一种中药组合物在制备抑制癌细胞向腹膜转移的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种中药组合物在制备抑制癌细胞向腹膜转移的药物中的应用，属中药应用领域，该中药组合物是如下重量份比例的原料药制成的：黄芪、女贞子、人参、灵芝、莪术、白术、半枝莲、绞股蓝、茯苓、鸡内金、蛇莓、白英、茵陈、徐长卿、土鳖虫、白花蛇舌草。本发明配伍合理，药物不良反应小，可供病人长期使用。

说明书

技术领域

    本发明属中药应用领域，具体地，涉及一种中药组合物在抑制癌细胞种植性转移中的应用。

背景技术

癌症会发生远位转移，远位转移是指从原始的发生部位侵入循环系统，转移到身体其他部位继续生长的过程，这样使得治疗上变的更为困难。实体肿瘤的远位转移是引致病人死亡的主要原因。体腔内的转移主要发生在胸腔和腹腔内，而腹膜转移大多数来自胰腺癌、结肠癌和卵巢癌，其次是胃癌和子宫颈，当肿瘤细胞通过胸腔或腹腔进行传播并发展成转移病灶时，癌细胞需要进行自我调节适应环境并且与间皮细胞相互作用。

间皮是覆盖体内空腔的上皮，空腔主要有腹膜腔、胸膜腔和心包腔构成，形成间皮的主要细胞类型是间质细胞，这是一个单层的细胞层，携带有间质细胞和上皮细胞标记。间皮作为体腔保护层和无粘着力的表面，可以是自我更新的。因此，该层参与了腔内炎症、组织修复、液体和电解质运输和癌细胞的粘附和传播。间皮细胞恶性转化所导致的间皮瘤，是一种侵袭性很高的恶性肿瘤，几乎没有有效的治疗措施。

间皮细胞可能是肿瘤细胞的一个特异性附属位点（Cunliffe and Sugarbaker, 1989）。这被认为是与透明质酸层有关，透明质酸层一种由间皮细胞释放的蛋白质，并连同其他蛋白形成一种间皮的保护性表面。腹膜转移主要是通过两个途径：系统扩散和侵入局部组织后局部植入。远离腔体的肿瘤可能是经系统扩散这条途径发展成种植转移，比如，乳腺癌和肺癌腹膜转移。大多数腹膜转移来自原与腹膜腔相毗邻的原发肿瘤，即来自于胃、结肠、胰腺、卵巢、膀胱等处。来自于肿瘤的癌细胞向周围组织浸润，突破腹膜内面并在腹膜腔体内种植，尽管浆膜内和浆膜下扩散均能被发现。腹膜扩散的许多形式已经明确，肿瘤-间皮的交互作用是建立体腔内转移肿瘤的必要的步骤。

一项胸腹膜恶性积水（490例胸膜和359例腹膜）的实验说明最常见的原发性肿瘤的胸膜转移灶是乳腺癌（50.8%），其次是妇科肿瘤（21.2%）和肺癌（19.8%），而腹膜转移灶是妇科肿瘤（60.3%），其次是胃肠肿瘤（23.4%）和乳腺癌（14.0%）（Antic et al. 2012）。当肿瘤细胞在胸腔或腹腔传播通过并发展成一个转移病灶时，癌细胞需要适应环境并与间皮的细胞发生交互作用。某些肿瘤出现腹膜转移的发生率更高，比如卵巢癌、胰腺癌和直肠癌分别有90，50，40和32%将会出现腹膜转移。当然，腹膜转移不会单独发生，可以被视为一个癌症细胞广泛传播的局部区域。比如，70%具有淋巴转移的卵巢癌也有腹膜转移(Amadori et l 1997)。同样，50%已侵入浆膜的胃癌患者具有腹膜转移（Cintro and Pearl 1996, Marutsuka et al 2003），大多数乳腺癌患者具有腹膜转移（Del Castillo et al 1993, Douglass and Penetrante 1990）。不幸的是，广泛扩散的腹膜转移患者生存时间不超过6个月（Sadeghi et al 2000）。

针对腹膜的治疗选择非常有限。实际上，因为腹膜转移的特殊性质，对这一致命性的状态尚缺乏特殊治疗。外科切除主体肿瘤便成为管理选择。但是，这对已经形成的腹膜转移收效甚微。作为系统转移的部分，全身化疗和腹腔内化疗一直试图作为主要癌症和腹膜转移的治疗选择，但也收效甚微。

腹膜转移的另一领与是对腹膜转移的预防和早期干预。一个关键的机会是在外科手术程序中。手术方法是根除主要肿瘤的关键。这也许会引起意外的副作用，即肿瘤细胞在腹膜腔种植，尽管外科医生都试图避免这一后果。另外，在手术过程中也存在腹膜转移或肿瘤细胞种植的可能。总之，手术本身显示了出色的防止腹膜转移机会，并在其多面扩散之前尽早对转移采取措施。然而，对于这种介入的选择方法很少。除了技术之外，为防止人为植入，通过使用填充/隔离材料，以避免接触肿瘤和周围组织。在手术过程中，广泛采用的方法是在手术过程中腹膜洗涤/灌溉。清洗的目的就是为了通过更多的水去除任何组织碎片和可能存在的肿瘤细胞，这是很难令人满意的解决方案。但是，这一提高也是令人兴奋的。

癌症细胞与间皮细胞的接触跟随着肿瘤细胞在这样一个新位置的粘附、入侵和增长。间皮细胞在肿瘤细胞粘附和生长中的作用仍不明确。许多研究已经阐明创伤的间皮表面是肿瘤细胞粘附的特异性位点，可能是由于肿瘤细胞对间皮细胞透明质酸层的粘附（Cunliffe and Sugarbaker 1989），上调了间皮细胞粘附分子对炎性介质的反应和暴露于ECM之下。但是，透明质酸在条件培养基上培养的间皮细胞，阻止了肿瘤细胞对间皮细胞的粘附，这可能是通过绑定肿瘤细胞上CD44分子和防止它们与间皮细胞表面的透明质酸相互作用而实现的（Jones et al. 1995）。另一方面，肿瘤细胞释放的因子或粘附基质可能为癌细胞与间皮细胞之间的相互作用提供了良好的环境。比如，来自于癌细胞的IL-1β或TGF-β1能够激活间皮细胞和（或）粘附基质以促进腹膜播散（Lv et al. 2012; Watanabe et al. 2012）。进一步研究这一特殊的相互作用将揭示癌细胞在胸腹膜腔内的播散机制，并且可能提供新的治疗机会。

