一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法

摘要

本发明公开了一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。通过对DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的检测来反映核酸的甲基化水平：6-甲基氨基嘌呤的存在会降低DNA复制和RNA逆转录时的底物活性，在DNA复制和RNA转录过程中，有甲基化位点出现时，将不会发生链延伸；因此，可以通过掺入脱氧核苷三磷酸进行链延伸来达到区分甲基化和非甲基化序列的目的，同时可以对DNA和RNA的特定位点的甲基化水平做出定量评估。本发明可很好地用在DNA和RNA的核苷酸分离中的6-甲基氨基嘌呤分析上，是一种简便的检测DNA和RNA中腺嘌呤甲基化程度的方法。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。

背景技术

表观遗传学是在研究与经典孟德尔遗传法则不相符的生命现象过程中逐步发展起来的一门学科，又称为“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”或“后遗传学”，主要研究在细胞核中脱氧核糖核酸（DNA）没有改变的情况下对于功能可逆的、可遗传的改变。甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。DNA的甲基化是表观遗传学的一种机制，它通过特定的甲基化酶将甲基加在DNA分子上，如胞嘧啶的5’碳上，甲基化之后的DNA序列在复制、转录及翻译的过程中都不会发生改变，但是却会改变最终的遗传表现。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）和少量的6-甲基氨基嘌呤（N⁶-甲基腺嘌呤，m⁶A）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。甲基化修饰同样也会发生在RNA水平上。

RNA同时具有调控和信息分子的双重功能，在众多细胞机制中发挥着核心的作用，例如作为遗传信息的信使，催化生化反应，作为细胞结构骨架等。RNA转录后的修饰为RNA功能的多样化奠定了化学基础， 2011 年更新的RNA修饰数据库RNAMDB共收录了109 种RNA的修饰形式，其中甲基化修饰占80%，最常见的是发生在信使RNA（mRNA）中腺苷的N⁶位置上（m⁶A），但被研究得不是很多。

6-甲基氨基嘌呤是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化，最早是在细菌DNA中发现的。1955年Dunn等人在观察胸腺嘧啶的结构类似物对Bacterium coli 15T的影响时，发现DNA复制过程中出现了一种新碱基。将DNA水解后利用二维纸层析方法进行碱基分离时，除了得到四种常见的碱基（A、T、C、G）外，还发现了第五个紫外吸收点。经过多重实验鉴定，对应于该吸收光点的新碱基为N⁶-甲基腺嘌呤。同时，在其他一些菌株和噬菌体中也检测到了6-甲基氨基嘌呤的微量存在。1958年，Dunn等人在研究Bacterium coli RNA中的非自然碱基时也同样分离到了6-甲基氨基嘌呤。另外，在多种高等真核真核生物以及病毒的mRNA中都检测到m⁶A的存在。6-甲基氨基嘌呤如此广泛的存在让我们很难忽视它的生物学意义和重要性，从而进行更深入的研究。

传统认识认为，由于被甲基化的碱基A没有改变它的碱基配对能力，目前还不能通过直接测序来检测，也没有发现它有独特的的化学反应。如DNA中的5-甲基胞嘧啶经过亚硫酸氢盐法处理后会发生碱基变化从而可以通过测序检测。所以之前的检测方法一直是基于放射性标记技术，即将甲基供体S-腺苷甲硫氨酸进行放射性标记，并于待处理的细胞进行孵育，随后通过薄层色谱（TLC）或高效液相色谱（HPLC）来检测。但是这种方法既昂贵又繁琐，效率又低，而且无法实现大规模的基因检测及确切的甲基化位点的定位，局限性很大。因此，发展新型的甲基化碱基A的检测方法，方便、快捷、低成本地对其进行检测，十分重要。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种方便、低成本的定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。

本发明基于引物延伸法和凝胶电泳法的原理对DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤进行检测，其检测原理是：含有6-甲基氨基嘌呤的模板链在延伸时会降低底物的活性，使延伸减慢；同时在含有甲基化的位点与模板链互补配对的互补链不能发生延伸；通过反应时间的不同，可以区分甲基化和非甲基化的序列，同时也可以对特定位点的甲基化水平进行定量评估。

一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法，包括如下步骤：

1）进行DNA复制反应：向含有2~10 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾、20~100 mM的硫酸镁和20~100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入DNA聚合酶、引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸和DNA模板链，形成DNA复制反应体系，其中，DNA复制反应体系中各物质的浓度：DNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM，三磷酸脱氧核糖核苷酸为100 ~ 400 μM，DNA模板链为0.3 ~ 3 mM；DNA复制反应体系在50~70℃中延伸反应20~60 min；

