贯众清热鼻咽喷剂在制备防治甲型流感喷雾剂中的应用

摘要

本发明属于中药应用领域，公开了一种贯众清热鼻咽喷剂在制备防治甲型流感喷雾剂中的应用。所述鼻咽喷剂由以下重量份的中药组合物制备而成：贯众600～900份、山楂50～150份、菊花30～75份、紫花地丁100～300份、白花蛇舌草30～75份。所述鼻咽喷剂的制备过程为投料提取、醇沉、水沉、配液和灭菌分装。由本发明的中药组合物制备的鼻咽喷剂可用于人体外部防治甲型流感，具有防治效果好、无毒副作用和使用方便等优点。

说明书

本发明属于中药应用领域，具体涉及一种贯众清热鼻咽喷剂在制备防治甲 型流感喷雾剂中的应用。

背景技术

流感病毒是SSRNA(线状单股负链RNA)分节段病毒，属正粘病毒科，根据 NP蛋白和M蛋白的不同，流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3种类型，其中 甲型流感病毒自然感染各种禽类、人类和猪、马等多种哺乳动物。根据HA(血 凝素：分为15个亚型)和NA(神经氨酸酶：分为9个亚型)的不同，甲型流感病 毒又可分为不同的亚型，不同亚型之间对人类与禽类所引起的临床表现不完全 相同。既往观点认为人对禽流感病毒不易感染，但经过近年来的流感病毒基因 重组，一些既往在禽间传播的高致病性禽流感病毒亚型和新形成的禽流感病毒 亚型已可以突破种系感染人类。甲型流感病毒的表面抗原经常发生变异，每当 新亚型出现时，人群对新病毒缺乏免疫力，往往造成大流行。截止2013年3月 12日，全球有15个国家报告了622例H5N1禽流感实验室确诊病例，死亡371 例，病死率高达59.65％。而最新发现的亚型H7N9人禽流感病毒更是具有隐秘 性，与以往禽流感发病特点不同，H7N9禽流感病毒在禽类身上呈弱毒性，感染 H7N9的禽(鸡)不发病，仅携带病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽 流感病毒引起的急性呼吸道感染。自2013年2月以来到2013年9月初我国内 地10余省市共报告133例H7N9确诊病例，其中43人死亡，病死率高达32％。

目前应对流感大流行的措施主要有以下几个方面：一是隔离传染源，隔离感 染者，并对高危的禽类进行大面积的捕杀或消毒；二是对患者使用抗病毒药物， 目前使用抗H7N9甲型流感的有效药物是达菲(奥司他韦)，但其价格昂贵、药源 紧缺，且本药应在患病5日内使用，尤其是在发病48小时内使用方能获效，但 本病发病初期类似普通流感易被误诊，故常失去有效的治疗，另外达菲具有如 变态反应、心肝功能的异常、胃肠道出血及皮痒、皮炎等全身和局部副作用， 因此临床使用受到一定受限，同时也不可滥用；三是接种流感疫苗，由于疫苗 的研发需要较长时间，而流感病毒变异快，一旦变异则原来疫苗无效。近日有 报道美国将开始H7N9疫苗人体试验，预计于2014年12月结束，结束后必须 要经过独立的专家小组将定期进行评估试验的安全性，但是否能达到理想的安 全性还是未知数，即使今后生产投入市场，也还要经过3期临床验证，因此还 要经过许多年后才能最终确定其是否安全，而中医治疗甲型流感有独特的优势 及广阔前景，其通过辨证施治，从整体调节改善机体免疫，增强抗病毒能力。

中医在传染病的防治中积累了许多宝贵经验，发挥了巨大作用。单1954年 以后中医正式介入西医明确诊断的流感、乙脑、病毒性肺炎、流行性出血热等 病毒性传染病的治疗和H5N1禽流感急性传染病的抢救治疗都取得了良好效果。 在2013年4月国家卫生和计划生育委员会发布的“人感染H7N9禽流感诊疗方 案(2013年第2版)”中，亦将中医中药列入了人感染H7N9禽流感治疗抢救方 案。在这次抗H7N9禽流感抢救治疗中，全国多省市中医药均参与救治人感染 H7N9禽流感患者的临床实践已证明，中医药及早介入，全程参与，效果显著， 可改善症状，截断病情，降低病死率。

