一种苏丹草体外诱导管胞的方法

摘要

本发明涉及一种苏丹草体外诱导管胞分化的方法，属于植物细胞工程技术领域。以苏丹草种子组织培养诱导的淡黄色颗粒状愈伤组织为外植体，在不含植物生长激素的基本培养基中，添加1.0～9.0g/L活性炭，在黑暗、每日16h和24h的散射光下培养5～21d，培养室温度26～28℃，体外诱导获得了管胞。本发明建立的苏丹草体外诱导管胞分化的方法，管胞分化率最高达到47.23％，本发明的优点是：操作简便，诱导效率高，为苏丹草次生细胞壁木质素调控机制研究和定向改良提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苏丹草体外诱导管胞的方法，属于植物细胞工程技术领域。

技术背景

高粱属的苏丹草是世界各国栽培最普遍的禾本科牧草，为各类草食畜禽及食草性鱼类所喜 食，同时，由于苏丹草具有生物产量高、耐贫瘠、抗干旱、可多次刈割及光合效率高的特性， 作为一种主要的木质纤维素类高能密度作物正日益受到重视。已有研究表明，生产相同量的青 贮饲料，土地种植面积苏丹草是青贮玉米的60％，单位重量的苏丹草沼气生产量比青贮玉米提 高32％，在欧洲，1公顷苏丹草可发酵产生2130～6060m³的甲烷，而苏丹草饲料化利用和能源 转化效率都与次生细胞壁中的木质素含量负相关。国外的研究表明，体外诱导管胞分化的植物 细胞培养方法是研究次生细胞壁木质素生物合成机制的有效手段，可为木质纤维素植物定向改 良提供技术支撑，已报道建立了百日草(Zinnia elegans L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.) 和辐射松(Pinus radiateD.)等植物细胞培养体外诱导管胞的方法，结果表明影响管胞形成 的因子各不相同，而国内外有关苏丹草体外诱导管胞的方法尚未见报道。

中国专利200510122788.4公开了一种苏丹草体细胞培养高频率植株再生技术，然后中国专 利201210522552.X公开了一种苏丹草种子组织培养技术，这二项专利技术的目的均是为了获得 具有细胞全能性的胚性愈伤组织，获得的胚性愈伤组织是活的细胞，能分化成苗，为深入进行 苏丹草遗传转化和性状改良提供了研究平台。而管胞是一种无穿孔的狭长管状分子，两端渐尖， 细胞壁明显增厚，并木质化，成熟后原生质体解体，细胞死亡，不能分化成苗。正是由于上述 不同，体外诱导管胞分化的影响因素，如所需的营养元素、激素的种类及浓度，还有诱导培养 条件等均与苏丹草种子和幼穗组织培养技术有很大差异，无法相互借鉴。

发明内容

本发明的目的是：提供一种利用苏丹草种子诱导胚性愈伤组织，并进行体外诱导管胞分化 的方法，该方法能够使苏丹草胚性愈伤组织管胞分化率最高达47.23％，为研究木质纤维素能 源作物次生细胞壁调控机制和苏丹草定向改良提供研究基础和技术支撑。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种苏丹草体外诱导管胞分化的方法，以苏丹草种子组织培养诱导的淡黄色颗粒状愈伤组 织为外植体，在不含植物生长激素的基本培养基中，添加1.0～9.0g/L活性炭，在每日16h 或24 h的散射光下培养5～21d，培养室温度26～28℃，体外诱导获得管胞；其中，所述的基本 培养基为：MS大量元素+MS微量元素+B5有机成分+蔗糖30g/L+琼脂条8g/L，培养基在高压灭 菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8～5.9。

所述的苏丹草体外诱导管胞分化的方法优选以苏丹草种子组织培养诱导的淡黄色颗粒状 愈伤组织为外植体，在不含植物生长激素的基本培养基中，添加1.0～7.0g/L活性炭，在每日 16h或24h的散射光下培养12～21d，培养室温度26～28℃，体外诱导获得管胞。

