一类突变的具有高耐碱特性的蛋白A及其应用

摘要

本发明属于蛋白工程领域，涉及一类突变的具有高耐碱特性的蛋白A及其应用。本发明蛋白A能牢固结合到免疫球蛋白分子除互补决定区之外其他区域，可以作为偶联于固相载体的配体用于分离免疫球蛋白。这类蛋白A能在PH13‐14强碱环境中保持化学稳定性，作为层析配体从而可以耐受苛刻的原位清洗条件。本发明也涉及使用蛋白Ａ配体分离纯化免疫球蛋白和用碱再生的过程。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白工程领域，涉及一类突变的具有高耐碱特性的蛋白A及其应用。

背景技术

生物技术是当今世界高技术发展最快的领域之一。作为生物技术领域之一的抗体药物， 近些年，在不断地提高患者健康水平和生活质量的同时，也取得了瞩目的市场业绩。另外， 新药研发不断增加投入的同时，创新药物却在明显减少，且目前众多小分子药物还面临着专 利悬崖的威胁。所以，为了寻求新的增长点，众多制药企业尤其是生物技术制药公司，逐渐 进入抗体药物研发领域。目前，抗体药物在基础生物医学研究、疾病(如癌症、器官移植排 斥、自身免疫性疾病等)的诊断和治疗方面已经被广泛应用。

近年来随着治疗性药用抗体药物在医疗领域大量出现，其生产工艺也开始受到人们的重 视。对于用于药物和诊断试剂的抗体药物的大规模经济生产，一般而言，是通过细胞培养在 细胞内或通过分泌进入周围的培养基中生产目标抗体。由于培养细胞的过程需要在培养基中 加入糖，氨基酸，生长因子，因此必须将抗体从培养基和其他细胞组分中分离达到足够的纯 度，才可以用作人治疗剂。现在最普遍采用的抗体纯化方式是亲和层析，其优势在于简单快 速选择性强，早期先进行亲和纯化，可以明显减少后续纯化的步骤。在现代工业中保持低的 生产成本也是生产工艺中很重要的要求，如果生产中所需的纯化层析介质可以反复使用，可 以明显降低抗体的生产成本。但是，由于层析介质每次纯化抗体都会留下未洗脱的蛋白，蛋 白聚集体甚至残留对人体有害的物质，例如病毒，内毒素。所以介质在重新使用时必须进行 清洁，现在最有效的恢复层析介质的清洁方式是被称作原位清洁的碱性方法，其标准流程包 括用0.5M NaOH处理纯化介质，这种苛刻的方式可以有效地去除杂质，但是很可能损害纯化 介质。因此本发明涉及的耐碱的并可以结合免疫球蛋白的蛋白Ａ分子可以作为亲和介质上很 好的配体，用于纯化抗体药物，其纯化介质也可以用原位清洁的碱性方法对使用后的纯化介 质进行再生。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一类突变的具有高耐碱特性的蛋白A。

本发明的另一目的是提供该蛋白A的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一类基因突变的蛋白Ａ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或者与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在与免疫球蛋白结合区域有99%以上同源性的能够 结合免疫球蛋白的所有氨基酸序列，其中，所述的与免疫球蛋白结合区域为第7～第54个氨 基酸残基。

编码所述的蛋白Ａ的核酸。

本发明涉及的蛋白Ａ，实质上是一类可以结合免疫球蛋白的分子，这类分子可以牢固结 合免疫球蛋白上互补决定区之外其他区域，同时可以耐受PH13‐14的强碱环境。这类蛋白Ａ 的结合免疫球蛋白的区域的蛋白构象主要是有3股α螺旋组成，并折叠成一种三螺旋束结构。 其能通过α螺旋1和2表面氨基酸残基结免疫球蛋白的Fc区域，或通过α螺旋2和3表面 残基结合免疫球蛋白Fab上的非互补决定区。同时α螺旋1，2，3表面疏水性残基会在螺旋 束的中心形成一个疏水核心，可以将α螺旋1，2，3紧密的结合在一起，维持蛋白稳定的结 构。与其他不耐碱蛋白不同的是当这类蛋白Ａ被放置于PH13‐14的碱性环境中，虽然维持蛋 白稳定结构的氢键消失，α螺旋1、2、3会舒展伸张，但是强的疏水力仍能使α螺旋1、2、 3紧密结合并保证其相对位置没有显著变化。当这类蛋白Ａ重新被放置于PH7‐8中性环境中， α螺旋1、2、3间氢键恢复，因此整体构象可以恢复至放置于碱性环境之前，而其他不耐碱 蛋白由于缺乏维持蛋白结构稳定的疏水核心，在被放置于PH13‐14的碱性环境中后，蛋白结 构会被彻底破坏，当重新被放置于PH7‐8中性环境中，蛋白整体构象无法恢复至放置于碱性 环境之前。将这种有耐碱特质的蛋白A及其多聚体偶联到固相载体上可以用来分离纯化免疫 球蛋白分子或者将他们偶联上标记物可以用来检测免疫球蛋白分子，同时如果将其作为层析 介质的配体，可以用原位碱清洁的方式对层析介质实现再生。