本发明涉及的中药组合物的全处方组成已在文献“华佗消毒液体外实验研 究”，刘进先，《光明中医》，2013年8月第28卷第8期第1589～1591页中所 公布，其主要由贯众、菊花、山楂、紫花地丁、白花蛇草这五味常用的内服中 药组成，但并未公布这五种原料药的重量配比及工艺和质量标准研究，也未公 布其在防治甲型流感中的作用。

发明内容

发明人在已有研究成果的基础上，对该中药组合物的药理作用进行了进一 步的研究，并通过临床实践意外地发现，本发明的中药组合物在一定的重量配 比下制备得到的贯众清热鼻咽喷剂具有非常好的防治甲型流感的作用。

针对以上研究成果，本发明的目的在于提供一种贯众清热鼻咽喷剂在制备 防治甲型流感喷雾剂中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

贯众清热鼻咽喷剂在制备防治甲型流感喷雾剂中的应用，所述鼻咽喷剂由 以下重量份的中药组合物制备而成：

贯众600～900份；山楂50～150份；菊花30～75份；紫花地丁100～300份； 白花蛇舌草30～75份。

所述中药组合物的重量份优选为：

贯众850份；山楂75份；菊花60份；紫花地丁150份；白花蛇舌草45份。

所述中药组合物的重量份还优选为：

贯众700份；山楂120份；菊花40份；紫花地丁250份；白花蛇舌草60 份。

所述中药组合物的重量份更优选为：

贯众750份；山楂100份；菊花50份；紫花地丁200份；白花蛇舌草50 份。

所述鼻咽喷剂的制备过程包括以下步骤：

(1)投料提取：取贯众600～900g、山楂50～150g、菊花30～75g、紫花地丁 100～300g和白花蛇舌草30～75g，切碎后加入上述材料总重量6～10倍的水，常 温下浸提3～4小时，然后升温至沸腾煎煮40～60分钟，过滤收集滤液，滤渣再 次加入五味中药总重量6～10倍的水煎煮两次，每次煎煮30～40分钟，过滤，合 并三次煎煮所得滤液，滤液浓缩至500毫升，得到浓缩液；

(2)醇沉：浓缩液加入乙醇，使浓缩液含醇质量浓度为50％～80％，搅拌均 匀，然后静置24～28小时析出难溶于醇的杂质沉淀，过滤取滤液，回收滤液中 乙醇至滤液中乙醇质量百分含量低于0.5％；

(3)水沉：在步骤(2)的滤液中加水使其滤液总体积至600～800毫升搅 匀，2～8℃冷藏24～48小时，过滤，将滤液煮沸，冷却后再次过滤得滤液；

(4)配液：在步骤(3)的滤液中加入滤液质量10％的甘油、0.5％苯甲酸 钠和0.9％氯化钠，搅拌溶解均匀，再加蒸馏水使其滤液总体积至1000毫升，调 节PH值至5.5～7.5，得到药液；

(5)灭菌分装：将步骤(4)的药液在常压下分装于10～50ml带喷头的塑 料瓶内，灭菌后得到防治甲型流感的贯众清热鼻咽喷剂。

本中药组合物中贯众清热解毒杀虫，入肝脾经，古人常用于时疫暴戾之疾 的预防，故重用为主药。山楂消食健脾、行气化瘀，入脾、胃、肝经，药理显 示具有明显的抗菌和促进免疫作用，用于甲型流感病人有开胃健脾作用，故为 佐药。菊花等三味具有清热解毒除湿，入肺、肝、心经，药理显示具有活血化 瘀和调节机体免疫力作用，故合为臣药，以辅君药增强清热解毒、杀菌杀病毒 作用。诸药合用，组方合理，药少功著，使其清热解毒、除湿化瘀之功大为增 加，故可用于以热毒湿瘀为主要病机的甲型流感的预防。