2）进行RNA逆转录反应：向含有2~10 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾、20~100 mM的硫酸镁和20~100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制剂和RNA模板链，形成RNA逆转录反应体系，其中，RNA逆转录反应体系中各物质的浓度：RNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM、三磷酸核糖核苷酸为100 ~ 400 μM，RNA酶抑制剂为0.2~0.5 U， RNA模板链为0.2~3 mM；其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制剂浓度比为1:1；RNA逆转录反应体系在50~70^oC中延伸反应20~60 min；

3）定位定量检测6-甲基氨基嘌呤：分别向步骤1）的DNA复制反应体系和步骤2）的RNA逆转录反应体系中加入猝灭剂使延伸反应终止，然后在80~100 ^oC孵育10~30 min，冷却至室温，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测出DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的数量；根据引物链和其延伸链的相对位置，可以确定DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的特定位点。

所述的DNA模板链为不含6-甲基氨基嘌呤的DNA和含6-甲基氨基嘌呤的DNA。

所述的RNA模板链为不含6-甲基氨基嘌呤的RNA和含6-甲基氨基嘌呤的RNA。

所述的三磷酸脱氧核糖核苷酸为脱氧胸苷三磷酸、三磷酸脱氧尿苷、5-羟甲基脱氧尿三磷酸或5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸。

所述的DNA聚合酶为牛生长激素聚合酶时，DNA复制反应体系中加入耐热聚合酶反应缓冲液(ThermoPol^TM)和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），DNA复制反应体系中耐热聚合酶反应缓冲液的体积分数为50%、聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为1wt%。

所述的DNA聚合酶为克列诺片段聚合酶时，DNA复制反应体系中加入双酶切缓冲液(NEBuffer2)和2.5倍缓冲溶液体积的二硫苏糖醇，DNA复制反应体系中双酶切缓冲液的体积分数为50%。

所述的猝灭剂中甲酰胺的体积分数为80%、乙二胺四乙酸二钠的浓度为200 mM，猝灭剂的pH值为8.0。

所述的聚丙烯酰胺凝胶为体积分数为12%~20%的变性聚丙烯酰胺凝胶。

本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明对6-甲基氨基嘌呤的检测方法，前期预处理时间短，方便快捷，无需进行放射性标记。

（2）本发明所有的结果可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳得到，可以进行大规模的基因检测，而且可以准确检测出甲基化特定位点，并对其做出定量评估。

（3）本发明通过对6-甲基氨基嘌呤定位定量的研究，可以深度研究6-甲基氨基嘌呤的生理学功能，为癌症、衰老、老年痴呆等疾病的研究提供依据以及帮助。

附图说明

图1为腺嘌呤和6-甲基氨基嘌呤的结构示意图。

图2为DNA-A和DNA-m⁶A的不同延伸行为的聚丙烯酰胺凝胶分析图；其中，primer代表未延伸条带，primer + 1代表延伸的条带， 1为非甲基化模板链的泳道， 2为甲基化模板链的泳道。

图3为RNA-A和RNA-m⁶A的不同延伸行为的聚丙烯酰胺凝胶分析图；其中，primer代表未延伸条带，primer + 1代表延伸的条带， 1为非甲基化模板链的泳道， 2为甲基化模板链的泳道。

图4为不同浓度比例RNA-A和RNA-m⁶A中的不同延伸行为的聚丙烯酰胺凝胶分析图；其中，primer代表未延伸条带，primer + 1代表延伸的条带，1~11泳道代表含不同浓度比例的RNA-m⁶A的凝胶电泳图。

图5为不同浓度比例RNA-A和RNA-m⁶A中的引物延伸线性关系图。

具体实施方式

以下实施例用以进一步说明本发明的技术方案，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1：待测体系设计

(1) 设计两种类型的DNA模板链，其中一条为普通带腺嘌呤的DNA（DNA-A），其序列为5’-CCCACCCTATAGAGTCGTA-3’；另一条为带6-甲基氨基嘌呤修饰的DNA（DNA-m⁶A），其序列为5’-CCCm⁶ACCCTATAGAGTCGTA-3’，引物链为5’-GTGCATGTGGCAG-3’。

(2) 设计两种类型的RNA模板链，其中一条为普通带腺嘌呤的RNA（RNA-A），其序列为5’-CCCACCCUAUAGAGUCGUA-3’；另一条为带N⁶-甲基腺嘌呤修饰的RNA（RNA-m⁶A），其序列为5’-CCCm⁶ACCCUAUAGAGUCGUA-3’，引物链为5’-GTGCATGTGGCAG-3’。