本发明蛋白Ａ单聚体分子量在6KD左右，由58个氨基酸组成，可以通过多肽化学合成 或是细胞表达的方式获得。如果采用细胞表达的方式，必须首先构建携带有编码蛋白氨基酸 序列的基因的细胞株。因此需要按照以下的流程进行：首先通过基因合成的方式获取编码蛋 白Ａ氨基酸序列的基因，下一步，将编码蛋白Ａ氨基酸序列的基因重组到表达载体中，此时 可以根据需要在载体中添加纯化标签筛选标签或是指示性标签，紧接着将表达载体稳定地转 入合适的细胞中，完成整个可以生产这类蛋白Ａ的表达系统。所需要的具有结合免疫球蛋白 分子的蛋白Ａ（包括单聚体或多聚体）可以从培养基或者细胞中得到。必须注意的是蛋白Ａ 在细胞中的表达需要受到紧密的控制，因此选择用于表达蛋白Ａ的载体非常重要，应该具有 以下几个特性：1.表达载体含有启动子或初始转录位点，2表达载体含有操纵子用来开关基 因的表达，3.表达载体含有核糖体结合位点，4.表达载体含有转录和翻译的终止位点，可 以提高转录和翻译产物的稳定性。因此可以推荐表达蛋白Ａ的载体有PET(Novagen), PQE30(Qiagen),PGS21a(genscript)，pGAPZαA（Invitrogen）等，对应的宿主细胞的选择有大 肠杆菌基因工程菌和毕赤巴斯德酵母，可以在宿主的细胞内，细胞外或细胞膜上生成这类蛋 白Ａ。

这类蛋白A可以根据需要，通过利用其物理性质，化学性质等的各种分离操作进行分离 纯化。具体而言，例如通常的蛋白沉淀剂处理（盐析法），离心分离，渗透压破碎法，超声 波破碎，超滤，凝胶过滤，以及吸附色谱，离子交换色谱，亲和色谱，高速液相色谱等各种 液相色谱，透析法及这些方法的组合等。此外，通过表达这类蛋白与亲和标记融合的蛋白质， 利用该标记可以进行亲和纯化。此处所述的亲和标记，例如多聚组氨酸标记及FLAG标记。 利用这些标记可以进行这类蛋白Ａ的纯化。

这类蛋白Ａ结合免疫球蛋白的活性可以通过ELISA实验测定。例如将这类蛋白Ａ固定在 固相载体上，然后加入酶标记的免疫球蛋白使其吸附在蛋白Ａ上，用洗涤的方法使固相载体 上形成的免疫球蛋白和蛋白Ａ的复合体与液体中其他物质分开，这样固相载体上的蛋白Ａ与 免疫球蛋白形成的复合体的量与酶的量呈一比一的比例。加入酶的反应底物后，底物被酶催 化成为有色产物，这样蛋白Ａ结合的免疫球蛋白的量可以根据呈色的深浅进行定性和定量分 析。

这类蛋白Ａ的碱化学稳定性也可以被本领域的技术人员很容易的证实。例如将这类蛋白 Ａ先浸泡在0.5M浓度的NaOH中持续60小时，按照以上所述的ELISA实验测定其结合免疫 球蛋白的活性，如何仍然可以很好的保持结合免疫球蛋白的活性，那么则证明这类蛋白Ａ在 强碱环境中是稳定的。再例如利用存在于这类蛋白Ａ中的氨基或羧基基团，通过双环氧化物， 表氯醇，溴化氰，N‐羟基琥珀酰胺等偶联剂，将这类蛋白Ａ偶联到固相载体上（sepharose4B） 并制成层析柱，然后过量加载免疫球蛋白分子，接着用PH8.0的磷酸盐缓冲液洗涤，然后用 PH.3.0的甘氨酸缓冲液洗脱，之后测定洗脱的免疫球蛋白的量来测定柱的总容量。在每一个 循环之间，用0.5M NaOH组成的原位清洁的碱性方法处理来处理柱，在100个循环之后，如 果柱的总容量没有降低，那么则证明这类蛋白A在强碱环境下的化学性质非常稳定，非常适 合作为免疫球蛋白亲和纯化的配体。