透明质酸与CD44之间的相互作用需要一系列的细胞内事件，虽然目前详细的机制尚不明确。两种蛋白的相互作用激活了细胞内的激酶，包括c-SRC激酶，它能够调节CD44与细胞内膜下蛋白ERM（ezrin-moesin-radixin）家族之间的相互作用，使CD44能与细胞骨架相连接。

观察肿瘤细胞之间相互作用的方法相当有限。可以通过直接观察（Akedo et al 1986）和（或）通过标记染色。钙黄绿素是一种荧光染料，可以穿透细胞质，能够用来测定细胞活力和短时标记细胞与细胞之间相互作用的事件（Alkhamesi et al 2005）。采用钙黄绿素标记的卵巢癌细胞，Ksiazek等发现衰老的腹膜间皮细胞能够促进细胞粘附（Catterall et al 1994, Ksiazek et al 2009）。这种方法之所以吸引我们，原因在于它能够利用多个孔板并在一个孔板上执行分析。但是，与其他基于荧光的分析相似，这一方法需要标记细胞并逐步清洗。这在细胞相互作用期间也是很难实时观测的。集落形成试验也被用于研究肿瘤和间皮的细胞之间的相互作用。Casey等（2003）报道了一种方法采用台盼蓝染色的通透性增高的间皮细胞，为了显现卵巢癌细胞的粘附和侵袭。基于以上观察，间皮的细胞并不会形成克隆，Mitsui等（2012）直接在间皮细胞中加入了肿瘤细胞并让其有广泛增长的时间（2周）。所形成的克隆，可以采用常规组织学方法显示出来，被认为是癌症细胞，从而可以进行研究。

发明内容

本发明提供一种中药组合物可以有效抑制癌细胞向腹膜转移，没有明显副作用。

本发明所述中药均可按照《全国中药炮制规范》或《中药大辞典》进行炮制。本发明药物是由如下重量份比例的原料药制成的:

黄芪120-360  女贞子100-300    人参30-95     灵芝30-95  

莪术65-195   白术30-90        半枝莲65-195  绞股蓝120-360

茯苓30-95   鸡内金15-45   蛇莓65-195   白英65-195 

茵陈65-195  徐长卿65-195  土鳖虫10-30   白花蛇舌草65-195。

优选的，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:

黄芪140   女贞子250    人参40    灵芝85   莪术75  白术80  

半枝莲85   绞股蓝300   茯苓40    鸡内金35    蛇莓75   

白英175   茵陈85  徐长卿175   土鳖虫15   白花蛇舌草165。

或

黄芪300   女贞子150   人参90   灵芝40    莪术180   白术40  

半枝莲180   绞股蓝150   茯苓80  鸡内金20   蛇莓175   

白英85   茵陈175    徐长卿75   土鳖虫25  白花蛇舌草95。

或

黄芪250   女贞子200   人参65      灵芝65     莪术132  

白术64    半枝莲128   绞股蓝256   茯苓65    鸡内金30 

蛇莓128   白英128     茵陈128     徐长卿128   

白花蛇舌草128   土鳖虫20。

所述癌为胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌或骨肉瘤。

为实现发明目的，优选地将所述中药组合物制成活性成分，由以下步骤制成:

 (1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

 (2)、女贞子、人参加6-10倍量50-90%乙醇提取1-3次，每次1-4小时，合并提取液，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，药渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿加4-8倍量水提取挥发油，收集挥发油，另器收集，残渣及水溶液备用; 

(4)、土鳖虫、鸡内金、茯苓粉碎成细粉；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后残渣及水溶液合并，加7-10倍量水，加热煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成清膏，干燥，粉碎，备用;

步骤（4）所得粉碎粉、步骤（3）所得挥发油与步骤（5）所得的干膏粉共同构成该中药组合物的活性成分。

为实现发明目的，将该中药组合物制成胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

本发明药物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。

优选的，该中药组合物在制备联合FAK抑制剂、SRC抑制剂、CD44抑制剂或HA抑制剂抑制癌细胞向腹膜转移的药物中的应用。

所述中药组合物在制备围手术期防止癌细胞向腹膜转移药物中的应用。

所述中药组合物在制备联合化疗抑制癌细胞向腹膜转移药物中的应用。

本发明药物组合物具有可以有效的抑制癌细胞向腹膜转移。本发明配伍合理，简单易行，为纯中药制剂，不良反应小，可供病人长期使用。

为了验证该中药组合物的效果，做了以下实验：

实验一

抑制剂：透明质酸抑制剂购自剑桥生物科学(英国剑桥生物公司,英国)。FAK抑制剂，PF573228，肝细胞生长因子受体抑制剂(PHA665752)，AuroraB抑制剂ZM447439，cSRC抑制剂AZM-475271均购自于Tocris生化药剂(布里斯托尔，英国)。ERK抑制剂(FR180204)和JNK抑制剂(Inhibitor-I)购自于英国默克公司（密理博，英国）。 

抗体： CD44抗人类抗体来自RnD欧洲（牛津，英国）和抗体在线。人单克隆SRC抗体、phospho-SRC、phospho-FAK，人Ezrin、 phospho-Ezrin、phospho-Paxillin，GAPDH和多克隆抗体Radixin、人整合蛋白-α5β1全都来自于Santa Cruz生物技术（Santa Cruz，加州，美国）。用于流式细胞仪分析的抗膜联蛋白-V抗体来自于Santa Cruz生物技术有限公司。单克隆抗人FAK抗体和抗人Paxillin抗体皆来自于信号转导实验室(Lexinton，美国)。羊多克隆抗透明质酸抗体来自于ABD Serotec有限公司（牛津，英格兰，英国）。

