一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法

摘要

本发明涉及一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法，所述分子标记是以小麦基因组DNA为底物，以gwm642-1D为SSR引物，进行PCR扩增所得的扩增片段，用于检测小麦面粉水溶剂保持力的特性，该标记不同的等位变异能够解释该性状表型变异的10.57-15.68％，其中，分子量大小为202bp的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188bp的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。本申请为小麦面粉水溶剂保持力在品质育种中的分子标记辅助选择提供一条可行的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记 方法，属于作物遗传育种学领域。

背景技术

1994年美国Nabisco饼干公司的小麦粉及烘焙专家Slade和Levine提 出了软质小麦品质评价的新方法——溶剂保持力(solvent retention  capacity，简称SRC)，该方法于1999年通过了美国谷物化学协会(AACC)的 认定，编号为AACC 56-11。该方法以含水量14％的面粉为基准，经过离心 后，面粉所保持溶剂质量占面粉干重的百分比作为溶剂保持能力(SRC)。用 于检测的溶剂分为4种，主要有蒸馏水、5％碳酸钠溶液、5％乳酸溶液以及 50％蔗糖溶液，其中碳酸钠SRC与面粉中破损淀粉数量相关，乳酸SRC值与 麦谷蛋白特性有关，蔗糖SRC则与戊聚糖特性有关，而水SRC受面粉中所有 成分的影响，其数值大小可以反映面粉的综合特性。通过4种SRC检测，则 可以反映面粉更多的理化特性，从而能够更好地推断面粉的烘焙特性。现SRC 在美国已成为评价软麦品质的主导方法。

面粉的不同品质特性均可以通过不同的SRC得到反映，其中面粉的面筋 特性可以通过乳酸SRC值大小来评价，在一定范围内，乳酸SRC值越高则表 明软麦的面筋特性越好；醇溶蛋白的特性可以通过蔗糖SRC值得到反映，在 一定范围内，蔗糖SRC值低则醇溶蛋白特性好；破损淀粉的数量则可以通过 碳酸钠SRC值大小来评价，其值低则表示破损淀粉含量也较低；而水SRC受 面粉中全部成分的影响，反映了面粉组分的综合特性。因为饼干为低水分含 量的烘焙食品，因此要求原料面粉具有较低的吸水率、淀粉破损率和戊聚糖 含量，SRC检测则正好弥补了饼干测试的某些不足之处，为饼干品质的评价 提供了更多的面粉品质特性信息。

关于SRC值在软麦(主要是饼干粉)评价中的指标的确定，张岐军研究 后认为根据我国弱筋小麦特点，其适宜的SRC值范围为：水SRC、碳酸钠SRC、 蔗糖SRC和乳酸SRC值分别为≤53％、≤66％、≤87％和77.9％～85.1％，其 中与AACC方法划分标准较为接近的为水SRC、碳酸钠SRC、蔗糖SRC，而乳 酸SRC则与之相反。

Guttieri等研究结果表明SRC在不同品种间(即基因型间)差异显著， Guttieri和Souza等对Vanna/Penawawa,Kanto107/IDO488和M2/IDO470等 3个软麦组合重组自交系后代群体的研究表明基因型是影响SRC值的主要因 素。张岐军等研究结果也表明影响SRC值的主要因素为基因型，除个别指标 外，基因型×环境间互作对SRC影响均不显著，因此与蛋白含量作为弱筋小 麦的品质选择指标相比以SRC值来筛选弱筋品种则更为可靠。夏云祥研究结 果表明决定SRC值的主要因素仍是基因型，不同环境对WSRC影响较小。

在小麦SRC值的QTL定位研究方面，N.Smith和E.Souza 2008年利用 187个选自美国软麦实验室资源库的品种，采用关联分析的方法定位了分别 与碳酸钠SRC、乳酸SRC、蔗糖SRC、饼干直径等相关联的分子标记barc98、 gwm429、barc010和barc101等，这些标记均位于2B染色体上。马庆利用宁 7840/Clark的重组自交系群体材料进行了SRC的QTL定位研究，在染色体 5DS上发现了1个与WSRC相关的QTL，在5D、6D染色体上定位出2个与乳 酸SRC相关的QTL，加性效应分别为4.7和-5.4,各自解释了11.5％和15.2％ 的表型变异。在4D染色体上发现与碳酸钠SRC相关的QTL 1个，加性效应1.4， 贡献率为12.2％。在染色体5A和5D上分别发现与蔗糖SRC相关的QTL各1 个，这两个QTL的加性效应分别为-2.84和2.71，各自解释15.9％和9.9％的 表型变异。

利用关联分析的方法进行SRC的QTL关联定位研究国内尚未见报导。

尽管SRC检测所需仪器设备比较简单、操作也很方便，但目前在品种遗 传改良中主要还是用于种质资源的筛选方面，尚未有育成品种的报导。由于 水SRC能够综合反映面粉的特性，而且具有易操作等特点，在江苏里下河地 区农科所的高世代小麦品系检测中已经开始使用。由于小麦品质育种的特殊 性，往往需要在种子收获后再根据有关理化指标的检测来进行选择，无法在 试验田间就对育种早世代材料进行直接选择，而且在回交或滚动回交育种中 则必须根据籽粒测定结果进行选择后再于下季进行配组，严重影响育种进 度，因此如果能筛选出稳定可靠的溶剂保持力(SRC)分子标记并且在育种 中加以应用将会促进弱筋小麦育种效率的提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种与小麦面粉水溶剂保持力关联 的分子标记及分子标记方法，为小麦面粉水溶剂保持力在品质育种中的分子 标记辅助选择提供一条可行的途径。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种与小麦面粉水溶剂保持 力关联的分子标记，所述分子标记是以小麦基因组DNA为底物，以gwm642-1D 为SSR引物，进行PCR扩增所得的扩增片段，用于检测小麦面粉水溶剂保持 力的特性，该标记不同的等位变异能够解释该性状表型变异的 10.57-15.68％，其中，分子量大小为202bp的条带对小麦面粉水溶剂保持力 的提高具有增效作用，分子量大小为188bp的条带对小麦面粉水溶剂保持力 的降低具有增效作用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种与小麦面粉水溶剂保持 力关联的分子标记方法，包括：

