含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物及其应用

摘要

本发明涉及含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物，具有通式Y的结构。本发明在具有生物活性的环状胺连接在萘酰亚胺的4位，并保持了萘酰亚胺的亚胺位氮原子与侧链连接的三唑氮原子相隔两个碳的结构，通过三唑的链接也将含硫杂环苯并噻唑引入了分子，拓展萘酰亚胺衍生物的多样性，改善了萘酰亚胺的生物活性，提高了对DNA的识别和嵌入能力；该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞的正常生长具有较好的抑制作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物有机合成领域中的一类含苯并噻唑和三唑双杂环萘酰亚胺类化合物，其制备方法及其应用。>

背景技术

绝大多数含有萘酰亚胺母体结构的分子有荧光且化合物显示了广泛的生物活性，如作为抗癌药物，抗锥体虫剂，抗病毒，局部麻醉，止痛剂，血清素5-HT3和5-HT4抗体拮抗剂，化学传感器等。以萘酰亚胺为母体的抗癌药物如安奈菲特(Amonafide)、米托萘胺(Mitonafide)和UNBS5162等也进入不同阶段的临床试验，但氨萘非特和米托萘胺由于其毒副作用抑制了进一步研究。至1973年，等首次报道了3-硝基萘酰亚胺衍生物具有抗肿瘤活性，随后通过对萘酰亚胺母体结构不同程度的修饰，合成了许多具有抗肿瘤活性的萘酰亚胺类化合物。以“非萘并”的形式键连芳香环是对萘酰亚胺的一种新的改造策略，在一定程度上提高了萘酰亚胺的抗肿瘤活性。>

近期，Amonafide针对二次髓性白血病的治疗已进入临床III期试验，这更加鼓舞了科研人员以萘酰亚胺衍生物作为潜在抗癌药物的研究。>

苯并噻唑是双环结构，同时也是许多有生物活性的海洋和陆地天然化合物结构的一部分。由于其广泛的药理活性，以苯并噻唑为核心的是药物研发的一个重要思路。在已报导的文献中，苯并噻唑衍生物是有效的抗癌试剂，LTD4受体拮抗剂，阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白成像剂，抗惊厥剂，抗菌剂，抗糖尿病药，毒蕈碱受体拮抗剂，抗痉挛药等。2-(4-氨基苯基)苯并噻唑及其衍生物，2-(4-氨基苯基)-5-氟苯并噻唑是英国诺丁汉大学肿瘤研究所研发的，该系列药物对乳腺癌具有高选择的细胞毒性，IC₅₀值可达nM级。苯并噻唑的西弗碱也具有一定的抗肿瘤疗效，IC₅₀值可达μM级。Ott等在萘酰亚胺母体中引入巯基苯并噻唑，得到了含硫取代的系列衍生物，该系列主要与拓扑异构酶作用并且表现光毒性。>

三唑类化合物有广泛的药理活性，如抗菌、镇痛、抗炎、局部麻醉、抗病毒、抗恶性细胞增生、抗高血压、抗癌等。例如化合物E4896目前正处于临床 III期试验，可用于乳腺癌、肺癌、晚期卵巢癌、肾癌的治疗，另外对小分子肺癌活性实验结果表明：其可以减少51％的血管生成。>

发明内容

本发明根据萘酰亚胺具有多个活性位点，并且结构也易于修饰，将具有生物活性的环状胺连接在萘酰亚胺的4位，并保持了萘酰亚胺的亚胺位氮原子与侧链连接的三唑氮原子相隔两个碳的结构。此外，通过三唑的链接也将含硫杂环苯并噻唑引入了分子，继续拓展萘酰亚胺衍生物的多样性，期望改善萘酰亚胺的生物活性，提高对DNA的识别和嵌入能力。本发明的含化合物是在4-溴-1,8萘酐母体上以柔性侧链引入五元三氮唑环并连接巯基苯并噻唑基团，其目的是：通过氨基缩合、氨基取代、三溴化磷取代羟基、叠氮化、“Click chemistry”等反应，合成含苯并噻唑和三唑双杂环萘酰亚胺类化合物，对体外肿瘤细胞生长具有抑制能力。>

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物，所述化合物具有通式Y的结构：>

通式Y中：R选自X₁、X₂、X₃、X₄、X₅或X₆

进一步地，所述化合物选自：>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-六氢吡啶-1,8-萘酰亚胺；>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-吗啉-1,8-萘酰亚胺；>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-硫代吗啉-1,8-萘酰亚胺；>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-甲基哌嗪-1,8-萘酰亚胺；>

