乌拉特柄扁桃SOD蛋白基因序列及应用

摘要

本发明公开一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白及其编码基因克隆方法与序列。本发明通过RACE方法克隆得到乌拉特柄扁桃SOD基因全长，对其编码蛋白进行分析，从而探讨该基因在提高转基因植物抗氧化、盐胁迫等方面的作用。乌拉特柄扁桃SOD基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗传转化对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。本发明获取的乌拉特柄扁桃SOD基因将在乌拉特柄扁桃抗氧化机制研究、蔷薇科植物抗逆性中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种乌拉特柄扁桃SOD基因及其编码蛋白序列、基因克隆方法及应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化 反应转化为氧气和过氧化氢的酶，有效地防止它们对生物体的损害，几乎参与了生物体对各 种逆境的生理生化反应，是生物体内一种很重要的抗氧化酶类。它广泛存在于各类动物、植 物、微生物中。

根据SOD结合的金属离子的不同，可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD3种类型。 目前，国内外学者已经先后从白杨、甘薯、木薯、桃等等作物中克隆出该基因的cDNA全长 序列或片段序列。

乌拉特柄扁桃(Prunus pedunculatacv.Wulate)是蔷薇科李属灌木，利用野生柄扁桃种子， 经多年栽培选育而成。抗旱、耐寒、耐瘠薄、抗风沙、耐沙埋、抗损伤性强。返青早、枯黄 晚，适口性较好。适宜内蒙古自治区中西部地区种植。目前为止，从乌拉特柄扁桃中获得SOD 基因序列尚未报道。通过RACE方法克隆得到乌拉特柄扁桃SOD基因全长，对其编码蛋白 进行分析，从而探讨该基因在提高转基因植物抗氧化、盐胁迫等方面的作用。乌拉特柄扁桃 SOD基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗传转化 对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白、基因序列及应用。

本发明所提供的SOD蛋白，来源于乌拉特柄扁桃(Prunus pedunculata cv.Wulate)，是具 有序列表中SEQ ID No：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No：2的氨基酸残基 序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2的氨基酸残基 序列相同活性的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。

乌拉特柄扁桃SOD的基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No：1；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中的SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列。

序列表中SEQ ID No：1由1207个碱基组成，其开放阅读框为自5′端第76到第789位碱 基；序列表中SEQ ID No：2由237个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增乌拉特柄扁桃SOD基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的SOD基因将为乌拉特柄扁桃生长发育过程研究，对植物生长发育的理论研究打 下坚实的基础，以及SOD基因功能研究具有重要意义。

附图说明

图1：乌拉特柄扁桃SOD基因3′端扩增产物凝胶电泳图谱

图2：乌拉特柄扁桃SOD基因5′端扩增产物凝胶电泳图谱

图3：乌拉特柄扁桃SOD全长基因扩增产物凝胶电泳图谱

图4：乌拉特柄扁桃SOD蛋白与其它植物SOD蛋白序列比对

图5：乌拉特柄扁桃SOD蛋白与其它植物SOD蛋白进化树分析

图6：转基因与野生型拟南芥SOD活性检测

图7：离体叶片H₂O₂处理

具体实施方式

实施例1、乌拉特柄扁桃SOD蛋白编码基因的获得

1.1RNA的提取

RNA提取参照张劲松等人的方法进行(张劲松，等.中国科学，B辑，1995，25(5)：659～ 669)，乌拉特柄扁桃根在液氮中研碎，悬于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/L十二烷基 肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0.1mol/Lβ-巯基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中 加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/L LiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸钠 /乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，贮存于-20℃(备用，用0.8％的琼脂糖检测RNA的 完整性。

1.23′RACE序列获得：

利用NCBI网站上公布的桃SOD基因序列，设计一条引物SP1： 5′_-GGAGCATGCGTACTACTTACA-3′，用于3′RACE PCR扩增。按照SMART RACE cDNA  Amplification Kit(Clontech，Cat.no.K1811-1)的方法作RT-PCR。3′端的扩增的循环参数为： 94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，35个循环。PCR产物经凝胶电泳分析得知，获 得约为500-bp的DNA条带(图1)，产物回收纯化，连接，转化，通过测序获得了534-bp 的DNA片段，3′端序列为SEQ ID No：4。

1.35′RACE序列获得：

利用3′RACE测序结果，设计一条引物SP2：5′-CGCTGGCATACTTCCAGTTGATT-3′, 用于5′RACE PCR扩增。按照SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法作RT-PCR。5′ 端的扩增循环参数为：94℃变性5s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，70℃退火10s， 72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，25个循环。PCR产 物经凝胶电泳分析得知，获得约为750-bp的DNA条带(图2)，产物回收纯化，连接，转化， 通过测序获得了763-bp的DNA片段，5′端序列为SEQ ID No：5.

