一种吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物的应用

摘要

本发明公开一种吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物，其特征在于：具有如式(I)所示结构，

说明书

技术领域

本发明涉及光动力治疗领域。更具体地，涉及一种吡啶-4-乙炔基咔唑有机 盐衍生物的应用。

背景技术

光动力疗法(Photodynamic Therapy，简称PDT)也称光化学疗法，主要是 指利用光激活光敏剂产生的光化学效应选择性的杀伤肿瘤细胞或病原微生 物，是医学与光物理学、光化学、光生物学等多个学科交叉渗透而形成的一 门新兴边缘科学和临床治疗新技术，目前已经成功应用于恶性肿瘤的治疗等 方面。通过将光敏剂施入人体，采用合适波长的光激发后，在靶点肿瘤组织 中的生物物质(DNA，蛋白质，不饱和脂肪酸等)内发生一系列光化学反应， 产生一些活性中间体物质，从而发挥治疗肿瘤的作用(M.Korbelik,Photochem. Photobiol.Sci,2011,10:664-669；A.Kamkaew,S.H.Lim,H.B.Lee,L.V.Kiew, L.Y.Chung and K.Burgess,Chem.Soc.Rev.,2013,42,77)。相比于其他传统 的肿瘤治疗技术，光动力疗法的优势在于其高效性和安全性。光动力灭菌基 于光动力作用，是指利用光敏剂在特定波长激发下产生的活性物质有效的杀 灭细菌和病毒，在感染性疾病的治疗中，有很好的应用前景。

通常，光动力治疗的工作波长集中在500-700nm范围内，对人体组织的 光动力杀伤深度一般只有几毫米，因而主要适用于皮肤或内部器官的腔表面 肿瘤，难以对深层的肿瘤组织发挥良好的治疗作用，因而在临床范围内应用 有限。双光子光动力治疗是近年来新兴的一种光动力治疗。结合光敏剂本身 的双光子吸收的特性，双光子光动力治疗的工作波长范围由可见光波段扩展 到与生物光学窗口700-1000nm相匹配的近红外波段。因此，双光子光动力治 疗具有组织穿透性好、光损伤小、空间选择性高等优点，能够大幅提高光动 力的作用深度。同时，双光子吸收的过程仅能发生在激光的焦点处，因此可 以高选择性地损伤病变细胞，从而降低对周围正常组织的伤害。

在光动力治疗的药物体系中，光敏剂分子起着关键性作用。光敏剂一旦 进入体内就会在癌细胞中聚集，当利用特定波长的光激发后可杀伤癌细胞。 目前国内外报道的光敏剂主要有血卟啉衍生物、酞菁类衍生物、卟吩类衍生 物、金属配合物光敏剂、醌类光敏剂、方酸类光敏剂等。这些光敏剂均采用 单光子吸收的工作原理，工作波长较短，而由于它们的双光子吸收截面都很 小，限制了其在双光子光动力治疗中的应用。因此，制备出具有较大双光子 吸收截面的光敏剂是有效实施双光子光动力治疗急需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐 衍生物，该类化合物具有分子结构简单、易于合成的特点。

本发明要解决的第二个技术问题是提供吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物 在光动力治疗中的应用。

本发明要解决的第三个技术问题是提供吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物 在双光子光动力治疗中的应用。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生 物在制备双光子光动力治疗药物中的应用。

为解决上述第一个技术问题，本发明提供一种吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐 衍生物，具有如式(I)所示结构，

其中：R₀为氢原子或R₁为C1-C12的烷基或芳基；R₂为甲 基或乙基；R₃为卤素离子、取代苯磺酸根、蒽醌磺酸根、烷基磺酸根或烷基 羧酸根离子；优选的，所述卤素选自氯、溴或碘。

式(I)所示的化合物由下述方法制备：

反应方程式如下：

其中，

将具有式(A)的化合物和相应的烷基化试剂按照1:1.5-1:5的比例在乙腈中 混合，加热回流的条件下反应10-24小时，抽滤后得粗产物，用甲醇重结晶 或洗涤后得到相应的纯净目标产物。

优选地，所述烷基化试剂选自氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、烷基取 代的苯磺酸、烷基取代的蒽醌磺酸、烷基取代的磺酸酯或磷酸酯或它们的任 意混合物。

具有式(A)的化合物的合成可参照文献Jin-Feng Xing等人的题为“Design  of high efficiency for two-photon polymerization initiator:combination of radical  stabilization and large two-photon cross-section achieved by N-benzyl3,6-bis- (phenylethynyl)carbazole derivatives”J.Mater.Chem.,2007,17,1433-1438的文 章。

为解决上述第二个技术问题，本发明采用下述技术方案：

吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物在光动力治疗中的应用，该类分子在 300-1300nm光激发下能够产生光动力活性，可以光动力损伤癌细胞或光动力 杀菌，能用于光动力治疗。

