噬菌体免疫环介导等温扩增检测法

摘要

本发明涉及一种噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，首先将噬菌体展示多肽与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，然后环介导等温扩增结合在捕获抗体上的噬菌体，最后对免疫环介导等温扩增反应产物进行分析及结果判定。本发明提供的方法利用噬菌体展示多肽，将免疫竞争和环介导等温扩增结合，实现对不含有核酸的小分子化合物的环介导等温扩增检测。本发明灵敏度高、实用性强，不需要昂贵的精密仪器。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，利用噬菌体展示多肽， 将免疫竞争和环介导等温扩增结合，实现对不含有核酸的小分子化合物的环介导等温扩增检测。

背景技术

有机磷农药(Organophosphorus pesticide，简称OP)是一类广泛用于防治病虫害的农药。由于其具有 高毒性，所以在使用过程中也会使一些非靶标生物受到毒害。同时，随着人们对食品和环境安全的关注， 建立一种高通量、灵敏的检测方法对有机磷农药残留的防控有着重要的意义。

环介导等温扩增(loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年由日本科学家Notomi，T. 首次在Nucleic Acids Research杂志上报道的一种新颖的恒温核酸扩增方法。环介导等温扩增技术的特点是 针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一条链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60 分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过 程，只需要恒温环境。不仅大大降低了检测的费用，而且给检测带来极大方便。由于农药是不含核酸序列 的小分子化合物，所以该方法在农药等小分子化合物中的应用被忽略。

噬菌体展示技术是1985年由Smith，G.P.首次在Science杂志上报道，已经作为一种强大的工具运用在 不同的研究中，包括筛选抗体和酶的配体；筛选小分子的受体；抗体工程等。其原理是将多肽或蛋白质的 编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋 白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保 持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。当噬菌体展示的多肽为随机序列时为噬 菌体展示多肽库，利用抗体对噬菌体展示多肽库进行亲和淘选，可筛选出能够和抗体结合的噬菌体展示多 肽。由于筛选出的多肽连接在噬菌体外壳蛋白上，并且噬菌体自身含有核酸，所以筛选出的多肽不需要与 核酸模板连接，可直接被LAMP检测。利用噬菌体展示多肽的特点，建立有机磷农药免疫LAMP检测方 法。该发明为食品安全检测、农产品等的出入境检测、环境监测部门的监测提供有效的技术手段和检测方 法。对我国农产品的可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。目前国内 外尚未见有关免疫LAMP方法在农药等其他小分子化合物上的应用报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新颖、快速、灵敏和实用的噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，利用噬菌 体展示多肽，将免疫竞争和环介导等温扩增结合，以实现对不含有核酸的小分子化合物的环介导等温扩增 检测。

本发明提供的噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，包括：

第一步：噬菌体展示多肽与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，

包被：用PBS缓冲液将抗体稀释为10μg/mL后加入酶标板，每孔100μL，37℃孵育2小时；洗板： 用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；封闭：每孔加入300μL 1％BSA，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次， 吸水纸拍干；加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL分析物，再加入50μL的噬菌体，37℃孵育1小时； 洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；洗脱：每孔加入 100μL 0.2M pH2.2甘氨酸盐酸缓冲液37℃洗脱15分钟，洗脱后收集洗脱液并用1M pH9.1 Tris-HCl进 行中和。

第二步：环介导等温扩增结合在捕获抗体上的噬菌体，

以FIP、BIP为内引物，以F3、B3为外引物对洗脱的噬菌体进行恒温扩增。其反应体系为：0.64M betaine， 1mM dNTPs，2.5μL 10×Bst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，150μM羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue，HNB)， 2μL中和后的噬菌体洗脱液，外引物各0.2μM，内引物各1.2μM，ddH₂O补齐至25μL。将上述所有试剂 混匀置于PCR管中，63℃ 60min，80℃ 10min终止反应。

第三步：免疫环介导等温扩增反应产物分析及结果判定，

分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取3μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混 匀，在2％(W/V)琼脂糖凝胶中101V下电泳1小时，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成像系 统上成像；

分析方法2：在日光下用肉眼观察结果。

结果判定：在分析方法1中，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若有条带为阴性，若 无条带为阳性。在分析方法2中，若扩增产物的颜色变为天蓝色则为阴性，若保持深蓝色不变为阳性。

本发明技术方案实现的有益效果：

1.经济实用：反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的仪器，只需要能够提供恒温的设备，比 如水浴锅。

