百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针

摘要

本发明涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针，所述蛋白质为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供相应的核酸序列，以及检测探针；步骤如下：通过RACE技术分别扩增得到APGA20ox基因的3′和5′端，进行基因全长序列拼接和同源性分析，通过时空表达模式分析以及外源调控物质处理，分析APGA20ox基因表达差异情况进而验证基因的功能。为了验证本发明涉及的APGA20ox的功能，通过RNAi技术转化百子莲胚性愈伤组织，APGA20ox基因沉默可以得到矮化的百子莲植株，更加确切表明本发明涉及的APGA20ox核苷酸序列在百子莲株高改良中具有特异的效果。本发明可调控百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因的时空表达特性，进而能够改变植物株高发育。

说明书

技术领域

本发明涉及百子莲赤霉素合成途径中的关键酶及其编码基因和探针，具体涉及一种 百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白及其编码基因和探针。

背景技术

观赏植物的株型是决定商品价值和观赏价值的重要因素之一。改变和定向调控株 型，创造矮化紧凑的株型，可以增加观赏植物的商品价值和观赏价值，通过增加株高可 以获得良好的切花性状。赤霉素(Gibberellin,GA)是决定植物茎的伸长的最重要的 植物激素，赤霉素的合成和代谢直接调控植物的株型发育。赤霉素种类多样，生物合成 途径十分复杂，仅有少数种类的GAs具有生物活性，中间产物大多不具备生物活性，在 转化为活性GAs的过程中，必须有GAs合成的双加氧酶类参与，其中GA20ox双加氧酶 参与GAs生物合成反应的多个步骤，具有重要的作用，GA20ox的突变体由于GA生物合 成途径受阻，多表现为矮化性状。一些研究表明，通过调控GA20ox的表达可以显著改 变植物株高，提高农作物抗性和产量，提高观赏植物商品价值。

GA20ox在一些植物中已被分离，如：杨树(Populus tomentosa)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、水稻(Oryza sativa)、 矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)、大麦(Hordeum vulgare)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、 玉米(Zea mays)等，但对于球根花卉百子莲(Agapanthus praecox)，APGA20ox基因 的克隆、表达模式及APGA20ox蛋白编码序列目前尚不清楚。在本发明被公布之前，未 有任何与本专利申请中所提及的百子莲APGA20ox蛋白序列相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于填补赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因家族成员的克隆、表达 以及赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白的空白，提供了一种赤霉素合成双加氧酶蛋白 APGA20ox，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探 针；本发明公开了百子莲APGA20ox蛋白及其核酸序列在百子莲不同器官、不同发育阶 段的表达模式，为今后利用基因工程技术对APGA20ox基因表达的时空特性进行调控， 从而改变株高、创造合理株型提供了理论依据，具有很大的应用价值。

一方面，本发明提供了具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性的蛋白质，所述蛋白质 是由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲赤霉素合成双加氧酶活性 的蛋白质。该多肽在百子莲发育的不同阶段，不同器官内的有无及活性大小存在较大差 异。

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性 质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：(a)碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1086位所示； 或(b)与SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；或(c) 能与SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.1第1～1086位所示的核酸序列中1～90 个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的 序列。

此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序 列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子莲 APGA20ox相关的核酸分子。

本发明还涉及一种百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码基因的应用，其 所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1第1～1086位所示，所示的应用是：通过基因工程 对基因表达进行调控进而改变植株株高，获得新的百子莲株型。

优选地，所述应用具体为：通过常规手段提高APGA20ox蛋白编码基因的表达量， 使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。

进一步优选地，所述应用具体为：使用GA处理百子莲，使得植株APGA20ox基因表 达量提高，进而使得百子莲的株高增加，获得新的百子莲株型。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态 下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分 分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白编码序列”指编码 具有百子莲APGA20ox蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示的第1～1086 位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示的第1～1086位 核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序 列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1所示的第1～1086位核苷酸序列同源性 低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然百子莲APGA20ox蛋白的相同功能、SEQ ID NO.1所示序列 的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白”指具有百子莲赤 霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白活性的SEQ ID NO.2所示序列的多肽。该术语还包括 具有与天然百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的 变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/ 或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末 端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百 子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的百子莲APGA20ox蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位 变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百子莲APGA20ox相关 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲APGA20ox蛋白的抗血清获得的多肽或蛋 白。

