一种可溶性、高取代度磷酸化酵母葡聚糖的制备方法

摘要

一种可溶性、高取代度磷酸化酵母葡聚糖的制备方法，具体过程如下：（1）将粉末状酵母葡聚糖原料与六偏磷酸钠或六偏磷酸钾按质量比1:1.5~15混合好后，采用行星式球磨机通过机械化学方法处理8~40min；（2）将步骤（1）处理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物与水的质量比为1:6~18；如果产生沉淀，则通过离心除去不溶物，从而得到溶解液；（3）对步骤（2）得到的溶解液进行透析或超滤，除去多余的六偏磷酸钠或六偏磷酸钾，得到磷酸化酵母葡聚糖溶液。本方法具有简便、快速、高效、不使用有机溶剂和强酸、强碱试剂的特点，有利于工业化的规模化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及葡聚糖技术领域，尤其是涉及一种制备可溶性的、高取代度磷酸化酵母葡聚糖的方法。

背景技术

酵母β-D-葡聚糖（简称酵母β-葡聚糖或酵母葡聚糖）是一种良好的免疫效应应答剂，具有调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化、促进伤口愈合、抗辐射、降低血脂等生理功效，但是它不溶于水，这严重限制了酵母葡聚糖在食品、医药、保健品等领域中的应用。

为了提高酵母葡聚糖的溶解度，国内外学者对其进行了修饰和改性研究。这些方法主要是通过在葡聚糖上连接一些极性基团，如磷酸基团、羧甲基基团、硫酸基团来增加其溶解度。但是这类反应通常都要在强酸、强碱或者有机相中进行。尤其是普通的磷酸化修饰和硫酸化修饰，需要消耗大量的强酸、强碱和有机溶剂，不仅成本高、污染严重，还可能造成安全隐患，不利于工业化的大规模生产。

传统的酵母葡聚糖磷酸化修饰主要通过在酸性溶液中加入磷酸酯化试剂，在高温条件下诱导磷酸酯化反应的进行。由于这类反应均在酸性或者高温的液态环境中进行，酵母葡聚糖容易被水解，因此酵母葡聚糖的磷酸化修饰效率低下，得到的磷酸化葡聚糖的取代度通常都比较低，一般低于0.2。因此研究发明一种高效、环保、简单的磷酸化修饰酵母葡聚糖的方法是十分必要的。

发明内容

针对磷酸化修饰酵母葡聚糖效率低下、取代度低、污染严重等问题，本申请人提供了一种可溶性、高取代度磷酸化酵母葡聚糖的制备方法。本方法具有简便、快速、高效、不使用有机溶剂和强酸、强碱试剂的特点，有利于工业化的规模化生产。

本发明的技术方案如下：

一种可溶性、高取代度磷酸化酵母葡聚糖的制备方法，采用机械化学方法，在固相体系中以六偏磷酸钠或六偏磷酸钾为衍生化试剂，通过固态化学反应对酵母葡聚糖进行磷酸化修饰和改性，具体过程如下：

（1）将粉末状酵母葡聚糖原料与六偏磷酸钠或六偏磷酸钾按质量比1:1.5~15混合好后，采用行星式球磨机通过机械化学方法处理8~40 min；

（2）将步骤（1）处理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物与水的质量比为1:6~18；如果产生沉淀，则通过离心除去不溶物，从而得到溶解液；

（3）对步骤（2）得到的溶解液进行透析或超滤，除去多余的六偏磷酸钠或六偏磷酸钾，得到磷酸化酵母葡聚糖溶液。

将步骤（3）所得磷酸化酵母葡聚糖溶液进行浓缩后，可以得到磷酸化酵母葡聚糖浓缩液；将步骤（3）所得磷酸化酵母葡聚糖溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥后，可以得到磷酸化酵母葡聚糖干粉。制得的酵母葡聚糖的磷酸基团取代度为0.6~2.4。

本发明有益的技术效果在于：

本发明从磷酸化、硫酸化和羧甲基化酵母葡聚糖原料来制备可溶性酵母葡聚糖的方法中，挑选出采用六偏磷酸钠和六偏磷酸钾来磷酸化修饰酵母葡聚糖原料，不使用有机溶剂和强酸、强碱试剂，几乎没有污染，制得的磷酸化酵母葡聚糖能够完全溶于水，具有较高的磷酸基团取代度，最高可达240%，并且具有优良的免疫活性，因此有望有效地应用于食品、保健品、医药、饲料等行业中，提升酵母葡聚糖作为生物免疫调节剂的应用价值。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。以下实施例中所用酵母葡聚糖原料为上海杰康诺生物科技有限公司生产的酵母β-葡聚糖GNP-80。

 

实施例1：机械化学法制备磷酸化酵母葡聚糖方案1

酵母葡聚糖与六偏磷酸钠以质量比1:2混合均匀后，采用行星磨进行机械活化处理，功率为30 Hz，处理时间为10 min；处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:10溶解于水后，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min，其中82%的酵母葡聚糖溶于水，18%的酵母葡聚糖不溶于水；将溶于水的溶解液用水进行多次透析，以除去多余的六偏磷酸钠。收集透析液，对其进行冷冻干燥处理，得到磷酸化酵母葡聚糖。由此制备的磷酸化葡聚糖的（磷酸基团）取代度为0.6。