一种包含所述的蛋白A的多聚体，包含两个或两个以上重复单元。

上述论述的蛋白Ａ都是单聚体，然而这种蛋白可以结合为多聚体蛋白，诸如二聚体，三 聚体，四聚体等等。因此一个属于本发明的蛋白Ａ与自身或与本发明中其他蛋白Ａ形成的多 聚体，同样属于本发明的另一个方面。本发明的多聚体包括优选4‐10个氨基酸的一段氨基 酸序列连接的单体单元。这种连接不破坏蛋白Ａ的空间构象，此外在碱性环境中同样充分稳 定，不损害蛋白Ａ的特性。在目前的实施方案中，多聚体是蛋白Ａ的二聚体,其中连接蛋白Ａ 的长度为4个氨基酸(ADGK)。

本发明涉及编码上述蛋白Ａ或其多聚体的核酸序列。该核酸序列经过密码子优化，优化 后的核酸序列避免了稀有密码子的产生和二级结构的形成，并通过引物搭桥人工基因合成的 方式合成出来。

本发明涉及这类蛋白Ａ经N端或C端或侧链基团进行化学修饰所得到的所有能牢固结合 免疫球蛋白的蛋白衍生物。如N端氨基被乙酰化后得到N‐乙酰多肽，被脂肪酸酰化后得到 N‐脂肪酸酰化多肽。又比如C‐端羧基转化为酰胺可以得到多肽酰胺，转化为酯得到多肽酯， 转化为硫酯得到多肽硫酯。衍生化修饰对调节原有蛋白的酸碱性，稳定性，溶解性，反应活 性及生物活性具有重要作用。如果在蛋白Ａ的C末端提供一个半胱氨酸残基，蛋白Ａ可以通 过硫醚键与载体相偶联，而且这种偶联方法技术人员利用标准技术和设备很容易进行。

本发明所述的蛋白Ａ、多聚体或蛋白Ａ衍生物在分离、纯化和/或检测免疫球蛋白中的 应用。

编码本发明所述的蛋白Ａ、多聚体或蛋白Ａ衍生物的基因在分离、纯化和/或检测免疫 球蛋白中的应用。

本发明涉及这类蛋白Ａ的商业化应用，包括免疫球蛋白的纯化和免疫球蛋白的检测。 免疫球蛋白纯化方面的应用包含一种层亲和析分离的方法，其中通过吸附于如上所述蛋白Ａ 或多聚体来从复杂基质中分离至少一种靶化合物，是一种广泛使用的分离技术。具体步骤包 括让含有免疫球蛋白的样品溶液流经蛋白A层析介质。在此步骤中，溶液中的其他组分将基 本不受阻碍地通过，而免疫球蛋白被吸附到层析介质上。然后洗涤介质，例如用磷酸盐缓冲 液，来除去残留的非特异性结合的杂质，正如以上所讨论的，也可以通过利用碱性试剂的洗 涤步骤。下一步骤中，让洗脱液流经层析介质从而将吸附的免疫球蛋白洗脱下来，洗脱通 常是通过改变PH，离子强度或是添加竞争性的物质来实现的。免疫球蛋白的检测方面的应 用包含一种检测免疫球蛋白的方法，其中包括首先在蛋白Ａ上进行酶标记，化学发光标记或 是同位素标记，然后通过蛋白Ａ吸附到免疫球蛋白上，能够实现免疫球蛋白可视化分析。

有益效果：

本发明提供的蛋白A及其多聚体和衍生物能牢固结合到免疫球蛋白分子除互补决定区 之外其他区域，可以作为偶联于固相载体的配体用于分离免疫球蛋白。这类蛋白A能在 PH13‐14强碱环境中保持化学稳定性，作为层析配体从而可以耐受苛刻的原位清洗条件。本 发明蛋白A及其多聚体和衍生物能够在纯化和/或检测免疫球蛋白中应用。