在本发明中，“百子莲APGA20ox保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2所示的氨基 酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些 保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn

Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

发明还包括百子莲APGA20ox蛋白或多肽的类似物。这些类似物与百子莲APGA20ox 相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种 技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已 知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸) 的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应 理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰 化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳 动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷 酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解 性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析百子莲APGA20ox基因产物的表达 模式，即分析百子莲APGA20ox基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在百子莲APGA20ox相关核苷酸序列的检测方法，包括用 上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产 物，其中PCR扩增引物对应于百子莲APGA20ox相关核苷酸编码序列，并可位于该编码 序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的百子莲APGA20ox核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源 性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选百子莲APGA20ox相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与百子莲APGA20ox相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选百子莲cDNA文 库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对百子莲APGA20ox相关的全部或部分做放射活 性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自百子莲的文库。构建来自感兴趣的细胞 或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文 库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法 可以识别与百子莲APGA20ox相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的百子莲APGA20ox相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、 重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序 列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知 的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要 进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有 关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加 以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco； Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用 手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City， CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接 以产生全长的分子。

利用本发明的百子莲APGA20ox蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与百子莲 APGA20ox蛋白相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

百子莲为世界著名切花之一，观赏价值极高，应用广泛，人们对高品质观赏价值的 新品种的需求也越来越大。因此，本发明具有很大的应用价值。本发明首次克隆百子莲 植物体内赤霉素生物合成途径中的关键酶百子莲APGA20ox蛋白的编码序列，并采用荧 光实时定量PCR的方法分析APGA20ox基因的表达模式，为今后利用基因工程技术调控 APGA20ox基因的时空表达，从而改变株高、创造新株型提供了理论依据，具有很大的应 用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特 征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的百子莲APGA20ox基因与簇毛麦赤霉素合成双加氧酶基因mRNA的核 苷酸序列的同源比较(GAP)结果；

图2为本发明的百子莲APGA20ox蛋白与簇毛麦赤霉素合成双加氧酶的氨基酸序列 的同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；

图3为本发明的百子莲APGA20ox蛋白表达量与百子莲株高调控之间的关系；

图4为通过RNAi技术沉默APGA20ox可以得到矮化的百子莲植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor  Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox基因的克隆

1.植物材料的获得

百子莲于2000年由南非引入我国，并在上海进行引种试验。孙博在2011年发表 的硕士学位论文《百子莲盆栽矮化的研究》一文中，对百子莲的基本生物学特性，引种 历史等进行了较为详细的介绍。本实施例涉及的百子莲材料可以通过公开的渠道获得。 愈伤组织、胚性愈伤组织、体胚、幼苗由组培室培育并保存，用于提取RNA。将健康、 大小一致的百子莲植株于温室栽植并进行常规管理，待花朵花蕾形成，花瓣即将开裂时 采集各个器官和组织，用于提取RNA。

2.RNA的抽提

用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA(RNA prep pure Plant  Kit：上海莱枫生物科技有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光 光度计(Thermo Scientific NANODROP1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度 及浓度。

3.基因的全长克隆

根据GA20ox基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法 (SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit：Clontech Laboratories,Inc.)进行cDNA 全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR获得基因中间片段

将提取RNA进行反转录(Prime ScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝 生物工程(大连)有限公司)；

以第一链cDNA为模板，利用引物：

F1：5′-CTTGAGCCTGGAGGATGTATT-3′；(SEQ ID NO.3)

和R1：5′-AACCTCATCGTCGAATCGTTC-3′。(SEQ ID NO.4)

进行PCR，扩增得到467bp片段，回收并连接到pMD18-T Simple vector载体上， 用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA) 的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果通过在NCBI 网站进行BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(Genebank)， 知其核酸序列及编码蛋白与已知的簇毛麦属赤霉素合成双加氧酶基因GA20ox的同源性 很高，故初步认为它是一个赤霉素合成双加氧酶基因。