鼻咽喷剂制备过程中先通过多次煎煮和过滤浓缩，将中药中的有效成分提 取而出，然后通过醇沉和水沉达到净化除杂的目的，并通过加入适当配料改善 药液流变性及稳定性，最后通过灭菌分装得到方便使用的喷剂产品。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的中药组合物成分具有良好的防治甲型流感作用，纯中药制剂 对人体无毒副作用；

(2)本发明的鼻咽喷剂用于易感人群防治甲型流感非常方便，在使用时只 需将该喷剂对准鼻咽部喷雾即可，而且喷剂通过特殊工艺制备除中药味外无其 他难闻气味；

(3)中药喷雾剂是很有特色的实用剂型，本发明的鼻咽喷剂既继承了传统 中医药辩证组方用药的优势，又发挥细微喷雾鼻咽给药的特点，临床应用方便， 疗效确切；

(4)本发明采用喷雾剂型，能使药物粘附于患部，可达到高效、速效的局 部给药治疗甲型流感目的；

(5)本发明采用常压下溶液喷雾，不需使用氟利昂，而更安全环保。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。

实施例1

(1)投料提取：取贯众850g、山楂75g、菊花60g、紫花地丁150g、白花 蛇舌草45g切碎后放入不锈钢容器中，加水7.08kg，常温下浸提4小时，然后 升温至沸腾煎煮60分钟，过滤收集滤液，滤渣再次加入7.08kg水煎煮两次，每 次煎煮40分钟，过滤，合并三次煎煮所得滤液，滤液浓缩至500毫升，得到浓 缩液；

(2)醇沉：浓缩液中加入95％的乙醇1083.33毫升，搅拌均匀，使液体中 乙醇质量百分含量为65％，然后静置24小时析出难溶于醇的杂质沉淀，过滤取 滤液，回收滤液中乙醇至滤液中乙醇质量百分含量低于0.5％；

(3)水沉：在步骤(2)的滤液中加水使其总体积至800毫升搅匀，3℃冷 藏24小时，过滤，将滤液煮沸，冷却后再次过滤得滤液；

(4)配液：在步骤(3)的滤液中加入滤液质量10％的甘油、0.5％苯甲酸 钠和0.9％氯化钠，搅拌溶解均匀，再加蒸馏水使其滤液总体积至1000毫升，调 节PH值至6.5得到药液；

(5)灭菌分装：将步骤(4)的药液在常压下分装于10ml带喷头的塑料瓶 内，灭菌后得到本实施例的贯众清热鼻咽喷剂。

实施例2

(1)投料提取：取贯众700g、山楂120g、菊花40g、紫花地丁250g、白 花蛇舌草60g切碎后放入不锈钢容器中，加水11.7kg，常温下浸提4小时，然 后升温至沸腾煎煮50分钟，过滤收集滤液，滤渣再次加入11.7kg水煎煮两次， 每次煎煮30分钟，过滤，合并三次煎煮所得滤液，滤液浓缩至500毫升，得到 浓缩液；

(2)醇沉：浓缩液中加入95％的乙醇1083.33毫升，搅拌均匀，使液体中 乙醇质量百分含量为65％，然后静置24小时析出难溶于醇的杂质沉淀，过滤取 滤液，回收滤液中乙醇至滤液中乙醇质量百分含量低于0.5％；

(3)水沉：在步骤(2)的滤液中加水使其滤液总体积至700毫升搅匀，5℃ 冷藏48小时，过滤，将滤液煮沸，冷却后再次过滤得滤液；

(4)配液：在步骤(3)的滤液中加入滤液质量10％的甘油、0.5％苯甲酸 钠和0.9％氯化钠，搅拌溶解均匀，再加蒸馏水使其滤液总体积至1000毫升，调 节PH值至6.5得到药液；

(5)灭菌分装：将步骤(4)的药液在常压下分装于20ml带喷头的塑料瓶 内，灭菌后得到本实施例的贯众清热鼻咽喷剂。

实施例3

(1)投料提取：取贯众750g、山楂100g、菊花50g、紫花地丁200g、白 花蛇舌草50g切碎后放入不锈钢容器中，加水9.2kg，常温下浸提4小时，然后 升温至沸腾煎煮60分钟，过滤收集滤液，滤渣再次加入9.2kg水煎煮两次，每 次煎煮30分钟，过滤，合并三次煎煮所得滤液，滤液浓缩至500毫升，得到浓 缩液；