附图说明

图1SDS‐PAGE检测蛋白Ａ在大肠杆菌中的表达，其中泳道M为Protein Marker(Genscript 94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道1～4分别为检测蛋白A在不同大肠杆菌转换子 中的表达。

图2SDS‐PAGE检测蛋白Ａ二聚体在大肠杆菌中的表达，其中泳道M为Protein Marker (Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道1～5分别为检测蛋白A二聚体在不 同大肠杆菌转换子中的表达。

图3SDS‐PAGE用NI柱纯化蛋白Ａ，其中泳道1为Protein Marker(Genscript94KD，66kD， 36KD，25KD，14KD)，泳道2为用洗脱缓冲液洗脱蛋白A时流出的样品。

图4SDS‐PAGE用NI柱纯化蛋白Ａ二聚体，其中泳道1为Protein Marker(Genscript94KD， 66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道2为细胞破碎液上清上Ni柱前的上样样品，泳道3为 细胞破碎液上清经过Ni柱后的流出样品，泳道4为用平衡缓冲液洗杂时流出的样品，泳道5 为用洗脱缓冲液洗脱蛋白A二聚体时流出的样品。

图5SDS‐PAGE蛋白Ａ作为亲和层析介质的配体纯化免疫球蛋白，其中泳道1为Protein Marker (Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道2为人的血清，泳道3为用以蛋白 Ａ作为亲和层析介质的配体从人的血清中纯化出的免疫球蛋白。

图6SDS‐PAGE蛋白Ａ二聚体作为亲和层析介质的配体纯化免疫球蛋白，其中泳道1为Protein Marker(Genscript220KD，150KD，100KD，75KD，50KD，35kD，25kD，15KD)，泳道 2为人的血清，泳道3为用磷酸盐缓冲液洗杂时流出的样品，泳道4为以蛋白Ａ二聚体作为 亲和层析介质的配体从人的血清中纯化出的免疫球蛋白。

图7蛋白A二聚体作为亲和层析介质的配体的耐碱性测试。

具体实施方式

实施例1含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ的编码基因的载体的构建

根据大肠杆菌密码子的偏好性以及避免mRNA编码区形成二级结构的倾向设计出编码N 端融合6个组氨酸残基蛋白Ａ的基因序列，分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；其对应 的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示，前者以下称为蛋白A1，后者称为蛋白 A2。运用基因设计软件将蛋白A1和A2的编码基因序列分解成多条相互搭桥且退火温度相差 不大的基因小片段，根据上述小片段的基因序列合成引物，分别如引物4‐1～引物4‐8 （SEQIDNO.4‐1～4‐8）和引物6‐1～引物6‐8（SEQIDNO.6‐1～6‐8），以引物4‐1～引物4‐8和引物 6‐1～引物6‐8的混合物为模版和引物，使用PBO聚合酶(genscript)，采用2720thermal cycler(Applied Biosysytems公司)，反应循环为95℃20s,55℃20s,72℃20s,共进行25个循环， 最后于72℃保温3分钟，得到PCR反应液；以此次反应液为模板，添加上述根据首尾小片 段基因序列设计的引物4‐1和引物4‐8或引物6‐1和引物6‐8作为引物，于同样的条件进行1 次PCR,得到的PCR产物用加入溴乙锭的1%琼脂糖凝胶进行电泳，通过在紫外线下观察该凝 胶研究DNA条带。从凝胶中切出扩增的片段，使用Quick Gel Extraction Kit(Genscript)按照产 品说明书进行纯化。纯化后的DNA使用Applied Biosystems公司制的DNA测序仪(3730xl 96‐capillary DNA analyzer)以及ABI PRISM Bigdye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, 并按照产品说明书进行测序。

表1PCR扩增蛋白A1和蛋白A2的引物

以测序验证后的DNA为模板，分别以引物7（SEQ ID NO.7）和引物8（SEQ ID NO.8）或 引物7（SEQ ID NO.7）和引物9（SEQ ID NO.9）为引物，通过PCR扩增蛋白Ａ1或蛋白Ａ2的 编码序列，琼脂糖电泳后进行纯化，使用CloneEZ克隆试剂盒(Genscript公司),并按照产品说 明书进行克隆,将基因序列整合到载体PET15b。整合本实施例构建的蛋白Ａ1，2基因的载体 用以下略称表示：含有SEQ ID NO.3所示的蛋白Ａ1基因的载体：PET15b‐ProteinA1；含有SEQ ID NO.5所示的蛋白Ａ2基因的载体：PET15b‐ProteinA2。