(2)3′RACE

以3′RACE ready cDNA为模板，二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。

第一轮：UPM+APGA20ox3-1：

5′-CGACGATGAGGTTGAACTATTATCCGCCT-3′；(SEQ ID NO.5)

第二轮：NUP+APGA20ox3-2：

5′-CGGAGATACTTTCACGGCACTGTCTAATG-3′。(SEQ ID NO.6)

得到APGA20ox3′末端序列(444bp)，回收，连接到pMD18-T Simple vector载 体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer， USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果通过在 NCBI网站进行BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库 (Genebank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的簇毛麦属赤霉素合成双加氧酶基因的 同源性很高。

(3)5′RACE

以5′RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增。第 一轮：UPM+APGA20ox5-1：

5′-AGGGTGCCTTGAGCCTGGAGGATGTA-3′；(SEQ ID NO.7)

第二轮：NUP+APGA20ox5-2：

5′-AGGCGGATAATAGTTCAACCTCATCGTCG-3′。(SEQ ID NO.8)

得到APGA20ox5′末端序列(769bp)，回收连接，用与3′RACE相同的方法进行 测序。

将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分 析，结果证明从百子莲中新得到的APGA20ox基因的确为一个与赤霉素生物合成酶相关 的基因。

将测序结果结合NCBI的ORF Fingding(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf) 网页预测，发现了百子莲APGA20ox基因的起始密码子与终止密码子。根据获得的序列， 分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物：

ORF-F：5′-ATGGTGCTTCAACCCTTCGTGTTCG-3′；(SEQ ID NO.9)

ORF-R：5′-TCATTTGTGCAGGGTGCCTTGAGCCT-3′。(SEQ ID NO.10)

以百子莲cDNA为模板进行PCR，扩增得到1086bp百子莲赤霉素合成双加氧酶GA20ox 蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.1)。

实施例2、百子莲APGA20ox基因的序列信息与同源性分析

本发明新的百子莲APGA20ox全长CDS开放读框序列为1086bp，详细序列见SEQ ID  NO.1第一条序列。根据CDS开放读码框序列推导出百子莲APGA20ox的氨基酸序列，共 361个氨基酸残基，分子量为41050.8道尔顿，等电点(pI)为6.73。详细序列见SEQ ID  NO.2所示序列；

将百子莲APGA20ox的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序 在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS  translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同 源性检索，结果发现它与簇毛麦GA20ox基因(EU142949.1)在核苷酸水平上具有67％ 的相同性。如图1所示(Query：百子莲赤霉素合成双加氧酶APGA20ox的编码基因序列； Sbjct：簇毛麦赤霉素合成双加氧酶的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它与簇毛麦GA20ox 基因(GenBank登录号ACU40937.1)也有69％的一致性，如图2所示(Query：百子莲 赤霉素合成双加氧酶APGA20ox的氨基酸序列；Sbjct：簇毛麦赤霉素合成双加氧酶的氨 基酸序列)。由此可见，百子莲APGA20ox基因与簇毛麦GA20ox基因无论从核酸还是蛋 白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、百子莲APGA20ox基因在不同发育阶段以及在百子莲不同组织中的表达差异 性

1.材料的获得：在百子莲体胚发育的不同阶段(愈伤组织；肧性愈伤组织；体胚 分化；幼苗形成)，利用实验室组培材料为研究对象，同时在实验温室取成年植株的主 根、侧根、茎、花葶、老叶、新叶、小花梗、花瓣、花丝、花药、子房、种子，将样品 分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。将GA和 多效唑(Paclobutrazol，PBZ)喷施处理过的百子莲植株叶片取样用于RNA提取。

2.RNA的提取：利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”(RNA prep pure Plant  Kit：上海莱枫生物科技有限公司)提取百子莲不同发育阶段以及不同组织中的RNA。

3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％； 0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第 二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以 及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