特殊化学品和培养基

高分子量透明质酸购自西格玛-奥德里奇（普尔，多塞特，英国）。DiI ((2Z)-2-[(E)-3-(3,3-dimethyl-1-octadecylindol-1-ium-2-yl)prop-2enylidene]-3,3-dimethyl-1-octadecylindole; perchlorate)购自于分子探针公司（俄勒冈州，美国）。五氟脲嘧啶（5-FU）、菁蒿素及Hoescht 33258购自于西格玛-奥德里奇。Ficoll-Hypaque来自GE电气医疗集团。16-well and 8-well Chamber slides常规免疫荧光购自于Nunc，共聚焦显微镜来自于西格玛-奥德里奇。ECIS阵列（96W1E）来自于应用生物物理学（新泽西，美国）。

 其他试剂和化学物质来自下面的来源:

试剂                                             供应商

胎牛血清(FCS)             西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

醋酸                                   费舍尔科学,莱斯特,英国

丙酮                                   费舍尔科学,莱斯特,英国

丙烯酰胺混合物(30%)       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

琼脂糖                       实验室有限公司试点,萨福克郡,英国

过硫酸铵                  西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

两性霉素B                 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

蛋白定量试剂盒                 bio rad实验室、海克斯、CA、美国

硼酸                                  Duchefa生物,哈勒姆,荷兰

溴酚蓝                    西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

氯化钙                    西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

氯仿                      西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

Chemiluminiscence工具包       通用电气医疗集团、卡迪夫、英国

考马斯蓝                 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

结晶紫                   西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

DAB色原                    向量实验室公司,伯林盖姆、钙、美国

焦碳酸二乙酯             西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

二甲基桠枫                     Fisons科学设备、拉夫堡、英国

DEME培养基                 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

DEME缓冲液               西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

EDTA(乙二胺四乙酸)                     Duchefa生物,哈勒姆,荷兰

乙醇                                  费舍尔科学,莱斯特,英国

溴化乙锭                 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

荧光介质                             CalBiochem,诺丁汉,英国

甲醛                     西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

Propidium碘染色溶液       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

甘氨酸                        实验室有限公司试点,萨福克郡,英国

甘油                       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

盐酸                       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

马血清                     西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

异丙醇                     西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

氯化钾                          Fisons科学设备、拉夫堡、英国

磷酸二氢钾                BDH化学品有限公司,普尔,英格兰,英国

Mayers Htx              西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

甲醇                                  费舍尔科学,莱斯特,英国

半脱脂牛奶                             特易购、卡迪夫、英国

氯化钠                  西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

磷酸二氢钠                   BDH化工有限公司,英国多塞特郡普尔

叠氮化钠                 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

氢氧化钠                 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

硝酸纤维膜                             Ammersham、卡迪夫、英国

青霉素                     西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

RMPI1640培养基             西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

SDS培养液                     实验室有限公司试点,萨福克郡,英国

Serum bovine albumin       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

链霉素                     西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

SupersignalTM西硬脑膜系统  皮尔斯生物技术公司,罗克福德,IL,美国

TBS自动化清洗缓冲                     影响医疗、康科、CA、美国

四甲基乙二胺(TEMED)       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

TRI试剂                   西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

Tris-Cl                       实验室有限公司试点,萨福克郡,英国

Triton                     西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

胰蛋白酶                  西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

Triton X100               西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

吐温20                        实验室有限公司试点,萨福克郡,英国

Propidium碘染色溶液       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

TRITC共轭抗鼠抗体         西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

TRITC共轭抗山羊抗体       西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

牛血清白蛋白共轭抗鼠抗体  西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

牛血清白蛋白共轭抗羊抗体  西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

HRP共轭抗山羊抗体         西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

HRP共轭抗鼠抗体           西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

HRP共轭抗兔抗体           西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特,英国

人原代腹膜间皮的细胞主要准备工作

正常大网膜组织，征得患者同意和伦理委员会批准后，由结直肠手术后收集。通过连续酶制备的方法提取并纯化腹膜间皮细胞。细胞培养系是RPMI介质，包括10% FCS、氢化可的松、胰岛素和抗生素。净化间皮细胞使用8通道。

研究应用的另一种人类腹膜间皮的细胞是细胞株LP9，购自美国的老年病研究所。

本发明药物的提取物（石家庄以岭药业股份有限公司），以下简称DME25。DME25通过使用分光光度计在405nm波长时量化制剂的光密度使其标准化。不同批次的DME25通过化学指纹图谱使其一致。在使用前都存储在- 20摄氏度。实验之前,相同数量的BSS(平衡盐溶液,由79.5克氯化钠,2.2 g氯化钾,2.1 g和1.1 g Na2HPO4 KH2PO4,在10 l DD水和pH值为7.2 - -7.4)作为初始溶液，加入到干粉末中，即5毫升无菌BSS被添加到一瓶5毫升的提取物冻干粉。10分钟混匀至，准备用于实验。

肿瘤-间皮的影响

腹膜间皮的细胞,或人类腹膜间皮的细胞株LP9,分配到96孔板，约5000细胞/孔。在孵化器内混合过夜。

癌症细胞用DiI(10μg /毫升40分钟,10毫克/毫升DMSO)进行荧光染色料,。洗掉多余DiI,这些细胞被添加到间皮的单层, （含有介质,不同浓度DME25,各种抑制剂和组合DME25和抑制剂），40分钟。游离的癌细胞使用无菌缓冲溶液BSS轻轻地洗掉，剩余的附于间皮细胞的癌细胞用4%福尔马林固定一个小时。附着的细胞的数量是在荧光显微镜下数出(奥林巴斯DMB)。照片拍摄使用数码相机(滨松、日本)。每张图片由一个亮视野和一个荧光图像（来自相同的视野）随后附和而。数出癌症细胞数量。

细胞生长试验

肿瘤细胞和原代腹膜间皮的细胞被种到96孔板。DME25提取物添加到细胞进行测试。细胞在37摄氏度5%二氧化碳培养72小时,然后固定于4%(v / v)福尔马林和1%(w / v)结晶紫。洗后,染料被10%(v / v)乙酸提取。经过仔细混合，使用滤波器与波长在540nm吸光度读出96孔板的数值。