(2)醇沉：浓缩液中加入95％的乙醇1083.33毫升，搅拌均匀，使液体中 乙醇质量百分含量为65％，然后静置24小时析出难溶于醇的杂质沉淀，过滤取 滤液，回收滤液中乙醇至滤液中乙醇质量百分含量低于0.5％；

(3)水沉：在步骤(2)的滤液中加水使其滤液总体积至750毫升搅匀，4℃ 冷藏48小时，过滤，将滤液煮沸，冷却后再次过滤得滤液；

(4)配液：在步骤(3)的滤液中加入滤液质量10％的甘油、0.5％苯甲酸 钠和0.9％氯化钠，搅拌溶解均匀，再加蒸馏水使其滤液总体积至1000毫升，调 节PH值至6.5得到药液；

(5)灭菌分装：将步骤(4)的药液在常压下分装于30ml带喷头的塑料瓶 内，灭菌后得到本实施例的贯众清热鼻咽喷剂。

以下为实施例1的贯众清热鼻咽喷剂活性物含量测试及应用效果测试：

绵马素、绵马酸鉴别：

用毛细血管取本品小量，分次点于滤纸同一点上晾干，喷以质量浓度为0.5％ 对一二甲胺基苯甲醛的1％盐酸乙醇溶液，于100℃烘2分钟，即显灰黄色，说 明该喷剂中含有绵马素、绵马酸活性物成分。

黄酮类物质鉴别：

用毛细血管取本品小量，在直径约为12.5cm的圆形滤纸距中心约1cm处的 同一点上滴2～3滴(待前一滴稍干后再滴第二滴)，将滤纸芯插入圆形滤纸的中 心小孔，移至盛有甲醇展开剂的直径约为12cm的培养皿上，并使滤纸芯垂直浸 在展开剂中，滤纸上再盖以同样直径的培养皿，进行层析展开，当展开剂前沿 达到滤纸边缘后，取下滤纸，待展开剂挥发后，喷以1％醋酸镁甲醇溶液，于80℃ 烘数分钟，氨熏后在365nm紫外灯下观察，显黄绿色荧光；取本样品1ml，加 1％醋酸铅试液数滴，即产生黄色沉淀，说明该喷剂中含有黄酮类活性成分。

总黄酮测定：

对照品溶液的制备：精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁20mg，置100ml 量瓶中加质量浓度为60％的乙醇适量，置水浴上加热使溶解，放冷，加质量浓 度为60％的乙醇稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液25ml置50ml量瓶中， 用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1ml中含芦丁0.1mg)；

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、 5.0ml分别置于10ml量瓶中，分别加入质量浓度为30％的乙醇至5ml，再分别 加入质量浓度为5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，分别摇匀，放置6分钟，再加质量 浓度为10％的硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，再放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml， 用水稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，以加入0.0ml的对照品溶液作为空白， 在510nm波长处测定吸收度；以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲 线；

供试品溶液的制备：精密吸取本品(实施例1的贯众清热鼻咽喷剂)4ml， 置于100ml量瓶中，加质量浓度为60％的乙醇至刻度，摇匀，精密吸取20ml 上述溶液置于50ml量瓶中，用质量浓度为30％的乙醇稀释至刻度，摇匀得到供 试品溶液；

测定：精密吸取供试品溶液4ml，置于10ml量瓶中，加质量浓度为30％乙 醇至5ml，再加质量浓度为5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再 加质量浓度为10％的硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，再放置6分钟，加氢氧化钠试液 4ml，用水稀释至刻度，摇匀；另取供试品溶液4ml，置于10ml量瓶中，用水 稀释至刻度，摇匀作空白，在510ml波长处测定吸收度，从标准曲线上找出相 对应的浓度，再乘以样品溶液的总稀释倍数156.25，以上实验重复5次，即得 本品(实施例1的贯众清热鼻咽喷剂)中含总黄酮量分别为5.05mg/ml、5.0mg/ml、 5.15mg/ml、5.26mg/ml和5.32mg/ml，由此确定本品中含总黄酮量为不少于 5.0mg/ml。