2.检测简单：直接肉眼观察反应产物的颜色变化来定性判断样品中是否含有待测物。

3.灵敏度高：应用于有机磷农药甲基对硫磷的检测，本方法的检测限为2ng/mL，比试纸条的灵敏度 高。

4：新颖度高：目前国内外尚未见有关噬菌体免疫LAMP方法在农药等其他小分子化合物上的应用报 道。

附图说明

图1为本发明技术方案的原理示意图；

图中“1”表示酶标板；“2”表示捕获抗体；“3”表示分析物；“4”表示噬菌体展示多肽；“5” 表示噬菌体DNA；“6”表示噬菌体；“7”表示竞争反应过程；“8”表示LAMP扩增产物；“9”表 示LAMP反应前：深蓝色；“10”表示LAMP反应后：天蓝色；“11”表示LAMP反应；

图2为本发明对甲基对硫磷标准品检测在凝胶成像系统的紫外灯下观察结果；

图中：泳道“M”表示2000bpDNA Marker；泳道“1”表示阴性对照；泳道“2”至“8”分别表示 浓度为8、4、2、1、0.5、0.25、0ng/mL甲基对硫磷；泳道“9”表示阳性对照；

图3为本发明对甲基对硫磷标准品检测在日光下用肉眼观察结果；

图中：“1”表示阴性对照；2至8分别表示浓度为8、4、2、1、0.5、0.25、0ng/mL甲基对硫磷；“9” 表示阳性对照。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽 管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进 行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

利用能够与抗有机磷类农药抗体C8/D3识别的噬菌体展示多肽C11-2进行有机磷农药噬菌体免疫环等 温扩增检测，展示在M13噬菌体外壳蛋白上的多肽序列为SEQ ID No.1所示序列，其中两个半胱氨酸残 基之间形成一对分子内二硫键。

使用LAMP引物设计程序PrimerExplorer V4针对噬菌体ssDNA的特异性区域SEQ ID No.2所示的序 列设计了如下一套引物，包含了B3：SEQ ID No.3所示的序列、F3：SEQ ID No.4所示的序列、BIP (BIc-B2)：SEQ ID No.5所示的序列和FIP(FIc-F2)：SEQ ID No.6所示的序列。

B3：5’-ACAAACTACAACGCCTGTA-3’

F3：5’-CGCAATTCCTTTAGTGGTAC-3’

BIP3：5’-ACTAACGTCTGGAAAGACGACAATTCCACAGACAGCCCTC-3’

FIP3：5’-AACAGTTTCGGCCGAACCTCACTCTGCTTGTTCTCCGCCTTG-3’

本实施例的同步反应方法中所涉及的各个过程和材料如图1所示。图中“1”表示酶标板；“2”表示 捕获抗体；“3”表示分析物；“4”表示噬菌体展示多肽；“5”表示噬菌体DNA；“6”表示噬菌体； “7”表示竞争反应过程；“8”表示LAMP扩增产物；“9”表示LAMP反应前：深蓝色；“10”表 示LAMP反应后：天蓝色；“11”表示LAMP反应。

实施例1：噬菌体免疫环介导等温扩增检测法对有机磷农药标准品的检测

1.有机磷农药标准溶液的配制

用甲醇配制表1所列有机磷农药标准品母液(10mg/mL)，用含有20％甲醇的PBS将母液稀释成10 μg/mL至0.25ng/mL系列浓度用于免疫LAMP检测。

2.噬菌体展示多肽与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，

包被：用PBS缓冲液将抗有机磷类农药抗体C8/D3(由本实验制备、贮藏)稀释为10μg/mL后加入 酶标板，每孔100μL，37℃孵育2小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗 涤5次，吸水纸拍干；封闭：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％ 吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；加入标准品和噬菌体：分别将50μL标准品加入 酶标板中，再加入50μL的噬菌体，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L， pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；洗脱：每孔加入100μL0.2M pH2.2甘氨酸盐酸缓冲液37℃洗脱15 分钟，洗脱后收集洗脱液并用1M pH9.1Tris-HCl进行中和。

3.环介导等温扩增结合在捕获抗体上的噬菌体，

以FIP、BIP为内引物，以F3、B3为外引物对洗脱的噬菌体进行恒温扩增。其反应体系为：0.64M betaine， 1mM dNTPs，2.5μL10×Bst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，150μM羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue，HNB)， 2μL中和后的噬菌体洗脱液，外引物各0.2μM，内引物各1.2μM，ddH₂O补齐至25μL。将上述所有试剂 混匀置于PCR管中，63℃ 60min，80℃ 10min终止反应。

4.免疫环介导等温扩增反应产物分析及结果判定，

分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取3μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混 匀，在2％(W/V)琼脂糖凝胶中101V下电泳1小时，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成像系 统上成像；

分析方法2：在日光下用肉眼观察结果。

结果判定：在分析方法1中，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若有条带为阴性，若 无条带为阳性，甲基对硫磷的检测结果如图2所示；在分析方法2中，若扩增产物的颜色变为天蓝色则为 阴性，若保持深蓝色不变为阳性，甲基对硫磷的检测结果如图3所示，使扩增产物保持深蓝色或者在凝胶 成像系统的紫外灯下观察无梯形条带的最低浓度为2ng/mL。