或N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-吡咯-1,8-萘酰亚胺。>

本发明所述化合物的制备方法，包括以下步骤：>

①制备中间体1：在三乙胺存在下，以丙酮为溶剂，溴丙炔与2-巯基苯并噻唑反应生成2-(2-炔-1-丙基硫代)苯并[d]噻唑，作为中间体1；>

②制备中间体3：4-溴-1,8-萘酐与乙醇胺溶于乙醇，升温至回流反应，生成N-(2’-羟基乙基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺，作为中间体3；>

③制备中间体4：将中间体3溶于乙二醇单甲醚，加入相应的环状胺，反应得到具有通式Ⅰ结构的中间体4；>

④制备中间体5：将中间体4溶于乙酸乙酯，加入三溴化磷反应生成具有通式Ⅱ结构的中间体5；>

⑤制备中间体6：将中间体5溶于DMF，加入NaN₃，反应生成具有通式Ⅲ结构的中间体6；>

⑥制备所述化合物：将中间体6和中间体1溶解于叔丁醇和水的混合液，加入催化剂抗坏血酸钠和五水硫酸铜，氮气保护下，反应生成所述化合物。>

合成路线如下：>

进一步地，步骤①中，溴丙炔：2-巯基苯并噻唑：三乙胺的最佳摩尔比为1:1:1；先将2-巯基苯并噻唑以丙酮溶解，加入三乙胺，此时反应液呈橙色透明液体，再加入溴丙炔，超声振荡反应约10min，过滤，得褐色滤液，将滤液减压蒸馏除去溶剂，得褐色油状固体。>

进一步地，步骤②中4-溴-1,8萘酐与乙醇胺按照最佳摩尔比为1:1.2投料，升温至回流，二者发生氨基缩合反应，TLC跟踪至反应完全，冷却，倒入冰水，析出灰白色沉淀，抽滤，干燥。>

进一步地，步骤③中中间体3与相应的环状胺的摩尔比为1:2.9～3.5发生氨基取代反应，反应温度最优选为125℃，即乙二醇单甲醚的回流温度，反应完成后，冷却，倒入冷水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体。>

进一步地，步骤④中中间体4在冰浴条件下溶于乙酸乙酯，加入三溴化磷后继续冰浴0.5h，中间体4与三溴化磷的最佳摩尔比1:2.9～3.1；撤去冰浴，加热至回流温度，TLC跟踪至反应完全，冷却，加入甲醇中和过量的三溴化磷至不再冒烟，倒入饱和食盐水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体。>

进一步地，步骤⑤中中间体5与叠氮钠的最佳摩尔比为1:3，此叠氮化反应温度一般小于60℃，反应温度最佳为55℃，反应结束后，倒入食盐水，抽滤，水洗，干燥，得黄色固体。>

进一步地，步骤⑥中，中间体6和中间体1的最佳摩尔比为1:2，叔丁醇和水以1:1混合，经Cu(I)催化的“Click chemistry”反应，70℃避光反应至反应完全，冷却，倒入饱和食盐水中，静置，过滤，干燥，硅胶柱层析分离得到固体，即为所述化合物。>

本发明所述化合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，所述肿瘤细胞包括MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞。>

将本发明所述的化合物用四氮唑盐还原法对MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，结果表明，该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性。>

所述四氮唑盐还原法实验步骤如下：>

1、接种细胞>

分别将乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和肝癌SMMC-7721细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200μL细胞悬液，保证每孔中约2000～5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37℃、5％CO₂的环境中温育温育24h～48h。>

2、添加药物>

用培养基将本发明所述化合物分别稀释成10^-8、10^-7、10^-6、10^-5M四个梯度浓度，吸去96孔板中2-11列的培养基，此处要小心不要吸走细胞；然后加入药物，设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO₂培养箱中，培育48h。>

3、存活细胞数的检测>

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO，溶解残留的MTT-甲臜结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：>

肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。>

本发明的有益效果：>

第一，本发明在具有生物活性的环状胺连接在萘酰亚胺的4位，并保持了萘酰亚胺的亚胺位氮原子与侧链连接的三唑氮原子相隔两个碳的结构，通过三唑的链接也将含硫杂环苯并噻唑引入了分子，拓展萘酰亚胺衍生物的多样性，改善了萘酰亚胺的生物活性，提高了对DNA的识别和嵌入能力；>

第二，本发明的含苯并噻唑和三唑双杂环的稠环化合物对体外肿瘤细胞生长具有抑制能力，例如MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞。>

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。>

实施例1>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-六氢吡啶-1,8-萘酰亚胺(化合物F4)的合成：>