4.cDNA的获得：以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

5.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达 量。根据已经获得的百子莲APGA20ox基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中APGA20ox基因定量分析的特异性引物，

GA20ox-F：5′-GGTCTGCTCTACTTGAAT-3′；(SEQ ID NO.11)

GA20ox-R：5′-GAAGGAACTACAGGAGAA-3′。(SEQ ID NO.12)

内参基因为Actin，其引物为

Actin-F：5′-CAGTGTCTGGATTGGAGG-3′；(SEQ ID NO.13)

Actin-R：5′-TAGAAGCACTTCCTGTG-3′。(SEQ ID NO.14)

6.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供)将标 准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内 参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。 分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引 物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板， 分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反 应在BIO-RAD Chromo4实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，94℃ 变性20s，接着40个循环：94℃15s；56℃15s；72℃25s。每次扩增完成后，均做溶 解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

8.采用2^-△△Ct法作相对定量分析。结果表明百子莲APGA20ox基因的表达水平在体 胚发育过程中逐渐上升，幼苗的表达量最高，愈伤组织时期的表达量最低，其中最高表 达量为最低表达量的4.15倍。说明该基因的表达与百子莲生长过程，特别是与伸长生 长有明显的相关性，是由于APGA20ox参与的GA合成引起植物的伸长生长。APGA20ox 基因在主根、侧根、茎、花葶、老叶、新叶、小花梗、花瓣、花丝、花药、子房、种子 中均有表达，在根中表达量最高，花瓣中表达量最低。侧根比主根表达量高，新叶比老 叶表达量高，幼嫩的种子表达量较高。这说明APGA20ox基因的表达具有明显的空间差 异性，其中生长旺盛的部位表达量较高，表明该基因主要参与了植物的生长和发育。

如图3所示，通过GA处理的植株APGA20ox基因在叶片的表达量比CK高了492.96％， 同时株高比CK增加了32.53％，表明GA处理能够显著增加活性GA的含量,加强了GA信 号转导途径下游相关基因的表达,增加了百子莲植株的株高生长，而APGA20ox基因正是 调控百子莲GA生物合成的最重要的氧化酶类,其通过调控活性GA的生物合成来调控植 物株高的生长。而经过PBZ处理由于GA合成受阻，APGA20ox的表达量在反馈调节机制 下与CK相比降低了28.98％，同时植株的高度比CK减少了28.63％，以上结果表明 APGA20ox基因在百子莲生长过程中对植株发育具有重要的调控作用，尤其是对分裂旺盛 的部位和株高作用更为显著，其作用机制主要是通过调控具有生物活性的GA的生物合 成，该基因表达产物对定向调控植物株高具有应用价值。

实施例4、百子莲APGA20ox基因通过RNAi技术沉默可得到矮化的百子莲植株

1.百子莲于2000年由南非引入我国，并在上海进行引种试验。孙博在2011年发表 的硕士学位论文《百子莲盆栽矮化的研究》一文中，对百子莲的基本生物学特性，引种 历史等进行了较为详细的介绍。本实施例涉及的百子莲材料可以通过公开的渠道获得。 肧性愈伤组织由上海交通大学园林植物种质资源实验室继代保存。

2.植物RNAi表达载体的构建：用于RNAi实验的pTCK303载体可从公开渠道获得， 设计特异性引物扩增特异性片段构建载体用于干扰百子莲APGA20ox基因的表达。

根据APGA20ox序列设计特异引物，通过PCR扩增目的片断。引物序列内分别含有 BamH I、Kpn I、Spe I、Sac I酶切位点，用于构建表达载体。引物序列为：

APGA20oxRNAi-F:5′-GGGGTACCACTAGTCAAGCAAGTAGGCGAAGC-3′；(SEQ ID NO.15)