本发明提供的噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，使扩增产物保持深蓝色或者在凝胶成像系统的紫外 灯下观察无梯形条带的最低浓度定义为本检测方法对该分析物的最低检测限(LOD)，对23种有机磷农 药的检测结果如表1所示。

本发明提供的噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，选择性通过交叉反应率(CR)进行评价，其计算公 式为CR＝LOD(甲基对硫磷)/LOD(其他化合物)×100，选择性范围为甲基对硫磷、对硫磷、杀螟硫磷、 杀螟腈、EPN、甲基对氧磷、对氧磷、杀螟氧磷和异氯硫磷，23种有机磷农药的交叉反应率如表1所示。

表1 噬菌体免疫环介导等温扩增检测法对有机磷农药标准品的检测结果

编号 农药 检测限(ng/mL) 交叉反应率(％) 1 甲基对硫磷 2 100

2 对硫磷 8 25 3 杀螟硫磷 4 50 4 杀螟腈 16 12.5 5 EPN 32 6.3 6 甲基对氧磷 128 1.6 7 对氧磷 128 1.6 8 杀螟氧磷 128 1.6 9 异氯硫磷 512 0.4 10 氨磺磷 ＞10000 ＜0.02 11 水胺硫磷 ＞10000 ＜0.02 12 倍硫磷 ＞10000 ＜0.02 13 三唑磷 ＞10000 ＜0.02 14 毒死蜱 ＞10000 ＜0.02 15 甲基毒死蜱 ＞10000 ＜0.02 16 辛硫磷 ＞10000 ＜0.02 17 马拉硫磷 ＞10000 ＜0.02 18 甲拌磷 ＞10000 ＜0.02 19 乐果 ＞10000 ＜0.02 20 杀虫灵 ＞10000 ＜0.02 21 敌敌畏 ＞10000 ＜0.02 22 甲基立枯磷 ＞10000 ＜0.02 23 谷硫磷 ＞10000 ＜0.02

实施例2：噬菌体免疫环介导等温扩增检测法对添加样品进行检测

1.添加样品的制备及处理

以甲基对硫磷、对硫磷和杀螟硫磷为分析对象，分别添加到卷心菜、苹果和青菜进行添加回收试验。 称取5g预先匀浆的样品，添加标准品(对硫磷、对硫磷和杀螟硫磷)至0、80和160ng/g的终浓度，混 匀，室温静置1h，加入10mL的甲醇，充分振荡，4000rpm，离心5min，上清液移入25mL容量瓶中。 沉淀重新加入10mL甲醇，充分振荡，4000rpm，离心5min，上清液移入25mL容量瓶中，并用PBS 缓冲液定容至25mL。取部分定容之后的样品液用PBS稀释4倍用于检测。

2.噬菌体展示多肽与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，

包被：用PBS缓冲液将抗有机磷类农药抗体C8/D3(由本实验制备、贮藏)稀释为10μg/mL后加入 酶标板，每孔100μL，37℃孵育2小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗 涤5次，吸水纸拍干；封闭：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％ 吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；加入标准品和噬菌体：分别将50μL标准品加入 酶标板中，再加入50μL的噬菌体，37℃孵育1小时；洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L， pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；洗脱：每孔加入100μL0.2M pH2.2甘氨酸盐酸缓冲液37℃洗脱15 分钟，洗脱后收集洗脱液并用1M pH9.1Tris-HCl进行中和。

3.环介导等温扩增结合在捕获抗体上的噬菌体，

以FIP、BIP为内引物，以F3、B3为外引物对洗脱的噬菌体进行恒温扩增。其反应体系为：0.64M betaine， 1mM dNTPs，2.5μL 10×Bst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，150μM HNB，2μL中和后的噬菌体洗脱液， 外引物各0.2μM，内引物各1.2μM，ddH₂O补齐至25μL。将上述所有试剂混匀置于PCR管中，63℃ 60 min，80℃ 10min终止反应。

4.免疫环介导等温扩增反应产物分析及结果判定，

分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取3μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，混匀，在2％(W/V)琼脂 糖凝胶中101V下电泳1小时，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成像系统上成像；

分析方法2：在日光下用肉眼观察结果。

结果判定：在分析方法1中，在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，若有条带为阴性，若 无条带为阳性；在分析方法2中，若扩增产物的颜色变为天蓝色则为阴性，若保持深蓝色不变为阳性。

本发明提供的噬菌体免疫环介导等温扩增检测法，对添加样品的检测准确，结果如表2所示。

表2 噬菌体免疫环介导等温扩增检测法对添加样品进行检测的结果

注：“S”表示天蓝色；“V”表示深蓝色