电子细胞基质阻抗判断分析肿瘤间皮的和肿瘤透明质酸反应

96 w1e +复合ECIS(应用生物物理学,特洛伊,新泽西,美国)首先被腹膜间皮的细胞株(LP9)或腹膜间皮的细胞经隔夜完全覆盖。对于肿瘤透明质酸的研究，高分子量透明质酸,稀释在无菌水中，添加到96孔板，数量在10μg /孔。允许空气干燥和随后水化。癌症细胞被添加到各自的孔，连同测试试剂包括小抑制剂和提取物。接下来使用ECIS，并用相关软件分析，然后提供细胞粘附痕迹的3 d模型。

免疫荧光分析和共焦显微镜

人类腹膜间皮的细胞被种到16 孔板(常规IFC)和8孔板(用于共焦显微镜)，过夜。洗掉多余的DiI洗液后,癌症细胞被添加到间皮的细胞单层。对于双重组织细胞免疫荧光染色，癌症细胞被直接添加到间皮的细胞结合测试。40分钟后，细胞用福尔马林固定，在短暂的洗涤后,细胞被0.1%Triton渗透，X100 5分钟，然后冲洗。这些细胞被TBS缓冲(TBS由12.1 gTri和40克氯化钠5升蒸馏水组成,pH值调整到7.4。)与1%马血清混合1小时,然后添加稀释在TBS缓冲液的0.3%马血清。

对于双重免疫荧光染色法，不同物种的抗体添加在TBS缓冲液0.1%稀释马血清添加。双重染色包括CD44/Ezrin, FAK/integrin, paxillin/integrin, SRC/ezrin。对于单一的蛋白质染色,我们使用前面给出的方法用DiI预标记癌细胞。切片用BSS清洗之后再添加各自的二抗与适当的荧光标记。洗后,切片使用FluoSave常规荧光显微镜拍摄(奥林巴斯英国,英国绍森德在海上,英国)。共焦显微镜载玻片,切片上添加50% glyceral，于共焦显微镜检查。于FluoView FV10i确定适用范围内检查。

双彩色扫描,即牛血清白蛋白/ TRITC或牛血清白蛋白/ DiI,加上相衬图片,同时采取使用z-stack功能。图像合成为2 d和3 d分析。

免疫印迹

细胞在组织培养瓶中培养。无血清培养基添加到细胞中，保持2小时血清饥饿,在测试之前将材料及其组合添加到细胞。40分钟后,细胞被吸附。离心后收集细胞。提取液(由以下构成：抑制Triton-X100,2mM-1.5%氯化钙,1毫克/毫升,1毫克/毫升亮抑酶肽抑肽酶和10毫米原钒酸钠)被添加到细胞颗粒。加到超声发生器5分钟，4摄氏度。通过离心分离不溶物在13000 rpm,样本添加加样缓冲然后在100 度煮开5分钟。等量的蛋白质被加载到8% sds - page。在印迹蛋白质在硝化纤维在半干压滤,脱脂牛奶(1小时有10%半脱脂牛奶),加上初级抗体(稀释在TBS缓冲区包含0.1% Tween20)包被,洗掉后加入过氧化物酶共轭二抗。蛋白质使用了一个数码成像仪成像。

体内腹膜转移模型的建立 

无胸腺的雌性裸鼠,4-6周龄,从查尔斯河实验室采购和在过滤器笼子饲养。所有的实验过程进行了二级无菌操作。老鼠接受后一个星期开始实验。目前的研究已经测试了三个腹膜转移模型,即AGS人类胃癌细胞株的胃癌模型, 人类大肠癌细胞HT115的结直肠癌模型，ASPC1胰腺癌模型。

所有的癌症细胞从组织培养瓶满之前恢复并培养。数以五百万计的肿瘤细胞在一个体积为0.5毫升无菌BSS缓冲液中被注入到腹膜腔。老鼠被随机分为测试组别。实验前,所有的材料都准备好。然后盲目编码。随后的测试，从编码的测试材料注射到动物组编码都基于盲法基础上。代码在实验完成后被打乱。

注射癌细胞置于组织培养瓶，注射溶剂包括DEM25、CSRC抑制剂、5-FU（作为控制剂使用）、或者为以上药物的混合物。另有组别比较口服与腹腔内注射的不同疗效。每天监测小鼠观察任何可能的副作用(即体重减低、饮食、饮酒习惯和呼吸窘迫)。

三周后,小鼠癌症晚期。收集腹水。受污染的红细胞被添加DD水以造成细胞溶解(1份细胞悬液到4份DD水，30秒)离心后去除上清。细胞颗粒缓冲后，被4%福尔马林固定。细胞凋亡和细胞周期随后使用流式分析仪数出数目并测出。

打开腹腔,暴露腹壁、内脏表面、网膜，置于配有LED照明灯解剖显微镜下检查,以确定所有的转移性结节。这一步是由三个人操作，以便达到公正的计数。计算每只老鼠转移焦点的数量。使用数码相机拍摄的彩色转移焦点。每个转移焦点的大小被量化,如果可能的话,使用一个图像分析工具根据累积体积计算。显示每组平均数量和焦点转移性结节的总数。

组织学和免疫荧光分析

体内研究最后得到的肿瘤结节储存在-80 摄氏度直到使用。被冻结的组织切片厚度8 um，使用低温恒温器。固定后,切片被风干处理和H&E染色。对免疫荧光染色,冻结部分首先在TBE缓冲溶液中缓冲，于1%马血清中放置一小时。初级抗体在0.1%马血清TBE缓冲液稀释一小时,清洗后，添加二级抗体，一个多小时。Hoescht 33258用作胞核染色剂。进行双重染色:CD44(鼠标)/HA(羊),CD44(鼠标)/ Ezrin(山羊),SRC(兔)/ pEzrin(鼠标)。

通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡

所有的细胞都来源于腹腔。用4%福尔马林固定。细胞被PBS冲洗后，在1 x膜联蛋白绑定缓冲再悬浮，离心。5μl膜联蛋白V和1μl的牛血清白蛋白被添加到100μl的细胞悬液。孵化后置于室温下15分钟,400μl 1 x膜联蛋白-缓冲,混合保存。固定后,细胞悬液的添加propidium染色，加入孵化核糖核酸酶在4°C 3小时，随机使用流式细胞分析仪和FlowMax软件包分析。细胞周期是如图所示的比例G1,G2 / M S和阶段。