所述的苏丹草体外诱导管胞分化的方法，进一步优选包含以下步骤：

a.种子的消毒

b.愈伤组织的诱导：将经消毒处理的种子接种于愈伤组织诱导培养基中，放入培养室暗培养， 培养室温度为26～28℃，35～40d后获得淡黄色、颗粒状愈伤组织；

c.愈伤组织的继代培养：从愈伤组织诱导培养基上选用淡黄色、颗粒状胚性愈伤组织，接种到 继代培养基中暗培养21～28d，培养室温度26～28℃；

d.愈伤组织的管胞诱导：取生长旺盛的淡黄色较松散的颗粒状胚性愈伤组织，接种到愈伤组织 管胞诱导培养基中，每天光照16H或24h，培养12～21d，培养室温度26～28℃；

其中，所述的愈伤组织诱导培养基为：基本培养基附加2,4-D3mg/L、KT0.2mg/L和水 解酪蛋白酶1g/L；

所述的愈伤组织继代培养基为：基本培养基附加2,4-D2mg/L和0.05mg/L6-BA；

所述的管胞诱导培养基为：基本培养基附加3.0g/L活性炭；

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8～5.9。

所述的苏丹草体外诱导管胞分化的方法，步骤a所述的种子消毒方法优选为：选择生长健 壮、外形饱满的苏丹草种子，在超净工作台上，放入10ml无菌离心管中用70％酒精浸泡处理 1min，轻轻摇动，倒掉70％酒精后加入50％次氯酸钠溶液，盖紧无菌离心管，固定在振荡器上 振荡处理30min后，在超净工作台上用无菌水冲洗消毒种子8～10次。

有益效果

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

本发明以苏丹草种子组织培养诱导获得的胚性愈伤组织为外植体，通过在不含激素的继代 培养基中添加1.0～9.0g/L活性碳，每日光照16h或24h条件下体外培养诱导管胞分化，管胞 分化率达31.01～47.23％，是国内外率先建立的苏丹草胚性愈伤组织体外培养诱导管胞分化的 方法，为开展苏丹草次生细胞壁木质素调控机制研究、高消化率和乙醇高转化效率定向育种提 供了重要的技术支撑。

附图说明

图1种子诱导的愈伤组织

图2无管胞分化的细胞

图3苏丹草胚性愈伤诱导培养获得的管胞，其中A图为10×40倍物镜下的管胞，B图为10× 100倍物镜下的管胞

图4活性炭含量3g/L的管胞诱导培养基中苏丹草管胞分化率随培养天数的变化

具体实施方式

实施例1

(1)材料

选用苏丹草自交系2098，于1996年引自日本；拟高粱系野生种质，1998年从福建农学院 引进；2002年以苏丹草为母本、拟高粱为父本远缘杂交获得多年生苏丹草(公知公用，钟小 仙，顾洪如，丁成龙，等.苏丹草与拟高粱远缘杂交初报.草地学报，2002，10(1)：24-27.)。

(2)试验方法

a.种子消毒

选择生长健壮、外形饱满、可多年生的苏丹草种子，在超净工作台上，放入10ml无菌 离心管中用70％酒精浸泡处理1min，轻轻摇动，倒掉70％酒精后加入50％次氯酸钠溶液，盖紧 无菌离心管，固定在振荡器上振荡处理30min后，在超净工作台上用无菌水冲洗消毒种子10 次；

b.愈伤组织的诱导

将经上述处理的种子接种于诱导培养基中，放入培养室暗培养，培养室温度为26～28℃， 诱导培养基配方为：MS大量元素、MS微量元素、B5有机成分、蔗糖30g/L、琼脂条8g/L为基 本培养基，附加2,4-D3mg/L、KT0.2mg/L和水解酪蛋白酶1g/L，培养基pH值至5.8-5.9， 35d后获得淡黄色、颗粒状愈伤组织(图1)；

c.胚性愈伤组织的继代培养

从诱导培养基上选用结构致密的愈伤组织块上自动脱落的淡黄色、颗粒状胚性愈伤组织， 接种到继代培养基中，暗培养25d，继代培养基配方为：MS大量元素、MS微量元素、B5有机 成分、蔗糖30g/L、琼脂条8g/L为基本培养基，附加2,4-D2mg/L和0.05mg/L6-BA，培养 基pH值至5.9，培养室温度26～28℃；