APGA20oxRNAi-R:5′-CGGGATCCGAGCTCGAAGAGTAACGGAACGAGA-3′。(SEQ ID NO.16) 通过高保真酶扩增APGA20ox基因片段，前后分别引入BamH I、Kpn I、Spe I、Sac I 酶切位点。将得到的APGA20ox基因片段和和pTCK303载体同时进行Spe I、Sac I双酶 切，将酶切产物连接转化，挑取单克隆，提取质粒做酶切验证，此后将APGA20ox基因 片段和和验证正确的pTCK303重组载体分别进行BamH I和Kpn I双酶切后连接，转化 后挑取单克隆，提取质粒做酶切验证，构建好的APGA20oxRNAi载体具有一正一反的干 扰片段，通过上海invitrogen公司测序确认干扰片段插入载体的正确性。

3.根癌农杆菌介导APGA20oxRNAi遗传转化百子莲胚性愈伤组织获得 APGA20oxRNAi植株

APGA20oxRNAi载体转入根癌农杆菌(EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以 从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1)，并进行PCR验证。

取百子莲胚性愈伤组织，继代20天后，加入活化好的所述含APGA20oxRNAi植物表 达载体的根癌农杆菌EHA105的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，转到共培养培 养基(1/2MS+AS100μmol/L)中28℃暗培养3天。以不带有目的基因的根癌农杆菌 的1/2MS液体培养基悬液的胚性愈伤组织为对照。

将所述的共培养3天的百子莲胚性愈伤组织转入到筛选培养基(MS+PIC1.5mg/L +Hyg50mg/L+Cb400mg/L)上于25℃暗培养，每三周继代培养一次，经过4个月 继代后即可获得Hyg抗性的胚性愈伤组织。将抗性胚性愈伤组织转入诱导成苗培养基 (1/2MS+Cb200mg/L)上培养至生根，从而获得Hyg抗性再生百子莲植株。

4.APGA20oxRNAi遗传转化百子莲植株的检测

以实施例3中的相同方法检测APGA20ox基因的表达量差异。结果表明，通过RNAi 技术干扰了百子莲遗传转化再生植株APGA20ox的表达，APGA20ox的表达量仅为对照的 6％，降低了94％，而RNAi干扰后植株的株高也得到了显著的降低，如图4所示，降低了 56％。通过RNAi技术验证了百子莲APGA20ox基因的功能，即该基因的转录后沉默可以 得到矮化的百子莲植株，这一结果对于培育百子莲的矮化品种具有重要意义，本发明 APGA20ox基因的核苷酸序列在百子莲矮化育种中具有特定的作用。

现有技术中也有披露过其他作物中存在GA20ox双加氧酶，本领域人员知晓，GA20ox 双加氧酶参与赤霉素的合成，进而控制株高，但是GA20ox双加氧酶与株高之间的作用 关系，在不同的作物中会有不同的表现，有的表现为正相关，有的表现为负相关，因而 难以进行类推；

其次，在作物体内，当采用基因工程手段时控制株高时，具体是使用基因工程手段 对相应的GA20ox核苷酸序列进行操作，如过表达或者干扰，或者敲除等，而非是对 GA20ox双加氧酶这个蛋白本身进行操作；进而，即使现有技术中披露某种作物中的 GA20ox双加氧酶与本发明的蛋白质具有一定的同源性，也不代表给出了本发明的任何技 术启示，因为编码氨基酸的密码子具有简并性，两个蛋白具有一定的同源性，但是具体 到其实际对应的核苷酸序列，两个核苷酸序列的同源性会相对非常低；所以，仅发现与 本发明的蛋白具有一定同源的氨基酸序列，是完全无法推知本发明的技术方案；

同时，本发明的发明人发现，对于百子莲，必须要作用本发明具体发现的核苷酸序 列，才会产生调控百子莲株高的效果，即必须对如SEQ ID NO.1第1～1086位所示的碱 基序列进行相关的操作，才能调控株高，百子莲APGA20ox基因通过RNAi技术沉默可得 到矮化的百子莲植株。而对于其他序列，即使与现有技术中其他作物中的GA20ox基因 具有同源性，在百子莲中，对序列进行基因工程操作，也不一定会起到改变株高的效果。

综上，本发明的技术方案是非显而易见的。以上对本发明的具体实施例进行了描 述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在 权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。