一种支持CHO高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基

摘要

本发明提供了一种支持CHO高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基。公开了培养基组分包括氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物和其他有机分子，其中含有类固醇激素，而不含有转铁蛋白和胰岛素。本发明所提供的培养基化学成分明确，无动物来源，污染风险小，能适用于多种不同CHO细胞株生长，细胞培养效果好，有利于下游分离和纯化。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于CHO细胞培养的培养基。

背景技术

细胞培养技术是通过模拟细胞体内生长环境实现细胞体外培养。培养基为细胞体外培养 提供营养并促进细胞生长和增殖。细胞培养基的发展经历了鸡胚汁、天然培养基、合成培养 基，以及目前常用的低血清培养基、无血清培养基、无蛋白培养基和化学成分清晰的培养基。

通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在．在普通培养基中，如不加血清，绝大部分 细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源，价格昂贵，批间差异大，对 生产和科研带来诸多不便。科学家发现在基础培养基中加入替代血清作用的补充因子，如纤 连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等成分，不少细胞即能在无血清供应的情况下生 长。无血清培养基规避了血清带来的风险。便于产品的分离纯化。然而，一般一种无血清培 养基只适用于一类细胞的培养，而且容易受到理化因素的影响。另外无血清培养基通常含有 替代血清的蛋白和脂类，如转铁蛋白、脂类添加剂和胰岛素等，仍然存在一定的污染风险和 分离纯化的障碍，成本也比较高。

中国仓鼠卵巢细胞——CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)目前被广泛用于生产各 种基因工程蛋白产品。适合用于CHO细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来 划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体 和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如MEM,DMEM,RPMI1640,F12等)和 无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血 清等，一般在5—15%)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。血清的主要作 用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等。但即使采用低血清培养， 还是不能忽视血清带来的问题（如在培养过程中贴壁，不适用于大规模培养）。无血清培养基 的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保 存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究 细胞的生理调节机制等。但是，无血清培养基通常含有替代血清的蛋白和脂类，如转铁蛋白、 脂类添加剂和胰岛素等，仍然存在一定的污染风险和分离纯化的障碍，成本也比较高。而且， 一般一种无血清培养基只适用于一类细胞的培养，容易受到理化因素的影响。

发明内容

本发明是一种无血清无蛋白培养基，能适用于多种不同CHO细胞株生长的全能型培养基， 它化学成分明确，无动物来源，其使用不仅将污染的风险降到最小，更有利于下游的分离和 纯化。

本发明是在商业化出售的培养基DMEM/F12（可从Sigma,GIBCO等公司购买）基础上进行 开发，能够支持细胞生长和稳定传代的无血清无蛋白培养基，可适用于工业规模生产。

无血清无蛋白培养基的组分一般包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、类 固醇激素和相关蛋白替代物，如何对这些成分进行合理设计，是开发和优化无血清无蛋白培 养基的关键。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

（1)选择添加可替代生长因子、转铁蛋白和胰岛素的组分如：孕酮、氢化可的松，柠 檬酸铁，硫酸锌等物质；

（2)利用统计学实验设计确定各个组分的最佳剂量；

基于以上考虑，本发明的培养基主要由以下几方面的组分构成：

氨基酸：培养基中主要营养物质之一，用于蛋白、核酸以及脂类等物质的合成，还可以通过 几个主要的中间代谢节点进入TCA循环，用于能量的生成，并同其他营养物质的代 谢相关联。；

无机盐：NaCl维持渗透压平衡，协调共同转运有机大分子进入细胞；K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺等 离子则参予代谢与信号转导以及促进贴壁和细胞增殖；各种阴离子(SO₄^2-，NO^3-等)， 则主要用于调节转细胞膜势能或作为含硫或氮元素有机分子的前体；