统计分析

使用SigmaPlot进行分析(版本11)(Systat软件有限公司,Hounslow、伦敦、英国)。测试正态分布和t检验,用ANNOVA测试。对偏离的数据用曼惠特尼U测试和ANNOVA进行了测试。

结果

本发明药物抑制癌细胞-间皮细胞的相互作用

我们首先检验DME25是否对癌细胞和间皮细胞之间的相互作用造成影响。在此，我们使用腹膜间皮原代细胞，通过图1-4，我们可以明显看出DME25显著减少了粘着的癌细胞数量。表1显示了间皮单层细胞上粘着的癌细胞的量化结果。

图1是未使用DME25的人类肠癌细胞（HT115），图2是使用DME25的人类肠癌细胞（HT115），图3是未使用DME25的卵巢癌细胞（SKOV3），图4是使用DME25的卵巢癌细胞（SKOV3）。背景单层细胞是间皮细胞，表1-癌细胞和腹膜间皮原代细胞之间的相互作用。表明了间皮细胞上的粘着癌细胞的数量。

癌细胞更多地粘附于透明质酸基质表面，DME25可以阻断癌细胞在透明质酸基质表面的粘连

透明质酸（HA）蛋白层是紧密地附着在间皮细胞表面的一层蛋白。为了研究癌细胞是如何粘附与透明质酸上的，我们用透明质酸覆盖细胞培养皿，并且调整ECIS方法实时追踪细胞-基质之间的粘附。癌细胞粘附到透明质酸上比在用塑性表面处理的细胞培养基上要更加迅速。DME25对粘附在透明质酸和用塑性表面处理的细胞培养基上的癌细胞都具有显著效果，HT115和SKOV3对DME25更敏感。如图5-7中所示，DME25对癌细胞粘着透明质酸（HA）涂层或非涂层表面（对照组）的作用。与非HA涂层表面相比，癌细胞更快地粘着于HA涂层的表面上。

DME25(在1:1000的浓度下的情况，并且在1000Hz条件下)对抑制癌细胞的粘着有显著效果。

HA抑制剂抑制肿瘤-间皮的相互作用，与本发明药物一起使用有累加效应

我们进一步探讨了透明质酸酶抑制剂（HAi）是如何影响癌细胞-间皮细胞和以及癌细胞-HA之间相互作用以及在这些过程中抑制剂是如何与DME25联合作用的。图8、9显示的是癌细胞粘着于间皮细胞的数量，显示了透明质酸酶抑制剂和DME25组合的作用。HA抑制剂和DME25均对相互作用有显著影响。二者的组合具有更加显著的效果，图8是DME25和透明质酸酶抑制剂对AGS胃癌细胞的作用；图9是DME25和透明质酸酶抑制剂对结直肠癌细胞的作用。图10是HAi和DME25对SKOV3和透明质酸涂层表面之间粘附的影响；图11 HAi和DME25对HT115和透明质酸涂层表面之间粘附的影响。

FAK抑制剂抑制癌细胞-间皮细胞的相互作用，与本发明药物一起使用效果更好。

整合素类在将癌细胞锁定到间皮细胞表面时发挥重要的作用。DME25能够抑制FAK在内皮细胞和癌细胞中的活性。在此，我们进一步测验FAK抑制剂和DME25是否可以干预癌细胞-间皮细胞之间的相互作用。

如图12所示，DME25和FAKi对AGS癌细胞-间皮细胞相互作用较明显，并且二者的组合进一步加强了这种抑制作用。图13显示，尽管DME25和FAKi分别对HT115有明显的抑制效应，但是二者的组合并没有产生更大的效果。根据图14，用于SKOV3细胞的HT115也出现了类似的观察结果。

当对癌细胞-HA之间的相互作用进行测验时，我们发现在HA涂层表面，HT115和SKOV3细胞与FAK抑制剂和DME25反应良好，并且二者的组合带来更好的抑制效果。AGS细胞与FAK抑制剂和DME25反应均较弱。这些也显示在用ECIS方法的三维图中，见图15，

DME25抑制腹膜间皮细胞迁移，图16所示，

本发明药物在HA与c-SRC通路相关的影响

探讨cSRC激酶通路在DME25介导透明质酸抑制肿瘤相互作用的作用，肿瘤和间质细胞之间的联系需要透明质酸的参与,即肿瘤细胞和间皮细胞将利用细胞表面蛋白质、CD44来与透明质酸(HA)发生相互影响。CD44是跨膜蛋白,变形连接到ERM家族（埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白）,并通过ERM家族连接到细胞骨架，CD44和 ERM蛋白之间的相互作用是与cSRC通路密切相关的, cSRC通路是一个和粘附、迁移和入侵的癌症细胞有关的重要信号通路。

我们首先测试和cSRC抑制剂的相互作用。cSRC抑制剂所使用的浓度远低于IC50(0.5-1uM)，即为100nM，避免巨大的细胞毒性。如图17。由于低浓度，在100nM cSRC抑制剂对肿瘤HA没有明显效果。然而，在肿瘤HA相互作用中，cSRC抑制剂(上-D)显著增强DME25抑制作用(图17上，C)。值得观注的是cSRC抑制剂在非HA涂层培养表面对DME25没有效果。

值得注意的是cSRC抑制剂也增加了HA抑制剂和抗CD44的抑制效果，但不是FAK抑制剂对肿瘤HA的相互作用，如图18。HA抑制剂(上)和抗CD44(中)介导的抑制是由cSRC抑制剂加强，但不是通过FAK抑制剂介导的(下)。

在胰腺癌细胞,ASPC1和MIA PA CA2上可看到同样地情况(图19)。

同样，DME25和cSRC抑制剂也能抑制胰腺癌细胞和间皮细胞间的相互作用(图20)。

DME25对cSRC和Ezrin蛋白磷酸化有抑制作用。如图21，DME抑制cSRC和Ezrin蛋白磷酸化。同样，HA抑制剂抑制Ezrin蛋白的磷酸化，但对它的影响很小。

DME25对CD44、Ezrin,、cSRC 和phospho-SRC细胞定位有显著效果。虽然对Ezrin效果不明显，但DME可显著影响总的cSRC和phospho-SRC的细胞内定位。 (图22，23)。