贯众清热鼻咽喷剂体外定量杀灭细菌繁殖体和枯黑芽胞实验：

于装有45ml贯众清热鼻咽喷剂(以下简称鼻咽喷剂)的试管中加入5ml菌液 (菌株及浓度：大肠杆菌8099，其浓度为1×10⁷cfu/L；金葡萄菌ATCC6538， 其浓度为3.74×10⁶cfu/L；枯黑芽胞ATCC9372，其浓度为1×10⁷cfu/L)分别作 用5、10、30和60分钟后，立即用微孔滤膜过滤，用50mlPBS液冲洗滤膜，然 后将滤膜放入装有10ml营养肉汤的试管中，充分振荡，将菌洗下，取0.5ml倾 注平板，37℃，24h观察结果。以生理盐水代替消毒液，滤膜洗下的菌液作定量 稀释后倾注平板，培养计数，作阳性管对照，同时设PBS液，营养肉汤，培养 基阴性对照，其它条件与实验组相同。以上实验均重复5次。实验结果：鼻咽 喷剂对细菌繁殖体的杀灭率为99.9％，已达卫生部消毒技术规范要求；对枯黑芽 胞杀灭作用显著，已达99.82％。

体外定量破坏HBsAg(表面抗原)实验：

取纯化抗原含量为100ug/ml的溶液，将鼻咽喷剂用1％小牛血清PBS按需 要稀释成60％浓度(V/V)，取纯化抗原HBsAg1质量份加入4质量份上述稀释 的鼻咽喷剂中，混匀得到混合液，待作用至规定时间后，取一质量份上述混合 液加入9质量份1％小牛血清PBS中，此时体系中含纯化抗原2000ng/ml，以稀 释法中止反应，取出一定量作ELISA检测，测定OD值，试验同时设阴性、阳 性、自身对照。根据结果计算平均破坏率，试验重复三次。实验结果表明该鼻 咽喷剂60％浓度对HBsAg作用45分钟及60分钟，其平均破坏率为95.43％和 95.64％。

体外破坏HBsAg、HBeAg定性实验：

将30％浓度(V/V)的鼻咽喷剂与含500μg/L的HBsAg阳性血清按4：1体 积比混合作用2h，检验HBsAg的含量，灭活与检测同时进行。每次测定均在相 同条件下做2μg/L标准品、100μg/L参比品、参比品稀释液、蒸馏水、正常人血 清、消毒液空白等阴、阳性对照。每个样品均重复做两次，每次均做双份平行 实验。实验结果表明30％浓度(V/V)的鼻咽喷剂对HBsAg和HBeAg均具有完 全灭活作用。

体外抗HBVDNA-P(乙肝病毒脱氧核糖核酸聚合酶)药效学实验：

将20质量份HBsAg和20质量份HBeAg强阳性的血清混合，用PBS液按 质量比为1：2、1：4、1：8和1：32稀释，然后分别与30％浓度(V/V)的鼻 咽喷剂按1：4体积比进行混合，作用2h后，测定HBVDNA-P的CPM值。在 相同条件下设置阴、阳性对照。实验后样品CPM值减去阴性对照管CPM值， 如CPM＜25判为阴性，反之为阳性。实验结果表明：30％的鼻咽喷剂对 HBVDNA-P定性实验均具灭活作用。

电子显微镜观察鼻咽喷剂对HBV的作用：

将20质量份份HBsAg和20质量份HBeAg强阳性血清混合后于4，℃ 40000rpm/min超速离心4h，弃掉上清液，将沉淀物用生理盐水1ml溶解，制成 混悬液。将混悬液0.1ml加入0.4ml30％浓度(V/V)的鼻咽喷剂中，混合作用 2h后，吸取1μl滴度碳膜铜网，用磷酸铀作负染色，在电镜下观察。相同条件 下，抽取混悬液0.1ml加入0.4ml生理盐水中作阳性对照，分别于电镜下观察。 实验结果表明在电镜下HBV的三种形态与结构均被明显破坏。