维生素：培养基中主要营养物质之一，维生素在培养基中存在的量很微量，但在细胞代谢中 作为细胞功能有机催化剂，起重要的调控作用。

碳水化合物：葡萄糖是主要的碳水化合物，作为主要的碳源和能源物质。

微量元素：微量元素主要起调节、传递和控制的作用，在无血清培养基中的作用尤为重要， 如：

Fe：酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。

Cu：超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。

Mg：对ATP酶、激酶等起活化作用。

Zn：酶的辅基。

Co：维生素B12的组成部分。

此外，培养基中还加入酚红用作培养基pH的指示剂，为适合细胞发酵罐中的大规模培养 而添加有0.1%的Pluronic F68以消除剪切力的影响。

根据将以上各类物质对细胞生长的不同作用，本发明将以上类别的物质按以下浓度进行 设置：

氨基酸的组分和用量：

微量元素及无机盐的组分和用量

维生素的组分和用量

碳水化合物和其他有机分子的组分和用量

附图说明

附图1，不同培养基在相同培养条件下的活细胞密度比较图

附图2，不同培养基在相同培养条件下的细胞存活率比较图。

具体实施方法：

本发明的所有原料供应商采购SIMGMA细胞培养级的原料，并按相关要求储存。本发明所 指的无血清无蛋白培养基具体指的是各种营养物质的水溶液，主要用于大规模细胞悬浮培养。 处于安全性和污染方面的考虑，细胞培养基在制药工业领域中，一般不允许使用任何动物来 源的材料。无血清无蛋白培养基代表该培养基化学成分完全确定，不含来自动物来源的添加 剂，无需向该培养基添加蛋白质，如胰岛素、生长因子等。另外该培养基不含水解蛋白，如 大豆、小麦、酵母水解物。但本培养基可以与某些植物来源的水解物在一定量的范围内叠加 使用，实验证明对于某些产品有较好的效果。

实施例1：

本发明的CHO细胞无血清无蛋白培养基干粉组分和用量如下：

培养基干粉配置方法(1L)：

将1L用量的干粉加入900ml超纯水中，温度35℃左右，搅拌半小时后，加入一定量的 氢氧化钠助溶，然后加入浓盐酸和碳酸氢钠，调节PH到6.9～7.4。用0.2um负压过滤，分装 于500毫升的玻璃瓶中无菌避光保存。

本发明获得的CHO细胞无血清无蛋白培养基培养的理化性质参数、检测方法和检测结果 如表1所示：

表1

检测项目 检测方法 合格培养基标准 实际培养基测量值 粉末性状 目测 白色或微黄色分散性粉末 微黄色分散性粉末 液体性状 目测 澄清、偏红色 澄清、偏红色 微生物限度 薄膜过滤法 ≤100cfu/100ml 8cfu/100ml 含水量 干燥失重 ≤4% 1.5% 溶解度 溶解实验 可溶，无可见溶解物 可溶，无可见溶解物 内毒 LAL测试 ≤20EU/ml 〈5EU/ml 渗透压摩尔浓度 冰点法 270～350Osm/kg 289Osm/kg pH pH计 6.5～7.2 6.9

从检测结果看，配置的液体培养基结果合格，能够用于CHO大规模悬浮细胞培养。

实施例2：

在实施例1无血清无蛋白培养基基础上添加胰岛素和转铁蛋白，其培养基干粉组分和用 量如下：

实施例3：

在实施例1无血清无蛋白培养基基础上添加植物来源经超滤后的水解物（分子量小于 1000道尔顿），其培养基干粉组分和用量如下：

试验例：不同培养基在相同培养条件下的活细胞密度和细胞存活率的比较

培养条件：如表2所示。

表2

CHO细胞在该发明提及的无蛋白无血清培养基（实施例1）培养得到的数据如表3所示。

表3

CHO细胞在该发明所提及的无蛋白无血清培养基添加转铁蛋白和胰岛素（实施例2）培养 得到的数据如表4所示。

表4

CHO细胞在该发明所提及的无蛋白无血清培养基添加水解物（实施例3）培养得到的数据 如表5所示。

表5

CHO细胞在该发明提及Sigma Excell325PF无血清培养基培养得到的数据如表6所示。

表6

将上述配制好的三种培养基300ml装入1000ml的摇瓶中，再加入CHO细胞，接种密度为 6.0×10⁵细胞/ml，放置CO2培养箱中(CO2为5％)中培养，温度为37℃，每隔24小时取 样计数。细胞培养到第6，7天时，活细胞密度达到最高，分别是本发明所提及的无蛋白无血 清培养基（实施例1）：73.5×10⁵细胞/ml；本发明所提及的无蛋白无血清培养基添加转铁蛋 白和胰岛素（实施例2）：71.9×10⁵细胞/ml;本发明所提及的无蛋白无血清培养基添加水解 物（实施例3）：97.5×10⁵细胞/ml;excel325PF无血清培养基50.2×10⁵细胞/ml。

从这三个批次培养的细胞活率看，三种培养基的活率从第4天开始出现下降，但三种培 养基的下降趋势基本一致。

结果如图1和图2显示，本发明所提供的培养基效果与该发明培养基添加转铁蛋白和胰 岛素基本一致；但添加水解物后，效果明显；另外本发明所提供的培养基明显优于市售的excel 325PF无血清培养基。基本达到本发明的目的。

本试验还对CN01132075.3,CN01132225.X,CN01132226.8公开的专利文献中获得的CHO 细胞，重复上述试验，最终得到的关于4种培养基培养效果的结论是一致的。