(1)2-(2-炔-1-丙基硫代)苯并[d]噻唑(中间体1)的合成>

称取2-巯基苯并噻唑3.02g(18mmol)巯基苯并噻唑，用35mL丙酮溶解，加入2.51mL(18mmol)三乙胺，此时反应液呈橙色透明液体，加入1.41mL(18mmol)溴丙炔，超声震荡10分钟，停止反应，过滤，得褐色滤液，将滤液减压蒸馏除去溶剂。得褐色油状固体3.61g，产率：98.0％。>

(2)N-(2’-羟基乙基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺(中间体3)的合成>

在50mL双口瓶中，加入2.76g(10mmol)4-溴-1,8-萘酐，加入0.7mL乙醇胺，28mL无水乙醇，磁力搅拌下升温至回流，在回流温度下反应3h，TLC跟 踪至反应完全。停止加热，冷却至室温后，将反应体系倒入冰水中，析出灰白色沉淀，抽滤，干燥得产物2.79g。产率：87.4％。>

(3)N-(2’-羟基乙基)-4-六氢吡啶基-1,8-萘酰亚胺(中间体4)的合成>

取2.0g(6.3mmol)中间体3，加入25mL乙二醇单甲醚搅拌溶解，再向体系中加入1.86mL(1.9mmol)六氢吡啶，加热至125℃，保持此温度继续反应3h，TLC跟踪至反应完全，停止加热，待体系冷却至室温，倒入水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体1.99g。产率：98.2％。>

(4)N-(2’-溴乙基)-4-六氢吡啶基-1,8-萘酰亚胺(中间体5)的合成>

取1.99g(6.1mmol)中间体4，加入25mL乙酸乙酯在冰水浴下搅拌溶解，待体系将至0℃后，向体系缓慢滴加1.75mL(18.5mmol)三溴化磷，继续冰浴0.5h，撤去冰水浴，将反应加热至回流温度下反应2h，TLC跟踪至反应完全，停止加热，静置冷却至室温，向体系中加入适量的甲醇中和过量的三溴化磷，待不再冒烟为止。倒入饱和食盐水中析出黄色沉淀，过滤，水洗，干燥得黄色固体2.24g。产率：94.3％。>

(5)N-(2’-叠氮乙基)-4-六氢吡啶基-1,8-萘酰亚胺(中间体6)的合成>

在50mL反应双口瓶中加入2.24g(5.8mmol)化合物5，加入28mL DMF溶剂，再向体系缓慢加入1.13g NaN₃(17.4mmol)，加热至55℃，反应1.5h后，将体系冷却至室温，倒入饱和食盐水，抽滤，水洗，干燥，得黄色固体1.89g。产率：93.3％。>

(6)N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-六氢吡啶-1,8-萘酰亚胺(化合物F4)的合成>

在50mL双口瓶中加入1.89g(5.42mmol)化合物6，2.22g(10.84mmol)中间体1，用32mL叔丁醇和水的1:1的混合溶液搅拌溶解，再加入催化剂3.22g抗坏血酸钠(VC钠)和1.36g五水硫酸铜，N₂保护下，在70℃避光反应24h，TLC跟踪至反应完全。反应结束后，将体系冷却至室温后倒入饱和食盐水中，静置，过滤，干燥。硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝20:1)，得到目标产物1.26g(化合物F4)，黄色固体，产率42.0％。熔点：176.1-178.4℃。>

¹H>3)δ8.45(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.41–8.32(m,2H),7.82(d,J＝7.8Hz,1H),7.74(s,2H),7.61(d,J＝1.0Hz,1H),7.42–7.36(m,1H),7.29(dd,J＝11.5,4.5Hz,1H),7.12(d,J＝8.2Hz,1H),4.71(t,J＝6.1Hz,2H),4.67–4.59(m,4H),3.28–3.12(m,4H),1.93–1.84(m,4H),1.77–1.69(m,2H).>

+ESI MS(M+H):C₂₉H₂₆N₆O₂S₂，计算值：555.1559，实测值：555.1628。>

实施例2>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-吗啉-1,8-萘酰亚胺(化合物F1)的合成：>

除在(3)中用吗啉代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝14:1)，得到目标产物F1，黄绿色固体，产率79.8％。熔点：212.2-215.6℃。>

¹H>3)δ8.48(d,J＝7.3Hz,1H),8.41(dd,J＝13.7,8.2Hz,2H),7.86(d,J＝8.0Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,2H),7.69–7.62(m,1H),7.41(t,J＝7.2Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.18(d,J＝8.1Hz,1H),4.72(t,J＝6.0Hz,2H),4.70–4.48(m,4H),4.16–3.91(m,4H),3.37–3.11(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.99,164.10,163.56,155.97,153.00,135.40,132.85,131.43,130.47,129.92,126.05,126.02,125.79,124.28,123.52,122.58,121.48,121.02,116.28,114.93,66.93,53.40,47.95,39.43,27.87.>

