基通过规范肽键(线性二泛素)的头对尾融合物也在 大肠杆菌中表达。将BL21-Gold(Agilent Technologies)细胞用在 pET15b载体(Novagen)中构建的线性二泛素表达质粒转化。该构建体 在T7启动子和lac操纵子的控制下具有N端His₆标签(SEQ ID NO: 376)，其后是凝血酶切割位点。将用pET15b-线性二泛素表达质粒转 化的BL21-Gold生长在LB培养基中的过夜培养物在1L温热的含有 1%甘油、0.1M MOPS(pH7.3)和50μg/mL羧苄青霉素的Terrific肉汤 中稀释50倍。使培养物于37℃在振摇下以250rpm在2.5L ultra-yield 烧瓶(Thomson)中生长至OD₆₀₀=1.64。通过添加0.5mM IPTG诱导表 达并且使培养物于16℃在振摇下以250rpm生长过夜。第二天，通过 以8K rpm旋转10分钟使细胞沉淀并且将沉淀冷冻于液氮中。将细胞 再悬浮并且通过微流化三次在40mM Tris(pH8.0)、0.3M NaCl和无 EDTA型完全蛋白酶抑制剂片(Roche)中裂解。通过以10K rpm旋转1 小时使细胞碎片沉淀并且通过0.45μM低蛋白-结合滤器过滤上清液。 His₆-二泛素('His₆'以SEQ ID NO:376公开)经5mL Ni-NTA琼脂糖 (Qiagen)柱纯化。将柱用12柱体积的缓冲液A(20mM Tris(pH8.0)、 1M NaCl、20mM咪唑)洗涤并用四柱体积的缓冲液B(20mM Tris(pH 8.0)、1M NaCl、250mM咪唑)洗脱。二泛素的表达较高以使其超出 柱的结合容量并且一些二泛素在具有缓冲液A的洗涤液中洗脱。因 此，洗涤材料经第二5mL Ni-NTA琼脂糖柱运行且如上所述进行纯 化。通过用1800单位的凝血酶(GE Healthcare)于4℃切割3天同时使 用3500MWCO透析管(Spectrum Medical)透析到25mM Tris(pH8.0)、 150mM NaCl、2mM CaCl₂中来除去His₆标签(SEQ ID NO:376)。将 经透析的和经切割的材料对分，并且使用两个5mL Ni-NTA琼脂糖柱 自His₆标签(SEQ ID NO:376)分离游离二泛素。收集流经液和所有洗 涤液。将柱用四柱体积的缓冲液C(25mM Tris(pH8.0)、0.5M NaCl)、 四柱体积的缓冲液D(25mM Tris(pH8.0)、0.5M NaCl、20mM咪唑) 和后续一柱体积的缓冲液E(25mM Tris(pH8.0)、0.5M NaCl、250 mM咪唑)洗涤。通过在18%Novex tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上运行 来自流经液和每次洗涤液的样本以及使用简单蓝色安全染色剂 (Invitrogen)染色来监测脱标签的二泛素的存在。大部分脱标签的二泛 素存在于流经液、具有缓冲液C的洗涤液和具有缓冲液D的洗涤液 中。将这些溶液混合，浓缩且进一步经320mL S75分级柱(GE  Healthcare)于25mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl中纯化。将含有二泛 素的级分混合并浓缩至15.3mg/mL。

Fab/二泛素复合物使用对Fab三倍摩尔过量的线性二泛素而建立 并且于4℃温育过夜。然后将复合物经320mL S75分级柱(GE  Healthcare)于25mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl中纯化。将含有复合 物的级分混合并浓缩至20mg/mL。

使用坐滴蒸汽扩散法使晶体在含有0.2μL1F11/3F5/Y102L Fab/ 线性二泛素复合物(20mg/mL于25mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl 中的复合物)和0.2μL母液(20%异丙醇、0.1M MES(pH6.0)、20%聚 乙二醇(PEG)2K单甲基醚(MME))中的液滴中生长。初始晶体于19 ℃在这些条件下生长27天。在坐滴中使用具有2μL1F11/3F5/Y102L Fab/线性二泛素复合物(20mg/mL于25mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl中的复合物)和3μL母液(18%异丙醇、0.09M MES(pH6.0)、 19.8%PEG2K MME、10mM溴化钠)的微桥优化晶体。使晶体在19 ℃生长5天并且可被操控以获得单衍射晶体。使用含有另外25-30% PEG2K MME的20%异丙醇、0.1M MES(pH6.0)、20%PEG2K MME 对晶体进行冷冻保护。晶体学数据用Berkeley先进光源(Berkeley Advanced Light Source)光束线5.0.2收集并且使用HKL2000进行处 理。晶体属于P1空间群，其中晶胞尺寸α=87°、β=77°和γ=72°，其中两个复合物位于不对称晶胞内。该结构 使用程序Phaser和人源化4D5Fab片段(4D5的PDB代码:1FVE)和人 单泛素(PDB代码：1UBQ)的变体的坐标通过分子置换进行解析。在 Coot中进行模型建构并且使用Phenix结构精修结构。结构的分辨率 为并且复合物已被精修为22.8%的R和25.0%的Rfree(见图 23.小图A)。

