H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒及其引物对

摘要

本发明公开了一种H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有一对特异性引物。实验证明，应用本发明可检测H3亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。本发明用于H3亚型禽流感病毒导致的禽类感染，可以节约时间的成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒及 其引物对。

背景技术

禽流感(avian influenza virus,AI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引 起的家禽及野生禽类感染及疾病的总称。其感染范围很广，几乎所有的野生及家养禽类均 可感染，其中以家禽中的火鸡和鸡最为易感，发病率与死亡率较高。根据禽流感病毒(AIV) 致病性强弱，将其分为高致病和低致病性AIV。以H5N1、H7N7亚型毒株为代表的高致病性 AIV不仅可引起禽类的大面积死亡，甚至可以感染并致人死亡。低致病性AIV在禽类体内 只表现轻微症状或不发病，未能引起人们的广泛关注。直至1999年的香港H9N2亚型AIV 感染人的事件才引起世界对低致病AIV的关注。越来越多的研究报道表明低致病性AIV可 以为高致病性AIV提供基因片段造成对人类的感染。H3亚型AIV虽属于低致病性AIV，但 其在低致病性AIV中占有较重要地位，Yi PENG等通过对2009-2011年广西地区低致病性 AIVs进行病原学检测与分析，表明H3亚型AIV在家禽中分离率较高。此外，研究报道H3 亚型AIV在不同家禽中分布的季节性与我国人群中流感病毒流行的季节性比较一致且有逐 年上升趋势，这就为两种宿主的流感病毒在猪这个“混合器”中发生基因重排提供了条件。 1968年爆发的香港流感病毒A/HongKong/68(H3N2)经研究证实是由人的H2N2亚型流感 病毒与H3亚型AIV的HA基因重排得来，其PB1基因也来自于AIV。因此，加强对H3亚型 AIV的监测对养禽业和公共卫生都具有重要意义。

二温式PCR即二温式聚合酶链式反应，是根据常规三温式PCR技术原理改进而成的一 种PCR特殊形式。二温式RT-PCR将退火和延伸合并为同一个温度，只有两种温度变化， 即变性和退火-延伸温度。与常规RT-PCR相比，二温式PCR扩增程序简单，耗时短，同时 由于较常规PCR退火温度高而延伸温度低，不但增强了扩增产物的特异性，也使引物的延 伸变得更容易。因此，二温式RT-PCR是一种操作简单、检测速度更快更特异的技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供敏感性好、特异性强和重复性好的H3亚型禽流感病 毒二温式RT-PCR检测试剂盒及其引物对，以简便快速地检测H3亚型禽流感病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR 检测引物对，包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基 序列。

引物1和引物2的摩尔比为0.5-1∶0.5-1。

引物1和引物2的摩尔比为1∶1。

上述H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对在PCR扩增方面的应用，PCR扩增 的退火温度为60.0℃-68.0℃。

PCR扩增的退火温度为65℃。

H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒，包括引物对、PCR缓冲液和水；

引物对包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序 列，其浓度均为25μmol/L，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.1μmol/L-0.5μmol/L；

PCR缓冲液为2×Taq PCR Mix。

引物1和2在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/L。

上述H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的应用，PCR扩增 的退火温度为60.0℃-68.0℃。

PCR扩增的退火温度为65℃。

针对目前缺乏对H3亚型禽流感病毒进行快速检测和诊断的有效可靠的技术，发明人 研究设计了一对特异性引物，据此建立了H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法，并 制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可检测H3亚型禽流感病毒，具有操作 快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。本发明用于H3亚型禽流感病毒导致 的禽类感染，可以节约时间的成本。

附图说明

图1是二温式RT-PCR特异性试验结果的电泳图，图中：M.100bp DNA ladder；1-5.5 株H3分离株；6.H1；7.H4；8.H5；9.H6；10.H7；11.H9；12.新城疫病毒；13.传染性支气管炎病 毒；14传染性喉气管炎；15.鸡毒霉形体；16.禽呼肠孤病毒；17.阴性对照。

图2是二温式PCR的敏感性试验结果的电泳图，图中：M.100bp DNA  ladder；1-6.1×10⁷-1×10²拷贝/μL；7.阴性对照。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

H1亚型禽流感病毒记载在“利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及 N1、N2亚型的分型”，病毒学报，2013，29(2):154-159，公众可从广西壮族自治区兽医 研究所获得；

H3亚型禽流感病毒记载在“Visual detection of H3subtype avian influenza viruses  by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay”Virology  Journal,2011,5；8:337，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H4亚型禽流感病毒记载在“H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序 列测定和遗传进化分析”，畜牧兽医学报，2006,37(12),1334-1339，公众可从广西壮族 自治区兽医研究所获得；

H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”， 南方农业学报，2013,02:323-327，H5亚型AIV RNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断 研究室惠赠；

H6亚型禽流感病毒记载在“H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立”， 畜牧与兽医，2012,44(11),12-16，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H7亚型禽流感病毒记载在“H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检 测及鉴别方法的建立”，中国兽医科技，2005,35(6),437-440，H7亚型AIV RNA为美国 宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；