实施例2含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ二聚体的编码基因的载体的构建

根据大肠杆菌密码子的偏好性以及避免mRNA编码区形成二级结构的倾向设计出编码N 端融合6个组氨酸残基蛋白Ａ二聚体的基因序列，分别如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示； 其对应的氨基酸序列分别入SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示，前者以下称为蛋白AA1，后 者称为蛋白AA2。运用基因设计软件将基因序列分解成多条相互搭桥且退火温度相差不大的 基因小片段，根据上述小片段的基因序列合成引物，分别如引物11‐1～引物11‐12和或引物 13‐1～引物13‐12，分别以引物11‐1～引物11‐12或引物13‐1～引物13‐12的混合物为模版和引 物，使用PBO聚合酶(genscript)，采用2720thermal cycler(Applied Biosysytems公司)，反应循 环为95℃20s,55℃20s,72℃20s,共进行25个循环，最后于72℃保温3分钟，得到PCR反应 液，以次反应液为模板，添加上述根据首尾小片段基因序列设计的引物引物11‐1和引物11‐12 或引物13‐1和引物13‐12作为引物，于同样的条件进行1次PCR,得到的PCR产物用加入溴 乙锭的1%琼脂糖凝胶进行电泳，通过在紫外线下观察该凝胶研究DNA条带。从凝胶中切出 扩增的片段，使用Quick Gel Extraction Kit(Genscript)按照产品说明书进行纯化。纯化后的DNA 使用Applied Biosystems公司制的DNA测序仪(3730xl96‐capillary DNA analyzer)以及ABI PRISM Bigdye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit,并按照产品说明书进行测序。

表2PCR扩增蛋白Ａ1和蛋白A2二聚体的引物

以测序验证后的DNA为模板，以引物7（SEQ ID NO.7）和引物14（SEQ ID NO.14）或引 物7（SEQ ID NO.7）和引物15（SEQ ID NO.15）为引物，通过PCR扩增蛋白AA1，AA2二聚 体的编码序列，琼脂糖电泳后进行纯化，使用CloneEZ克隆试剂盒(Genscript公司),并按照产 品说明书进行克隆,将基因序列整合到载体PET15b。整合本实施例构建的蛋白AA1或AA2基 因的载体用以下略称表示：含有SEQ ID NO.10所示的蛋白AA1二聚体基因的载体： PET15b‐ProteinAA1；含有SEQ ID NO.12所示的蛋白AA2二聚体基因的载体： PET15b‐ProteinAA2。

实施例3含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ的表达

将含有蛋白Ａ1二聚体基因的质粒PET15b‐ProteinA1转染大肠杆菌BL21感受态细胞。将 含有PET15b‐ProteinA1质粒的大肠杆菌BL21放入培养基(1g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L NaCl 和100mg/L Ampicillin)在37℃进行培养，当大肠杆菌到达对数生长曲线时，添加0.5mM IPTG 进行诱导蛋白表达4个小时，通过离心收集诱导后的大肠杆菌。取少量菌体用高温(95℃)进 行裂解释放出全菌蛋白，将全菌蛋白进行4～20%胶浓度的SDS‐PAGE。如图1显示，蛋白Ａ在 7～8KD附近检出一个条带。

实施例4含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ二聚体的表达

将含有蛋白Ａ1二聚体基因的质粒PET15b‐ProteinAA1转染大肠杆菌BL21感受态细胞。 将含有PET15b‐ProteinAA1质粒的大肠杆菌BL21放入培养基(1g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L NaCl和100mg/L Ampicillin)在37℃进行培养，当大肠杆菌到达对数生长曲线时，添加0.5mM IPTG进行诱导蛋白表达4个小时，通过离心收集诱导后的大肠杆菌。取少量菌体用高温(95℃) 进行裂解释放出全菌蛋白，将全菌蛋白进行4～20%胶浓度的SDS‐PAGE。如图2显示，蛋白Ａ 二聚体在14～15KD附近检出一个条带。