对结构的分析指示通过与重链CDR的接触介导大部分与二泛素 的结合。重链与二泛素之间存在隐藏的表面积，相比之下轻 链与二泛素之间无隐藏的表面积。结构表位和互补位被定义为隐藏至 少25%的其在结合时的溶剂可及表面积(见图23小图B和C)和/或在 相互作用链内具有至少一个原子(见表10和11)的残基。

表10-具有至少25%的隐藏在界面的溶剂可及表面积的残基(表 10分别以SEQ ID NO377和378公开残基52-57和96-100)

表11-在Fab或二泛素内具有至少1个原子的残基(表11分 别以SEQ ID NO377-381公开残基52-57、96-100、31-37、70-76和 60-63)

15个重链残基和仅5个轻链残基构成Fab互补位。二泛素表位 由18个来自远端泛素的残基(键联中所牵涉的C端)和8个来自近端 泛素的残基(键联中所牵涉的N端)组成。接触表面也由9个在重链与 二泛素之间的氢键和3个在轻链与二泛素之间的氢键组成(见表12)。

而不是与线性键联自身专一接触，特异性看似源自与来自近端和 远端泛素的表面残基的多重相互作用。

表12-Fab与二泛素之间的H键小结

尽管游离的线性聚泛素和游离的K63连接的聚泛素链由于在单 泛素结构(PDB代码1UBQ)中仅相隔约的Lys63和游离氨基末端 而采用类似结构，但是该抗体优先结合线性链。通过对近端和远端泛 素亚基的相对取向的双重识别获得该特异性。通过CDR H2残基与近 端亚基的60s环的相互作用获得对近端泛素的识别。特别地，两个氢 键用近端泛素的Gln62的侧链制得，两者均牵涉CDR H2的残基。一 个氢键在Pro52a的主链羰基氧与Gln62的侧链胺之间。另一个氢键 在Gly55的主链酰胺与Gln62的侧链羰基之间。在Ser54的主链羰基 与Lys63的主链酰胺之间也存在第三氢键。除这三个氢键之外，很多 范德华相互作用也存在于CDR H2与近端泛素之间。尽管K63连接 的二泛素的远端泛素理论上可以相同取向结合抗体，但是近端泛素将 由于Met1和Lys63的位置的约差异而略微旋转。这种旋转将可 能破坏CDR H2和60’s环之间的氢键和范德华相互作用。因此，通 过识别近端和远端泛素的由线性键联产生的相对空间取向来编码特 异性。

该结构还阐明了为何亲和力成熟中选择的特定突变有助于增加 亲和力。在CDR H2中，蛋白质印迹法中灵敏度改善最显著的突变为 S56Q(见图13，克隆3F5)。该结构显示Gln56构成两个氢键：一个 是与远端泛素的Gly75的羰基氧，而第二个是与远端泛素的Gly76的 羰基氧，它参与远端和近端泛素之间的线性键联(见图24，小图A)。 Ser的较短侧链可能未到达这些残基以构成氢键。蛋白质印迹法中灵 敏度改善列次席的突变为CDR L2中的S52K(见图13，克隆1F11)。 Lys52的位置邻近在远端泛素的α螺旋的羧基末端发现的Asp32。尽 管Lys52太远而不能与Asp32的侧链构成盐桥，但是其可产生有利的 静电相互作用，只要它也朝向螺旋偶极的负极端定位(见图24，小图 B)。改善抗体灵敏度的第三突变为CDR H3中的Y102L(见图13，克 隆Y102L)。尽管该残基不接触二泛素，但是其可有助于稳定有利的 CDR H3构象用于改善的结合。Leu102插入在重链的框架1的Val2 和Leu4之间(见图24，小图C)。Leu的更具疏水性的侧链可提供比 Tyr更有利的与Val2和Leu4的相互作用并且可能有助于定位CDR H3 的其余部分以与二泛素接触。

虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详 细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范 围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用整体明确 地并入。