图24和25显示的是CD44染色的结肠癌细胞(红色)和原代培养的腹膜间皮细胞之间的相互作用。在原代培养腹膜间皮细胞（MESO998）中加入刺激胰腺癌细胞ASPC-1后CD44的染色。在对照组中，间皮细胞呈尖峰或膜褶皱，接触到癌细胞（由白色箭头指示），细胞结构富含CD44染色。然而，在DME25处理过的细胞，间皮细胞出现较小高低不平或更少的膜皱褶。

本发明药物体内抑制癌细胞的腹膜扩散

我们使用体内模型进一步测验了DME25对来自结直肠癌和胰脏癌的腹膜转移的抑制作用。每日腹腔注射DME25能显著降低腹腔中HT115结肠直肠癌细胞转移结节数。

图26是未使用本发明药物的结肠直肠癌的转移结节数量，图27是使用了本发明药物的结肠直肠癌的转移结节数量，可以看出，转移结节明显减少；图28是未使用本发明药物的胰腺癌的转移结节数量，图29是使用了本发明药物的胰腺癌的转移结节数量，每天腹腔注射DME25明显减少了癌细胞在腹腔中的转移结节的数量。

如图30、31所示，同样，DME25也降低了来自PANC1细胞的转移性肿瘤的重量，这样将逐渐形成较少的结节数量。转移性胰腺癌的体积被DME25减小。在胰腺癌模型中，我们也测验了HA抑制剂（HAi）对转移性肿瘤形成的影响。HA抑制剂对腹膜转移有明显效果，当与DME25共同注射时效果更加明显。

为了评估DME25试验动物给药，播种癌细胞前，裸鼠首先接受了7天的口服DME25。7天后进行腹腔注射癌细胞注射。如图32、33、34和表2（结肠直肠腹膜信息研究汇总）所示，在大肠癌模型中，预治疗带来提供额外的效果。

对腹膜转移和一个胃癌模型预处理的应用,DME25腹腔内治疗比口服治疗有较强作用

如图35所示,在胃癌细胞(AGS)种植前预处理7天对结节形成提供了一些切实的好处。此外,腹腔内治疗似乎比口服治疗更有效。表明在研究终末期，口服和腹腔内治疗显著降低了来自腹腔的癌细胞数量。腹膜腔自由浮动的癌细胞数量减少如(图36)所示。

采用DME25和化疗相结合的腹腔内治疗对结肠癌有加强作用

我们比较DME25、5-FU以及它们的联合应用效果。见图37，用5-FU腹腔注射对继发性结节形成有重要作用, 虽然这种差异与单独给药时没有统计学区别，但DME25和5-FU的联合应用有一个加强的抑制作用,

为了进一步评估DME25体内作用,我们从腹腔内获取浮动癌细胞和分析它们的细胞周期分布(图38-42)。

此外,已经证明,转移性结节的数量与G2 / M期的细胞具有显著相关性(表3)。转移性结节数量和(G0 + G1)/(G2 / M)比率也有显著负相关(表3)。

DME25肝脏和小肠组织学没有影响

肝组织形态学评估。正如图43所示，肝组织未出现明显形态学改变，同样地，没有出现转移结节的腹膜表面也没有显著的变化（图44）。

DME25显著提高与转移性结节相关腹膜的强度和完整性。

正如图45中所示，当形成转移结节，腹膜表面被认为不完整。然而，当运用DME25对小鼠进行治疗后，腹膜层强度增加（较厚），腹膜间皮细胞被覆在腹膜上很好的包绕在肿瘤周围（图45中的下图）。当进一步对腹膜透明质酸进行研究发现，DME25治疗的小鼠腹膜透明质酸很明显更丰富。此外，DME25治疗组间皮细胞数量同样增加（图46）。图46中所示的是各组的肿瘤和腹膜表面。对照组腹膜薄弱并中断。而DME25组具有一个增厚并健康的腹膜表面。

实验二

为阐明本发明中药组合物抑制癌细胞向腹膜转移的活性，用按实施例1方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

1、临床资料

一般资料  102例患者均为河北以岭医院住院病例，随机分为治疗组和对照组，治疗组53例，年龄41-77岁，平均（67.6±3.3）岁，其中胃癌15例，肝癌10例，肺癌12例，食管癌17例，就诊时均已经进行了相应的手术治疗，化疗次数均在1次以内，并且未出现远端转移，对照组49例，年龄40-76岁，平均（67.3±2.7）岁，胃癌14例，肝癌10例，肺癌10例，食管癌15例，就诊时均已经进行了相应的手术治疗，化疗次数均在1次以内，并且未出现远端转移，两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05），具有可比性。

2、治疗方法

2.1对照组按照常规化疗，出现相应并发症状时按照常规对症治疗，临床观察两年。

2.2治疗组在对照组的基础上加服本发明药物，一次4粒，一日3次，临床观察两年。

2.3 观察指标

主要观察远端转移的情况，一旦发生远端转移，即进行相应治疗。

2.4 统计方法  计数资料用χ²检验，计量资料用t检验。

3、疗效观察

根据相应检查结果确定是否发生远端转移，根据转移部位进行统计，分为肝脏转移，腹膜转移，肺部转移，其它部位转移；转移部位不包括原位肿瘤；同时观察两组患者的平均手术结束至发生转移时间周期。

4、治疗结果：两组肿瘤转移发生情况见表4-7。

由以上结果可以看出，治疗组各种远端转移的发生率均显著低于治疗组，并且转移发生的时间周期也显著长于对照组。

并且治疗恶性组肿瘤向腹膜转移的发生率显著低于肺部转移、肝脏转移以及其他部位的转移，发生率仅为肺部转移、肝脏转移以及其他部位的转移等其它方向转移的一半左右，而对照组腹膜转移的发生率和肺部转移、肝脏转移以及其他部位的转移等其它部位转移的发生率则没有显著差异。

    5、结论：由以上临床观察可以得出，本发明药物可以显著抑制癌细胞的远端转移；并且本发明药物对于癌细胞向腹膜转移的抑制效果尤为明显。

实验例三

为了说明本发明的药物组合物在治疗癌细胞转移的效果，用按实施例1方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