(3) 配制10组含不同浓度RNA-A和RNA-m⁶A混合模板链的样品，其中RNA-A和RNA-m⁶A的浓度比例依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8和0:10。

实施例2：进行DNA复制反应

（1）配制含有10 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、50 mM硫酸铵、10 mM氯化钾、100 mM硫酸镁和100 mM聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液；向20 μL的缓冲溶液中加入以下物质使其最终浓度： Bst聚合酶为0.5 U，5-羟甲基脱氧尿苷三磷酸（5-hmdUTP）为400 μM，引物链为200 nM；

（2）分别加入所设计的两种类型的DNA模板链，总浓度为300 nM，在50 ^oC的水浴中孵育60 min；

（3）向反应体系中加入500 μL猝灭剂（甲酰胺的体积分数为80%，乙二胺四乙酸二钠浓度为200 mM，pH=8.0），80 ^oC孵育20 min，然后自然冷却至室温；

（4）将反应液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（体积分数为12%的变性聚丙烯酰胺凝胶），获得所需数据。结果如图2(泳道1为非甲基化模板链，泳道2为甲基化模板链)所示，primer代表未延伸条带，primer + 1代表延伸的条带，因此可以达到很好的甲基化区分效果。

实施例3：进行RNA逆转录反应

（1）配制含有2 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10 mM硫酸铵、1 mM氯化钾、20 mM硫酸镁和20 mM聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液；向20 μL的缓冲溶液中加入以下物质使其最终浓度： Bst聚合酶为0.2 U，RNA酶抑制剂为0.2 U，5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5-F-dUTP）为100 μM，引物链为200 nM；

（2）分别加入所设计的两种类型的RNA模板链，总浓度为500 nM，在70 ^oC的水浴中孵育20 min；

（3）向反应体系中加入500 μL猝灭剂（甲酰胺的体积分数为80%，乙二胺四乙酸二钠浓度为200 mM，pH=8.0），100 ^oC孵育10 min，然后自然冷却至室温；

（4）将反应液进行聚丙烯酰胺凝胶（体积分数为20%的变性聚丙烯酰胺凝胶）电泳，获得所需数据。结果如图3(泳道1为非甲基化模板链，泳道2为甲基化模板链)所示，primer代表未延伸条带，primer + 1代表延伸的条带，可以达到很好的甲基化区分效果。

实施例4

（1）配制含有5 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、30 mM硫酸铵、3 mM氯化钾、50 mM硫酸镁和50 mM聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液；向20 μL的缓冲溶液中加入以下物质使其最终浓度： Bst聚合酶为0.44 U，RNA酶抑制剂为0.44 U，5-氟代脱氧尿三磷酸（5-F-dUTP）为200 μM；并加入20 μL 100 nM的引物链；

（2）加入不同浓度比例的RNA-A和RNA-m⁶A混合模板链的样品，总浓度为200 nM，在60 ^oC水浴中孵育30 min；

（3）向反应体系中加入500 μL的猝灭剂（甲酰胺的体积分数为80%，乙二胺四乙酸二钠浓度为200 mM，pH=8.0），90 ^oC孵育30 min，然后自然冷却至室温；

（4）将反应液进行聚丙烯酰胺凝胶（体积分数为16%的变性聚丙烯酰胺凝胶）电泳，获得所需数据。

对含有不同浓度比例的RNA-m⁶A的凝胶电泳图和含量的线性关系分析，结果如图4所示，随着RNA-m⁶A浓度比例的增加，其延伸链的比例逐渐减少，并呈现线性关系，线性相关系数R²=0.9938。根据引物链和其延伸链的相对位置，可以验证RNA中m⁶A的特定位点。以此结果可预测未知序列中m⁶A的含量以及其特定位点。

不同种类的聚合酶均可用于本发明的链延伸，包括热稳定聚合酶（Taq DNA聚合酶）、牛生长激素聚合酶（Bst聚合酶）和克列诺片段聚合酶等。若反应体系中为Bst聚合酶，则需在含有1×ThermoPol^TM(1×即稀释1倍)和1wt% Triton X-100的反应体系中进行孵育；若反应体系中为克列诺片段聚合酶，则需在含有1×NEBuffer 2和50 μL的二硫苏糖醇的反应体系中进行孵育。

不同种类的核苷酸均可用于本发明的链延伸，包括脱氧胸苷三磷酸（dTTP）、5-羟甲基脱氧尿三磷酸、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)和5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸等。