实施例5含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ的纯化

用蒸馏水把恒流泵冲洗干净,然后把玻璃层析柱冲洗干净。向柱中加入约200ml Ni‐IDA （Genscript）装柱，待柱料全部自然沉淀下来。通过恒流泵用平衡缓冲液(20mM Tris300mM NaCl)平衡约3L，流速为5ml/min；将10g诱导后的含有蛋白Ａ1的大肠杆菌用200ml平衡缓 冲液(20mM Tris300NaCl)重悬，将细胞用超声破碎仪（宁波新芝生物有限公司JY98‐IIIDH）破 碎，将破碎液离心后的上清上样，流速为2ml/min；上样完后，用平衡缓冲液洗杂至吸光度 不变，流速5ml/min；洗杂完毕后，用Elution buffer(20mM Tris,300mM NaCl,250mM Iminazole) 开始洗脱，流速5ml/min，收集洗脱液，将其进行4～20%胶浓度的SDS‐PAGE检测。如图3 显示，蛋白Ａ经纯化后纯度达到90%以上。

实施例6含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ二聚体的纯化

用蒸馏水把恒流泵冲洗干净,然后把玻璃层析柱冲洗干净。向柱中加入约200ml Ni‐IDA （Genscript）装柱，待柱料全部自然沉淀下来。通过恒流泵用平衡缓冲液(20mM Tris300mM NaCl)平衡约3L，流速为5ml/min；将10g诱导后的含有蛋白AA1的大肠杆菌用200ml平衡缓 冲液(20mM Tris300NaCl)重悬，将细胞用超声破碎仪（宁波新芝生物有限公司JY98‐IIIDH）破 碎，将破碎液离心后的上清上样，流速为2ml/min；上样完后，用平衡缓冲液洗杂至吸光度 不变，流速5ml/min；洗杂完毕后，用Elution buffer(20mM Tris,300mM NaCl,250mM Iminazole) 开始洗脱，流速5ml/min，收集洗脱液，将其进行4～20%胶浓度的SDS‐PAGE检测。如图4 显示，蛋白Ａ二聚体经纯化后纯度达到90%以上。

实施例7将含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ或蛋白Ａ二聚体作为亲和层析介质的 配体纯化免疫球蛋白

利用蛋白A或蛋白Ａ二聚体含氮基的氨基酸，将其键合到环氧活化的琼脂糖表面，从而制备得偶 联有含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ或蛋白Ａ二聚体的琼脂糖介质。将10mg蛋白A 或蛋白Ａ二聚体通过环氧基偶联到1ml Sepharose4B(GE Healthcare)琼脂糖介质的表面,并取其中 0.5ml的偶联有含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白Ａ或蛋白Ａ二聚体的琼脂糖介质进行 检测。先用20ml双蒸水把恒流泵冲洗干净，然后把柱子冲洗干净，向柱子里加入0.5ml的 柱料，待柱料全部自然沉淀下来。通过恒流泵用10ml20mM磷酸盐缓冲液(含有0.15M的 NaCl,30mM Na₂HPO₄,10mM>2PO₄调为pH7.0)冲洗柱料,平衡柱料，流速为1ml/min。

以体积15ml浓度为5mg/ml人的血清为检测样品，以流速0.5‐1ml/min的速度上样,让 柱料吸附饱和，再用20ml20mM磷酸盐缓冲液(含有0.15M的NaCl,30mM Na₂HPO₄,10mM NaH₂PO₄调为pH7.0)洗杂,最后用0.1M>

实施例8含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白A二聚体作为亲和层析介质的配体的耐碱性 测试

用0.5ml的偶联有含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白A二聚体的琼脂糖柱子进行碱 溶液原位清洗检测。先按照实施例7的步骤进行免疫球蛋白的纯化，在免疫球蛋白被0.1M pH 3.0的甘氨酸洗脱液洗脱后，以15ml0.5M NaOH溶液为原位清洗的碱溶液，以流速1ml/min 的速度清洗层析介质，再用10ml20mM磷酸盐缓冲液(含有0.15M的NaCl,30mM Na₂HPO4,10mM>2PO4调为pH7.0)平衡柱料，完成一个碱溶液原位清洗检测的循环。在 每个循环中可以根据洗脱液中的免疫球蛋白的量确定作为亲和层析配体的蛋白A二聚体结 合免疫球蛋白的能力。

如图7显示，作为亲和层析配体的蛋白A二聚体经过100个碱溶液原位清洗检测的循环 仍然保持良好的结合免疫球蛋白的能力。