1、    临床资料

100例患者均为河北以岭医院住院病患，随机分为治疗组额对照组，治疗组50例，年龄在45-77岁，平均（65.6±3.3）岁，其中胰腺癌12例，卵巢癌13例，结肠癌11例，直肠癌14例，就诊时均已进行相应的手术治疗，一直在进行化疗，已经出现远端转移，转移到腹膜的病例为20例，转移到肝肺等其他部位的病例为30例；对照组50例，胰腺癌13例，卵巢癌13例，结肠癌12例，直肠癌12例，就诊时均已进行相应的手术治疗，在进行化疗，已经出现远端转移，转移到腹膜的病例为22例，转移到肝肺等其他部位的病例为28例；两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05），具有可比性。

2、治疗方法

2.1对照组按照常规化疗，出现相应并发症状时按照常规对症治疗，临床观察两年。

2.2治疗组在对照组的基础上加服本发明药物，一次4粒，一日3次，临床观察两年。

2.3 观察指标

主要观察对癌细胞远端转移的治疗情况。

2.4 统计方法  计数资料用χ²检验，计量资料用t检验。

3、疗效观察

3.1 疗效标准

根据相应检查结果确定转移部位病程有所缓解。

4、治疗结果：两组肿瘤转移发生情况见表8-9。

其中，A为其他部位癌细胞转移部位，B为腹膜转移，从这表可以看出治疗组的效果优于对照组，说明本发明药物可以有效治疗癌细胞的转移。尤其是对腹膜转移的效果尤为佳，对照组的临床有效率差别不大，但是治疗组的腹膜转移的治疗效果好于其他部位的治疗效果。

实验例四

为阐明手术中使用本发明中药组合物冲洗腹膜的效果，用按实施例1方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

1、临床资料

50例患者均为河北以岭医院住院病例，随机分为治疗组和对照组，治疗组25例，年龄41-77岁，平均（61.6±3.3）岁，其中宫颈癌8例，前列腺癌9例，膀胱癌8例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；对照组25例，年龄40-76岁，平均（67.3±2.7）岁，其中宫颈癌9例，前列腺癌8例，膀胱癌8例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移，两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05），具有可比性。

2、治疗方法

2.1对照组手术+术中腹腔灌洗，临床观察两年。

2.2治疗组手术+本发明药物冲洗，临床观察两年。

2.3 观察指标

主要观察远端转移的情况，一旦发生远端转移，即进行相应治疗。

2.4 统计方法  计数资料用χ²检验，计量资料用t检验。

3、疗效观察

根据相应检查结果确定是否发生远端转移；同时观察两组患者的平均手术结束至发生转移时间周期。

4、治疗结果：两组肿瘤转移发生情况见表10。

实验例五

为阐明本发明中药组合物在术前的效果，用按实施例1方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

1、临床资料

60例患者均为河北以岭医院住院病例，随机分为注射组、口服组和对照组，注射组20例，年龄41-77岁，平均（62.5±2.3）岁，其中乳腺癌10例，骨肉瘤10例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；对照组20例，年龄40-76岁，平均（65.3±2.4）岁，其中乳腺癌9例，骨肉瘤11例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；口服组20例，年龄44-77岁，平均（64.5±3.3）岁，其中乳腺癌10例，骨肉瘤10例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；三组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05），具有可比性。

2、用药方法

2.1对照组术前不进行任何处理，口服组术前口服本发明药物，注射组术前注射本发明药物，均临床观察两年。

2.2 观察指标

主要观察远端转移的情况，一旦发生远端转移，即进行相应治疗。

2.4 统计方法  计数资料用χ²检验，计量资料用t检验。

3、疗效观察

根据相应检查结果确定是否发生远端转移；同时观察各组患者的平均手术结束至发生转移时间周期。

4、治疗结果：各组肿瘤转移发生情况见表11。

从上表可以看出本发明药物对癌细胞的转移具有抑制作用，尤其是术前注射治疗比口服效果更好。

附图说明

图1是未使用DME25的人类肠癌细胞图；

图2是使用DME25的人类肠癌细胞图；

图3是未使用DME25的卵巢癌细胞图；

图4是使用DME25的卵巢癌细胞图；

图5是DME25对结肠直肠癌细胞粘着透明质酸（HA）涂层以及非涂层表面的作用图；

图6是DME25对卵癌细胞粘着透明质酸（HA）涂层以及非涂层表面的作用图；

图7是DME25对胃癌细胞粘着透明质酸（HA）涂层以及非涂层表面的作用图；

图8是DME25和透明质酸酶抑制剂对胃癌细胞的作用图；

图9是DME25和透明质酸酶抑制剂对结直肠癌细胞的作用图；

图10是HAi和DME25对卵巢癌细胞和透明质酸涂层表面之间粘附的影响图；

图11是HAi和DME25对结肠直肠癌细胞和透明质酸涂层表面之间粘附的影响图；

图12是DME25和FAKi对胃癌细胞-间皮细胞相互作用影响图；

图13是DME25和FAKi对结肠直肠癌细胞-间皮细胞相互作用影响图；

图14是DME25和FAKi对卵巢癌细胞-间皮细胞相互作用影响图；

图15三维图显示DME25与FAK抑制剂、抗CD44和抗FnR的组合效果；

图16 DME25抑制间皮细胞迁移；上面为电损伤后细胞迁移的踪迹，每个踪迹是4个实验的一个平均数，下面四个：细胞迁移的三维图；

图17 c-SRC抑制剂和DEM25对肿瘤HA与HT115细胞相互作用的影响；

图18 cSRC抑制剂在HA抑制剂，抗CD44和FAK抑制剂介导肿瘤HA相互作用；

图19 DME25和SRC抑制剂对胰腺癌细胞黏附的影响，ASPC-1(上)和MI PA CA-2在透明质酸涂覆的表面；

图20 SRC抑制剂、AZM 475271和透明质酸抑制剂(HAi)对ASPC-1胰腺癌细胞肿瘤间皮细胞的相互作用的效果；

图21.DME、SRC抑制剂和HA抑制剂对SRC和ezrin蛋白磷酸化的效果。左图：蛋白免疫印迹总SRC和phospho-SRC，总ezrin 和 phospho-ezrin。右图：磷酸化蛋白与总蛋白定量。