为解决上述第三个技术问题，本发明采用下述技术方案：

吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物在双光子光动力治疗中的应用，该类分 子在在700-1300nm的激光照射下具有较大的双光子吸收截面，可以光损伤 DNA等生物靶分子，能够用于双光子光动力治疗。

为解决上述第四个技术问题，本发明采用下述技术方案：

吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物可用于制备双光子光动力治疗药物。

本发明中的吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐类化合物在700-1300nm的波长范 围内都有较大的双光子吸收，可用相应范围内的波长激发产生光动力活性， 其双光子吸收截面采用美国Newport公司Spitifire PRO-F1KXP型可调谐飞秒 激光器放大级(重复频率1000Hz,脉宽120fs)，鉴于分子的荧光量子效率很低， 测量采取非线性透过的方法。

本发明的吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐衍生物用作双光子光动力治疗以及光 动力杀菌的的光敏剂。该类化合物在富氧条件下利用光激发能够产生超氧负 离子和单线态氧等活性氧物种，在无氧条件下可与靶分子(如DNA等)作用 产生甲基自由基等活性自由基，可以使DNA发生光致断裂，进而杀死肿瘤细 胞，病变细胞以及细菌。同时，此类化合物在700-1300nm的波长范围内具 有较高的双光子吸收截面，可利用近红外波段光的激发产生光动力活性，能 用于双光子光动力治疗。

本发明的有益效果如下：

本发明的吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐类化合物在富氧条件系下产生超氧负 离子和单线态氧等活性氧物种，在无氧条件下可与靶分子(如DNA等)作用 产生甲基自由基等活性自由基，可以使DNA发生光致断裂，进而杀死肿瘤细 胞，病变细胞以及细菌。DNA断裂实验证实分子在飞秒激光器800nm光激发 下的双光子光损伤。细胞实验验证了这类分子可以利用其光动力活性光杀伤肿 瘤细胞，在双光子光动力治疗的应用方明有良好的应用前景。

本发明的吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐类化合物在光照条件下能够有效抑制 大肠杆菌的生长活力，具有明显的光暗毒性的对比，在制备光动力杀菌药物以 及感染性疾病的治疗方面具有良好的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出通过ESR检测到的实施例1中化合物在二甲基亚砜(DMSO)中的 超氧负离子自由基信号；

图2示出通过ESR检测到的实施例1中化合物在二甲基亚砜(DMSO)中的 单线态氧自由基信号；

图3示出通过ESR检测到的实施例1中化合物在除去氧气的PBS缓冲液 中与DNA相互作用后产生的甲基自由基信号；

图4示出实施例1中化合物在一系列条件下利用太阳能模拟器光照下断裂 pBR322DNA的电泳图；

图5A示出实施例1中化合物在溶剂中760nm波长下的双光子吸收截面测 量结果；

图5B示出实施例1中化合物在溶剂中800nm波长下的双光子吸收截面测 量结果；

图6示出实施例1中化合物在800nm飞秒激光照射下光断裂pBR322DNA 的电泳图；

图7A和图7B示出实施例1中化合物光诱导肿瘤细胞凋亡的效果图；

图8A和图8B示出实施例1中化合物光动力杀菌的效果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步 的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当 理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明 的保护范围。

实施例1

化合物的合成

3,6-双(吡啶-4-基乙炔基)-N-戊基咔唑碘盐的合成，反应方程式如下：

将3,6-双[2-(甲基吡啶鎓-4-基)-乙炔基]-N-戊基咔唑(1.5g,3.9mmol)溶解 在120mL无水乙腈中，加入碘甲烷(2.5mL)，加热回流20小时。冷却后抽 滤，得粗产物。粗产物固体用甲醇重结晶，抽滤后干燥得黄色固体1.6g。

终产物的NMR谱图数值如下：

1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)：9.03(d,4H,J＝6.5Hz),8.77(s,2H), 8.28(d,4H,J＝6.5Hz),7.95(s,4H),4.58(t,2H,J＝6.4Hz),1.87(m,2H),1.36 (m,4H),0.87(t,3H,J＝5.8Hz)。

实施例2

化合物双光子光损DNA

下面结合图1-5，以实施例1中化合物为例，对本发明中吡啶-4-乙炔基咔 唑有机盐在各种条件下对pBR322DNA光损伤的效果进行详细说明。

使用5,5-二甲基-1-氧化吡咯啉(DMPO)作为超氧自由基(O₂^-.)的自旋 捕获剂，在汞灯激发下测量化合物在DMSO中的顺磁共振谱，得到如图1所 示的四重峰，其精细裂分常数与文献中DMPO-O₂^-.的裂分常数相一致，证明 化合物在光激发下与氧气作用产生了超氧自由基。

使用2,2,2,2-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)作为单线态氧的自旋捕获剂，在汞 灯激发下测量化合物在DMSO中的顺磁共振谱，得到如图2所示的三重峰， 其精细裂分常数与文献中TEMPO的裂分常数相一致，证明化合物在光激发下 与氧气作用产生了单线态氧自由基。