与过氧乙酸(C₂H₄O₃)体外定性破坏HBsAg的比较实验：

(1)将30％浓度(V/V)的鼻咽喷剂与含4000μg/LHBsAg阳性血清等体 积量混合并作用2min、5min、10min、20min后做1:2、1:4、1:8……1:1024的倍 比稀释以检测消毒液的灭活作用；

(2)将质量浓度为0.2％的C₂H₄O₃溶液与含4000μg/LHBsAg阳性血清等量 混合并作用30min后，按步骤(1)同样的倍比稀释以检测其灭活作用；

(3)用PBS液替代步骤(1)的鼻咽喷剂按上法作倍比稀释后作阳性对照，

实验结果表明30％浓度(V/V)的鼻咽喷剂与4000ug/L HBsAg阳性血清 作用10min后的消毒效果(1：512，P/N<2.1；1：256，P/N＝4.0)与0.2％ C₂H₄O₃作用30min后的灭活效果(1：5l2，P/N<2.1；1：256，P/N＝3.0)相 近。30％浓度(V/V)的鼻咽喷剂与4000ug/L HBsAg阳性血清作用20min后 的消毒效果(1：512，P/N<2.1；1：256，P/N<2.1)优于质量浓度为0.2％ 的C₂H₄O₃的灭活HBsAg的效果。

体外毒性药理实验：

(1)急性经口毒性试验：选健康小白鼠50只，雌雄各半。设5390mg/kg 剂量组(40只)及空白对照组(10只)，一次经口灌胃染毒后，观察14天，记 录动物中毒症状，死亡动物数及死亡时间；

(2)皮肤斑贴试验：选健康豚鼠5只，试验前将其背部脊柱两侧脊毛剪掉， 24小时后，每只豚鼠脊柱两侧各选无损伤皮肤2.5x2.5cm2皮肤一块，用蒸馏水 润湿后，一侧作实验组，用鼻咽喷剂原液0.5ml滴在2.5x2.5cm2四层纱布上，敷 贴皮肤，用一层油纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带固定。另一侧以等量蒸馏 水作对照，敷贴12小时候后，除去受试物，分别于0、4、24、48和72小时观 察皮肤局部反应，根据红斑与水肿形成的评分之和来评价对皮肤的刺激作用；

(3)眼刺激实验：选健康家兔6只，将鼻咽喷剂原液1～2滴滴入一侧眼结 膜囊内，另一侧滴入等量生理盐水作对照，立即使眼被动闭合5～10秒，于滴眼 后6、24、48小时和4、7天用肉眼检查家兔眼结膜，虹膜和角膜的损伤和恢复 情况；

(4)重金属检查：鼻咽喷剂原液经JL-551原子吸收仪检查铅(Pb)、砷(As) 含量；

实验结果表明染毒后的小鼠活动未见异常，观察期内无死亡；该鼻咽喷剂 对小鼠经口LD50＞5000mg/kg，属实际无毒；对皮肤、粘膜无过敏无刺激； Pb<1mg/kg,As<0.5mg/kg，无重金属污染。

稳定性杀菌效果观察：

(1)试验方法：按卫生部“消毒技术规范”要求进行；

(2)消毒液储存时间：自然存放一年；

(3)试验菌种及菌量：大肠杆菌(8099)，平均菌量1.53X10⁷cfu/ml；金黄 色葡萄球菌(ATCC，6538)，平均菌量3.98X10⁶cfu/ml；

(4)中和方法：中和稀释法，中和剂为质量分数为3％的吐温-80溶液；

(5)鼻咽喷剂浓度：原液(浓度：100％)。

试验结果表明该鼻咽喷剂原液作用60分钟后，对大肠杆菌的杀灭率为 99.996％；对金黄色葡萄球菌的杀灭率为99.05％，说明本发明的贯众清热灵鼻咽 喷剂杀菌性能较为稳定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。