图22DME25对 CSRC和磷酸化SRC在ASPC-1胰腺癌细胞上细胞定位；

图23 DME25对 HT115结肠直肠癌细胞中CSRC和磷酸化SRC细胞定位；

图24在原代培养腹膜间皮细胞中，刺激胰腺癌细胞ASPC-1后CD44的染色；

图25 DME25在体内抑制腹膜大肠癌；

图26是未使用本发明药物的结肠直肠癌的转移结节数量图；

图27是使用了本发明药物的结肠直肠癌的转移结节数量图；

图28是未使用本发明药物的胰腺癌的转移结节数量图；

图29是使用了本发明药物的胰腺癌的转移结节数量图；

图30是DME25抑制胰腺癌细胞转移动到腹膜的结节数量作用图；

图31是DME25抑制胰腺癌细胞转移动到腹膜重量作用图；

图32大肠癌模型（HT115）腹膜结节的代表图像；

图33体内HT115细胞转移结节平均数，左侧图在癌细胞播种前接收DME257天的老鼠，其体内HT115细胞转移结节平均数；右侧图肿瘤细胞接种后接受治疗的的小鼠平均转移性结节；

图34各组转移结节数的平均数；

图35腹腔的癌细胞数量，.左:肿瘤结节平均数,右:每个组别结节总数量；

图36来自腹膜腔癌症细胞数量；

图37 DME25腹膜腔肿瘤细胞细胞周期进程的影响；

图38对结肠腹膜模型浮动的癌细胞的流式细胞术分析代表图像；

图39大肠癌模型腹腔内收集细胞G0/G1期到G2/ M期比值；

图40大肠癌模型经DME25治疗后G2 / M期与G0/G1期的改变；

图41流式细胞仪分析胃癌腹膜种植模型收集到漂浮癌细胞的代表图像，组1：对照组；组2：口服DME25；组6：DME25腹腔给药；

图42流式细胞仪分析胃癌（AGS）腹膜种植模型细胞周期经DEM25治疗后改变；

图43肝脏组织形态学分析；

图44无转移性结节的腹膜组织形态学分析；

图45结肠癌腹膜转移结节组织形态；

图46对照组和DEM25治疗组透明质酸和CD44染色。

具体实施方式

实施例1： 

原料药配方为：

黄芪250g   女贞子200g   人参65g    灵芝65g     莪术132g  

白术64g   半枝莲128g  绞股蓝256g   茯苓65g    鸡内金30g 

蛇莓128g   白英128g     茵陈128g     徐长卿128g   

白花蛇舌草128g   土鳖虫20g

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加8倍量70%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用;

  (3)、莪术、白术、徐长卿，合并提取挥发油，提油时间8小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用;

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加9倍量水，加热煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度1.20的清膏，干燥，粉碎，备用;

(6)、将步骤(5)所得干膏粉加入淀粉134克，用85%乙醇制粒；

(7)、将步骤(3) 中所得挥发油用85%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（6）中所得的颗粒混匀，密闭半小时，装入1000粒胶囊即得。

实施例2：

原料药配方为：

黄芪140g   女贞子250g   人参40g    灵芝85g     莪术75g  

白术80g  半枝莲85g   绞股蓝300g   茯苓40g    鸡内金35g 

蛇莓75g   白英175g     茵陈85g     徐长卿175g   

土鳖虫15g  白花蛇舌草165g

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加6倍量90%乙醇回流提取4小时，提取液回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用;

  (3)、莪术、白术、徐长卿合并,加4倍量水提取挥发油，提油时间10小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用;

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加7倍量水，加热煎煮3次，第一次1小时，第二次2小时，第三次3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度1.25的清膏，干燥，粉碎，备用;

(6)、将步骤(5)所得干膏粉加入淀粉112克，用78%乙醇制粒；

(7)、将步骤(3) 中所得挥发油用85%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（6）中所得的颗粒混匀，按常规制剂方法制成1000片片剂。

实施例3：

原料药配方为：

黄芪300g   女贞子150g    人参90g     灵芝40g     莪术180g  

白术40g  半枝莲180g   绞股蓝150g   茯苓80g    鸡内金20g 

蛇莓175g   白英85g     茵陈175g     徐长卿75g   

土鳖虫25g   白花蛇舌草95g

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加10倍量50%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

  (3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入8倍量水提取挥发油，提油时间6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加10倍量水，加热煎煮3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤(3) 中所得挥发油用80%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5）中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成1000丸丸剂。

实施例4：

原料药配方为：

黄芪280g   女贞子180g    人参80g     灵芝40g     莪术160g  

白术50g  半枝莲100g   绞股蓝180g   茯苓70g    鸡内金25g 

蛇莓145g   白英95g     茵陈175g     徐长卿75g   

土鳖虫20g   白花蛇舌草115g

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加8倍量50%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

  (3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入7倍量水提取挥发油，提油时间6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加9倍量水，加热煎煮3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤(3) 中所得挥发油用80%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5）中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成散剂。

实施例5：

原料药配方为：

黄芪300g   女贞子200g    人参70g     灵芝70g     莪术100g  

白术60g  半枝莲140g   绞股蓝180g   茯苓60g    鸡内金28g 

蛇莓155g   白英95g     茵陈1675g     徐长卿95g   

土鳖虫20g   白花蛇舌草105g

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加10倍量50%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

  (3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入4倍量水提取挥发油，提油时间6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加10倍量水，加热煎煮3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤(3) 中所得挥发油用80%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5）中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成注射剂。

实施例6：

原料药配方为：

黄芪150g   女贞子170g    人参80g     灵芝40g     莪术150g  

白术60g  半枝莲120g   绞股蓝180g   茯苓60g    鸡内金25g 

蛇莓145g   白英95g     茵陈135g     徐长卿85g   

土鳖虫25g   白花蛇舌草95g

制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

  (2)、人参、女贞子，加7倍量50%乙醇回流提取2次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

  (3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入8倍量水提取挥发油，提油时间6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

  (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗，60℃烘干，与茯苓合并，粉碎成100目粉，于3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用;

  (5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤(2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤(3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加10倍量水，加热煎煮3小时，合并煎煮液，加入步骤(2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤(3) 中所得挥发油用80%乙醇溶解，喷入步骤(4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5）中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成栓剂。