H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病 毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得；

新城疫病毒记载在“禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立”，生 物技术通讯，2008,19(3)410-413，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

传染性支气管炎病毒记载在“应用多重反转录_聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传 染性支气管炎病毒的研究”，中国预防兽医学报，2000,22(2),126-130，公众可从广西 壮族自治区兽医研究所获得；

传染性喉气管炎病毒记载在“传染性喉气管炎病毒疫苗的研究进展”，中国畜牧兽医， 2006,33(2),41-44，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得

鸡毒霉形体记载在“用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白”，中国兽医 科技，2003,33(2),41-43，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

禽呼肠孤病毒记载在“禽呼肠孤病毒广西分离株σ3基因的克隆和表达”，中国预防兽 医学报，2005,27(3)，167-170，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

RNA抽提试剂盒、AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂均购自TaKaRa 公司，质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司，2×Taq PCR  Master MIX购自Invitrogen公司。

实施例1、引物的设计与合成

根据GenBank中H3亚型AIV HA基因的保守序列，利用DNAStar软件进行多序列比对， 在保守区用primer5.0设计引物。引物由Invitrogen公司合成。(表1)。

表1 引物信息

实施例2、二温式RT-PCR检测

一、核酸的提取及RNA的反转录

参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取传染性喉气管炎、鸡毒霉形体DNA，同时对H1、 H3、H4、H6、H7、H9、禽呼吸道传染病、传染性支气管炎和新城疫病毒进行抽提，并按反 转录说明书将RNA反转录成cDNA，具体如下：采用50μL体系，于EP管中依次加入10μL 5×反转录缓冲液、10mmol/L dNTP4μL、5U/μLAMV1μL、20U/μL RNA酶抑制剂1μL、 流感通用引物(序列为5′-AGCAAAAGCAGG-3′，SEQ.ID.No.3)2μL、待检总RNA模板 32μL，瞬离后水浴锅42℃90min，将制备的cDNA置-30℃保存备用。

二、二温式RT-PCR扩增体系的建立

总反应体系为25μL，其中12.5μL2×PCR Mater mix、0.5μL25μmol/L引物 H3-F和H3-R、2-5μL cDNA、以超纯水补足25μL。根据引物Tm值，将退火温度按60～ 68℃依次递增，经多次重复试验确定最佳退火温度。

通过对H3亚型禽流感病毒模板用量、退火温度的多次重复试验优化，确定最佳反应 体系为25μL，其中2×PCR Master Mix(Invitrogen)12.5μL，H3亚型AIV上下游引物各 0.5μL(引物浓度均为25μmol/L，在反应体系中的终浓度均为0.5μmol/L)、模板CDNA 为2μL，加水至25μL；PCR反应模式为：94℃4min；94℃40s，65℃50s，共35个循 环；最后再72℃延伸10min，4℃结束。

三、二温式RT-PCR特异性试验

利用上述优化后的二温式PCR反应体系及条件，扩增5株分离的H3亚型AIV核苷酸 作为阳性对照，同时扩增H1、H4、H5、H6、H7、H9亚型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG、和 ARV的核苷酸，检测其特异性。结果如图1所示，可见五株分离的H3亚型AIV扩增片段均 为548bp,与预期结果大小一致，而其他亚型AIV和禽呼吸道疾病病毒均未扩增出对应条带。 说明本发明的引物和方法有高特异性。

因此，上述引物和方法可应用于鉴定未知样本是否感染H3亚型禽流感病毒：若得到 548bp片段，则样本中含有H3亚型禽流感病毒，反之则没有。

四、二温式RT-PCR的敏感性试验

对H3亚型AIV HA基因测序正确的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使其浓度为 1×10⁷-1×10²拷贝/μL，用二温式RT-PCR方法分别对1×10⁷-1×10²拷贝/μL质粒标准 品进行扩增，结果如图2所示，可见本发明建立的H3亚型AIV二温式PCR检测方法最低 能检测到1×10⁴拷贝/μL H3亚型AIV。

实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

试剂盒包括引物对、PCR缓冲液和水；引物对包括引物1和2，其浓度均为25μmol/L (在PCR反应体系中的终浓度均为0.5μmol/L)；PCR缓冲液为2×Taq PCR Mix。

PCR检测中的其他试液可现场配置或直接使用商品化试剂。

实施例4、二温式RT-PCR检测临床样本

对96份从广西南宁市活禽市场采集的咽喉和泄殖腔拭子反复挤压、清洗，从中抽提 病毒RNA并反转录为cDNA，使用实施例3的试剂盒，按照实施例2建立的二温式RT-PCR 方法进行检测，重复三次，保证实验的准确性。同时对这96份样品进行抗生素处理后， 用鸡胚法分离病毒，通过HA、HI实验验证该方法的准确性。

结果显示，在广西南宁市96份活禽市场样品中，二温式RT-PCR检测结果有5份呈现 H3亚型AIV阳性；病毒分离鉴定结果也是5份阳性样品。这表明所建立的二温式RT-PCR 检测检测结果与病毒分离鉴定结果一致，该法具有良好的实用性。