将磷酸化葡聚糖溶解到去离子水中至浓度为100 ??g/ml，经过0.22 μm滤膜过滤除菌。利用磷酸化葡聚糖溶液刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α，分泌量达到31 ng/mL，是空白对照组的3倍，说明磷酸化葡聚糖可以显著的刺激巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α。

 

实施例2：机械化学法制备磷酸化酵母葡聚糖方案2

酵母葡聚糖与六偏磷酸钾以质量比1:1.5混合均匀后，采用行星磨进行机械活化处理，功率为40 Hz，处理时间为8 min；处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:10溶解于水后，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min，其中76%的酵母葡聚糖溶于水，24%的酵母葡聚糖不溶于水；将溶于水的溶解液用水进行多次透析，以除去多余的六偏磷酸钾。收集透析液，对其进行冷冻干燥处理，得到磷酸化酵母葡聚糖。由此制备的磷酸化葡聚糖的（磷酸基团）取代度为0.65。

将磷酸化葡聚糖溶解到去离子水中至浓度为500 ??g/ml，经过0.22 μm滤膜过滤除菌。利用磷酸化葡聚糖溶液刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌IL-6，分泌量达到0.3 ng/mL，是空白对照组的5倍，说明磷酸化葡聚糖可以显著的刺激巨噬细胞分泌细胞因子IL-6。

 

实施例3：机械化学法制备磷酸化酵母葡聚糖方案3

酵母葡聚糖与六偏磷酸钠以质量比1:5混合均匀后，采用行星磨进行机械活化处理，功率为30 Hz，处理时间为40 min；处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:8溶解于水后，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min，其中87%的酵母葡聚糖溶于水，13%的酵母葡聚糖不溶于水；将溶于水的溶解液用水进行多次透析，以除去多余的六偏磷酸钠。收集透析液，对其进行冷冻干燥处理，得到磷酸化酵母葡聚糖。由此制备的磷酸化葡聚糖的（磷酸基团）取代度为2.4。

将磷酸化葡聚糖溶解到去离子水中至浓度为500 ??g/ml，经过0.22 μm滤膜过滤除菌。利用磷酸化葡聚糖溶液刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌一氧化氮（NO），分泌量达到4.8 mM，是空白对照组的4倍，说明磷酸化葡聚糖可以显著的刺激巨噬细胞分泌细胞信使分子NO。

 

实施例4：机械化学法制备磷酸化酵母葡聚糖方案4

酵母葡聚糖与六偏磷酸钠以质量比1:15混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为40 Hz，处理时间为12 min；处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:15溶解于水后，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min，其中70%的酵母葡聚糖溶于水，30%的酵母葡聚糖不溶于水；将溶于水的溶解液用水进行多次超滤，以除去多余的六偏磷酸钠。收集超滤液，对其进行喷雾干燥处理，得到磷酸化酵母葡聚糖。由此制备的磷酸化葡聚糖的（磷酸基团）取代度为1.5。

将磷酸化葡聚糖溶解到去离子水中至浓度为100 ??g/ml，经过0.22 μm滤膜过滤除菌。利用磷酸化葡聚糖溶液刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α，分泌量达到70 ng/mL，是空白对照组的7倍，说明磷酸化葡聚糖可以显著的刺激巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α。

 

酵母葡聚糖浓度的测定：采用测定植物糖浓度的蒽酮法。

磷酸基团取代度的测定：采用定磷法测定磷酸化酵母葡聚糖中磷酸基团的摩尔浓度，磷酸化酵母葡聚糖的磷酸基团摩尔浓度与它的葡萄糖基团摩尔浓度之比即为磷酸基团取代度。

小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞分泌细胞因子IL-6的检测：（1）细胞培养：将2×10⁶个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180 μL，同时加入20 μL样品液，以20 μL 完全培养基和20 μL 1 μg/mL的LPS溶液分别作空白对照和阳性对照。于37℃、含5%的CO₂条件下培养24 h。（2）细胞因子IL-6测定：收集上述细胞培养的96孔板中的上清液，利用ELSIA细胞因子测试试剂盒检测，具体实验步骤参照试剂盒说明书。

小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞分泌细胞因子NO的检测：（1）细胞培养：同IL-6的检测中的细胞培养方法，细胞培养48 h。（2）信使分子NO测定——Griess法：收集上述细胞培养的96孔板中的上清液50 ??L，与50 ??L Griess试剂（1%磺胺:溶解到2.5%磷酸中的0.1%N-1-萘基乙二胺盐酸盐=1:1）反应10 min，利用酶标仪在540 nm下测定吸光度值。以100 ??M亚硝酸钠为标准品制备标准曲线，利用标准曲线计算NO含量。

小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞分泌细胞因子TNF-α的检测：（1）细胞培养：同IL-6的检测中的细胞培养方法，细胞培养24 h。（2）细胞因子TNF-α测定：收集上述细胞培养的96孔板中的上清液，利用ELSIA细胞因子测试试剂盒检测，具体实验步骤参照试剂盒说明书。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。