将化合物溶于PBS缓冲液(50μM)加入pBR322DNA(30μM)，通N₂20 分钟，使用5,5-二甲基-1-氧化吡咯啉(DMPO)作为自由基捕获剂，在汞灯激 发下测量体系的顺磁共振谱，得到如图3所示的6重峰，其精细裂分常数与文 献中DMPO-CH3的裂分常数相一致,证明无氧条件下化合物能够光激发通过电 子转移同DNA发生作用，并产生甲基自由基。

将50μL超螺旋pBR322DNA(碱基对浓度31μM)和20μM的化合物的 PBS(PH7.4)混合溶液用太阳能模拟器(λ≥400nm)光照25min后，加入 15μL电泳缓冲液，混匀，用微量注射器取15μL进行琼脂糖电泳分离1小时 (Tris-acetic acid-EDTA缓冲，pH8.0)。凝胶置于1mg/L EB水溶液中染色45 分钟，清水漂洗30分钟后，用凝胶成像系统分析。所得结果如图4所示：line4 显示化合物在光照条件下能够有效地使pBR322质粒DNA的超螺旋结构(SC) 变为环形质粒形式(NC)，而未光照或未加化合物光照DNA的超螺旋结构均未 发生明显变化。上述现象证明实施例1中化合物可以在有氧和无氧条件都使超 螺旋pBR322DNA发生光致断裂，具有较高活性。

将化合物溶于DMSO配成2×10^-3M的溶液，采用非线性透过法对化合物 在760nm和800nm的放大级飞秒激光下的双光子吸收截面进行了测量。实验 中首先需确定非线性吸收系数(β)，如图5A和5B所示，分别为化合物在760nm 和800nm处透过率与光强的关系，利用公式拟合后得到相应的β值，进而计算 出双光子吸收截面值。结果表明化合物具有较强的双光子吸收截面。化合物在 760nm波长下的双光子吸收截面为522GM，在800nm波长下的双光子吸收截 面为400GM。

将50L超螺旋pBR322DNA(碱基对浓度31M)和10-40M的化合物的 PBS(PH7.4)混合溶液用800nm的激光为光源(美国Newport公司Spitifire  PRO-F1KXP型可调谐飞秒激光器放大级，重复频率1000Hz,脉宽120fs)，光 斑不聚焦，平均功率约为100mW，照射40分钟后进行琼脂糖电泳并用成像 系统分析。所得结果如图6所示：line2-4显示化合物在800nm激光的照射下 能够有效的实现光损伤DNA，而未加化合物的情况下DNA的超螺旋结构并未 发生明显变化。上述现象证明实施例1中化合物在双光子激发的条件下，能够 使DNA双光子光损伤，具有较高的双光子光动力活性。

实施例3

化合物对细胞的光动力杀伤

采用激光共聚焦显微镜对化合物对宫颈癌细胞(HeLa)细胞的光致杀伤效 果。将HeLa细胞培养24小时后，加入3μM实施例1中的化合物，继续培养 2小时后在共聚焦荧光显微镜下进行观察。在显微镜下利用405nm的激光波长 进行观察。如图7A所示，可明显观察到添加化合物的细胞随时间的延长迅速 发生细胞膜破裂产生气泡并造成细胞凋亡。相对的，如图7B所示，未加化合 物的细胞随时间的延长并未发生明显的变化。说明化合物在激光激发的条件能 够对癌细胞产生光动力杀伤。

实施例4

化合物的光动力杀菌实验

将化合物(3μM)与大肠杆菌的PBS(PH7.4)悬浮液(≈108cells/mL)混合 后在37℃下避光孵育30分钟后，采用太阳能模拟器(λ≥400nm)照射30 分钟，不光照的对照样品采用相同浓度比例在37℃下避光孵育1小时。处理 过的大肠杆菌用PBS稀释后涂布在3M PetrifilmTM E.coli Count Plate上，在 37℃下避光孵育48小时。细菌菌落数(CFU)采用自动菌落计数议(Shineso G6 Colony Counter)计数。结果如图8A和图8B所示，光照后与未光照的相比，在 光照条件下大肠杆菌的菌落数减少2-3个数量级，上述结果表明化合物诱发的 光动力反应可以有效地抑制大肠杆菌的活力。

参照实施例1-4的结果，可以证明本发明中的吡啶-4-乙炔基咔唑有机盐类 化合物具有的双光子光动力活性，双光子激发条件下能够对生物体中的靶分子 (如DNA等)造成光动力损伤，在光激发条件下也能对肿瘤细胞产生光动力 杀伤，可用作光动力治疗癌症和皮肤及皮肤相关疾病的光动力组合药物。同时， 该类化合物还具有光动力杀菌的活性，在光激发下可以抑制菌体的生长活性， 可用作细菌性感染性病变治疗的组合药物。

显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非 是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说 明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方 式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍 处于本发明的保护范围之列。