1.4该基因编码区序列的获得

以测序的3′RACE和5′RACE片段序列为基础，设计一对引物SOD-1和SOD-2用于扩增 完整编码区序列。

SOD_-1：5′-GTACATCTCCTCCCAGCAACACACT-3′

SOD-2：5′-GGCCTCATTTGTCACACAGATCATT-3′

扩增循环参数为：94℃变性30s，55℃延伸30s，72℃延伸1min，30个循环。PCR产物 经凝胶电泳分析得知，获得约为750bp的DNA条带(图3)，产物回收纯化，连接，转化， 通过测序获得了763bp的DNA片段，借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完 整序列，该序列全长为1207bp，具有SEQ ID No：1的DNA序列，76-786bp为其完整编码 区域，具有SEQ ID No：3的DNA序列编码的蛋白含有237个氨基酸残基，具有SEQ ID No： 2的氨基酸残基序列。

实施例2、乌拉特柄扁桃SOD蛋白的序列及功能分析实验

2.2生物信息学分析：

用BLAST和DNAMAN软件对乌拉特柄扁桃SOD蛋白的序列进行比较分析，结果表明 乌拉特柄扁桃SOD与桃、橡胶树及野草莓的SOD具有极大的同源性(如图4，图5所示)。

2.2转基因分析：

2.2.1表达载体的构建

设计引物1对引物用于构建植物表达载体

SOD-f：5′-cccTCTAGAATGGCTCTTCGAGCTCTCGTGGCC-3′

SOD-r：5′-cccGGATCCTCAAGGGCTTTCTTTCTCGTACAC-3′

(其中下划线部分分别表示XbaI，BamHI酶切位点)。

植物表达载体的构建过程：提取乌拉特柄扁桃叶片的总RNA，用oligo(dT)₁₈作反转录。 反转录产物用引物SOD-f，SOD-r进行PCR，得到含有完整开放阅读框的DNA片段，连接到 pMD19-T载体上，获得重组克隆载体，命名为pMD-SOD。转化大肠杆菌，并送到生物公司 测序。对于含有正确序列的菌株，摇菌提取质粒，用XbaI和BamHI分别双酶切pMD-SOD 和pBI121载体，回收、纯化酶切产物。按照pBI121载体：SOD片段为1：7的比例，用T4DNA 连接酶于16℃连接过夜，从而获得含有乌拉特柄扁桃SOD编码序列的重组表达载体，命名 为pBI-SOD。

2.2.3拟南芥转化及鉴定

利用质粒小提试剂盒提取pBI-SOD质粒，用CaCl₂-冷冻法转化方法导入农杆菌GV3101 中。对转化的农杆菌进行PCR检测分析，利用花序浸泡法，对处于花蕾期的野生型拟南芥进 行处理，具体步骤为：用已制备好的含有pBI-SOD植物表达载体质粒的农杆菌菌液对已经长 出腋生花序的拟南芥植株进行侵染，约浸泡2min，罩上塑料薄膜保持湿度，遮光处理1d后 重新放置到人工气候箱中培养。收获转基因拟南芥种子，经75％的酒精消毒10min后，均匀 点播至含有50mg/L卡那霉素1/2MS培养基上，待种子发芽，选取能够正常生根的拟南芥转 移至土壤中继续培养。对转基因拟南芥植株，进行PCR检测。

2.2.4抗氧化性检测

收集转基因和野生型拟南芥植株相同部位的叶片0.5g，放入预冷的研钵中，加入1ml预 冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5-2ml于1000rpm下离心 20min，上清液即为SOD粗提液。采用氮蓝四唑(NBT)，测定SOD含量。

收集成熟转基因和野生型拟南芥植株相同部位的叶片，分别放置在含有5％H₂O₂的MES 缓冲液中(3mM，pH5.7)。待三天后，观察离体叶片情况。

2.2.5结果分析

通过测定转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片中SOD含量，结果显示，转基因植株中SOD 含量明显升高(图6)。通过分析转基因植物的抗氧化能力，将离体叶片放置在含有5％H₂O₂的MES缓冲液中，三天后，结果显示，转基因拟南芥叶片还能保持部分绿色，而野生型拟南 芥的绿色则部分或完全褪去(图7)。以上结果表明：转乌拉特柄扁桃SOD基因能够提高转 基因拟南芥的抗氧化能力，乌拉特柄扁桃SOD基因在植物抗氧化方面起着重要的作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡 熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容， 而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发 明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技 术方案的范围内。