d.胚性愈伤组织的管胞分化

取继代暗培养25d、生长旺盛的淡黄色颗粒状胚性愈伤组织，接种到愈伤组织管胞诱导培 养基，暗培养或每天光照16h或24h，培养5～21d，培养基配方为：MS大量元素、MS微量元素、 B5有机成分、蔗糖30g/L、琼脂条8g/L为基本培养基，附加1.0～9.0g/L活性炭，培养基pH 值至5.9，培养室温度26～28℃。

e.管胞分化率的测定

每个不同活性炭浓度处理随机选取5块愈伤，共3次重复，用刀片切取愈伤组织块表面部 分，用10％的NaOH浸泡过夜后用蒸馏水冲洗3次，用0.01％番红染液染色30min，光学显微镜 明场下进行图像采集，每块愈伤随机挑选10个图像进行细胞计数和管胞分化率的测定，管胞 分化率计算公式如下：

管胞分化率＝图像中管胞总数/图像中细胞总数×100％。

(3)试验结果

a.不同光照培养时间对胚性愈伤组织管胞分化率的影响

当继代培养25d的胚性愈伤组织接种到不含任何激素的管胞诱导培养基中，20d时取样 观察结果表明，黑暗条件下培养的愈伤组织无任何管胞产生，每天光照16h和24h条件下培养 的愈伤组织管胞分化率分别为20.59％和20.81％，每天光照16h和24h培养条件下管胞分化率 无显著差异。

在管胞诱导培养基中添加1g/L的活性炭，黑暗、16h/d和24h/d光照条件下培养，苏 丹草胚性愈伤组织均能分化管胞，管胞分化率分别为19.56％、31.01％、30.38％，管胞分化率 黑暗培养显著低于每天光照16h和24h培养，但每天光照16h与每天光照24h培养条件下管胞 分化率无显著差异。

b.不同活性炭浓度对胚性愈伤组织管胞分化率的影响

黑暗培养条件下，在活性炭浓度为1.0、3.0、5.0、7.0和9.0g/L的管胞诱导培养基中， 胚性愈伤组织培养20d时取样观察，结果表明，管胞分化率分别为19.68％、28.75％、21.89％、 21.83％、20.60％，除活性炭浓度为5g/L、7g/L的两处理组间管胞分化率无显著差异外，其他 各活性炭浓度处理间管胞分化率均有显著差异，其中以活性炭浓度为3.0g/L的培养基中管胞 分化率显著最高。

光照16h/d条件下培养，在活性炭浓度为1.0、3.0、5.0、7.0和9.0g/L管胞诱导培养基 中，胚性愈伤组织培养20d时取样观察结果表明，管胞分化率分别为31.32％、47.05％、32.68％、 28.61％、24.96％，不同处理组间差异均达到显著水平，且以培养基中含3g/L活性炭的培养基 中，管胞分化率极显著高于其它处理。

c.培养天数对胚性愈伤组织管胞分化率的影响

含3g/L活性炭的管胞诱导培养基中、每天光照16h条件下培养胚性愈伤组织，培养1～4d 的苏丹草胚性愈伤组织，颜色为淡黄色，与继代培养初始愈伤相比没有发生明显的外形变化； 培养5d的苏丹草愈伤组织，颜色绝大部分为淡黄色，但愈伤组织表面开始出现褐色斑点；培 养10d的苏丹草愈伤组织，表面出现大面积褐色、水渍状愈伤；培养20d的苏丹草愈伤组织， 表面绝大部分呈现褐色。管胞分化率变化曲线显示，在胚性愈伤组织培养前4d，苏丹草愈伤 组织中未发现管胞，第5d开始出现管胞，随着诱导时间的延长，管胞的分化率迅速增加，至 18～21d管胞分化率达到稳定，胚性愈伤组织培养5、6、9、12、15、18和21d的管胞分化率 分别为5.36％、18.40％、27.20％、41.77％、42.22％、47.17％和47.23％，除培养18d和21d的管 胞分化率无显著差异外，其它处理间均达到极显著差异，在活性炭含量为3g/L的管胞诱导培 养基中，培养18d和21d的胚性愈伤组织管胞分化率平均值为47.20％(图4)。