+ESI MS(M+H):C₂₈H₂₄N₆O₃S₂，计算值：557.1351，实测值：557.1427。>

实施例3>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-硫代吗啉-1,8-萘酰亚胺(化合物F2)的合成：>

除在(3)中用硫代吗啉代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝6:1)，得到目标产物F2，黄色固体，产率75.7％。熔点：206.5-208.1℃。>

¹H>3)δ8.48(dd,J＝7.3,1.0Hz,1H),8.42(d,J＝8.1Hz,1H),8.34(dd,J＝8.4,1.0Hz,1H),7.85(d,J＝7.7Hz,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,2H),7.66(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.41(t,J＝7.2Hz,1H),7.30(t,J＝7.6Hz,1H),7.19(d,J＝8.1Hz,1H),4.73(t,J＝6.0Hz,2H),4.70–4.56(m,4H),3.51(s,4H),2.99(s,4H).>

+ESI MS(M+H):C₂₈H₂₄N₆O₂S₃，计算值：573.1123，实测值：573.1181。>

实施例4>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-甲基哌嗪-1,8-萘酰亚胺(化合物F3)的合成：>

除在(3)中用甲基哌嗪代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH:三乙胺＝14:1:1)，得到目标产物F3，黄绿色固体，产率50.3％。熔点：186.4-188.0℃。>

¹H>3)δ8.48(d,J＝7.2Hz,1H),8.41(d,J＝8.1Hz,1H),8.38(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.73(d,J＝7.2Hz,2H),7.68–7.59(m,1H),7.43–7.37(m,1H),7.33–7.28(m,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),4.72(t,J＝6.1Hz,2H),4.69–4.57(m,4H),3.31(s,4H),2.76(s,4H),2.45(s,3H).>

+ESI MS(M+H):C₂₉H₂₇N₇O₂S₂，计算值：570.1668，实测值：570.1729。>

实施例5>

N-[2’-(4-((苯并噻唑-2-巯基)甲基)-[1,2,3]-三唑)-乙基]-4-吡咯-1,8-萘酰亚胺(化合物F5)的合成：>

除在(3)中用吡咯代替六氢吡啶外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(柱层析洗脱液为CH₂Cl₂:CH₃OH＝17:1)，得到目标产物F5，橘红色固体，产率58.1％。熔点：117.7-119.2℃。>

¹H>3)δ8.55(d,J＝8.6Hz,1H),8.47(d,J＝6.7Hz,1H),8.32(d,J＝8.7Hz,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.79–7.67(m,2H),7.53–7.44(m,1H),7.39(t,J＝7.7Hz,1H),7.29(d,J＝7.1Hz,1H),6.76(d,J＝8.7Hz,1H),4.72(t,J＝6.0Hz,2H),4.69–4.45(m,4H),3.78(t,J＝6.4Hz,4H),2.29–2.00(m,4H).>

+ESI MS(M+H):C₂₈H₂₄N₆O₂S₂，计算值：541.1402，实测值：541.1449。>

应用例>

体外抑制肿瘤细胞生长活性测定：>

用四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性测定。>

以化合物F1为例，四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：>

1、接种细胞>

将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200μL细胞悬液，保证每孔中约2000～5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37℃、5％CO₂环境 的培养箱中温育24h。>

2、添加药物>

用培养基将实施例1制备的化合物F1分别稀释成10^-8、10^-7、10^-6、10^-5M四个梯度浓度；吸去96孔板中2-11列的培养基，此处要小心不要吸走细胞，然后加入药物，每个浓度设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO₂培养箱中，培育48h。>

3、存活细胞数的检测>

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：>

肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。>

化合物F2～F6的检测方法同上。>

根据化合物F1～F6的肿瘤抑制率，计算其IC₅₀值，结果如下表：>

表1.化合物F1～F6对Hela、MCF-7和7721癌细胞的IC₅₀值>

表1列出了化合物F1～F6对MCF-7、Hela和7721三种癌细胞的IC₅₀值，该系列化合物整体表现出较好的抗肿瘤效果，其中对MCF-7和Hela细胞的选择性要比7721细胞的好。F1对三种细胞显示了较强的抑制效果，IC₅₀值分别为0.65μM、2.26μM和3.15μM，特别地对MCF-7的IC₅₀值是amonafide的2.58倍。连接硫吗啉的F2并没有比F1显示出更好的抑制活性，说明硫原子只是在一些情况下会增强化合物的细胞毒性。F3对MCF-7的IC₅₀达到1.07μM，是amonafide的1.57倍，对Hela细胞的IC₅₀达到0.84μM，是amonafide的2.06倍。>