(1)PCR反应体系为：总计10μl，包括4ng/μl模板DNA，1×PCRbuffer， 2mmol/LMg2+，0.2μmol/L荧光引物，25mmol/LdNTP，0.6U/μl Taq-DNATaq  DNA聚合酶；

(2)扩增程序为：94℃预变性5min，前两个循环94℃变性45s，65℃退 火45s，72℃延伸55s，随后每两个循环退火温度降2℃，直至55℃，保持 退火温度55℃扩增25个循环，最后72℃延伸10min，然后降至4℃保存；

(3)扩增产物检测：在扩增产物中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，用70％ 乙醇洗涤，然后溶解于30μl无离子水中，用DNA测序仪ABI3730进行分析， 通过GeneMapper3.0进行扩增条带的读取。其中分子量大小为202bp的条带 对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188bp的条带 对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述分子标记的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物 序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的有益效果是：

1、由于溶剂保持力是通过小麦收获后籽粒来检测面粉的特性，在育种 中难以在田间直接筛选，而与溶剂保持力相关联的标记可以利用叶片尽早进 行DNA检测来预测和筛选；

2、本发明通过关联分析定位了与面粉水溶剂保持力极显著相关联的SSR 分子标记gwm642-1D(位于roder发表的小麦遗传连锁图1D的75cM处,参考 文献：MS，Korzun V，Wendehake K，Plaschke J，Tixier MH，Leroy  P，Ganal MW.A microsatellite map of wheat.Genetics，1998，149(4)： 2007-2023)，可以解释水溶剂保持力表型变异的10.57-15.68％，检测程序简 单，适于杂交和回交育种中目的(供体)单株的确定，提高选择效率。

3、本发明提供了一种与小麦面粉水溶剂保持力极显著(p<0.01)相关 联的分子标记，使用的与小麦面粉水溶剂保持力相关联的分子标记在国内外 均未有发表过。利用该标记可对田间植株DNA进行小麦面粉溶剂保持力的分 子标记辅助选择，从而节约成本，提高育种效率。

附图说明

图1为3730DNA测序仪荧光标记结果，gwm642-1D等位变异188bp图；

图2为3730DNA测序仪荧光标记结果，gwm642-1D等位变异202bp图；

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。

实验例

一、试验材料：

试验收集了190个品种，在进行基因型分析时根据试验结果剔除了14 个亲缘关系过近的品种，实际用于关联分析的品种清单见表1。

表1：用于分析的176个品种

二、试验设计

以上材料分别于2008-2009年、2009-2010年和2010-2011年3个生长 季种植于江苏里下河地区农科所试验基地(江苏扬州湾头镇夏桥村)，田间 试验采用随机区组设计、3次重复，每个试验小区种植4行，每行40粒，粒 播。行长4尺，行距7寸，相邻的材料间留1空行间隔开。

三、基因型的检测

本试验利用了SSR标记和荧光SSR标记进行了基因型检测。

1、试验从834对SSR引物中筛选了多态性较好、带型清晰的引物共154 对(见表2)，对参试的176个品种进行了基因型检测，于2011年在江苏里 下河地区农科所完成。引物包括barc、cfa、cfd、gwm、gdm、wmc等类型。

1)田间采摘小麦苗期单株叶片，采用夏先春分子操作书中CTAB法提取 小麦基因组DNA，所用材料与具体步骤：

材料：小麦幼嫩叶片或成熟籽粒。

主要仪器：Eppendorf微量移液器、高速冷冻离心机、研钵、Eppendorf 管、恒温水浴锅、恒温摇床等。

试剂的配置

(1)CTAB抽提缓冲液：20g CTAB，1M Tris-HCl(pH8.0)100mL，0.5M EDTA(pH8.0)100mL，5M NaCl280mL，用蒸馏水定容至1000mL，灭菌后 加β-巯基乙醇至10mM。

(2)3M NaAc(pH5.2)。

(3)酚/氯仿/异戊醇按照25:24:1的比例配制，氯仿/异戊醇按照24:1 的比例配制，存放于-20℃备用(酚为Tris平衡酚)。

(4)异丙醇，无水乙醇，70％乙醇，灭菌ddH₂O或TE溶液。

操作步骤：

(1)取小麦幼嫩叶片1～2g，放入液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至 粉末状(样品数较多时，可使用高通量组织研磨器；样品量较少时，可以直 接将样品放入2.0mL的Eppendorf管中，加液氮，用筷子研磨；如样品为 成熟籽粒，机械粉碎至粉末状即可)。

(2)立即转移粉末至加有900μL提取液的2.0mLEppendorf管中， 充分混匀(不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂)，于65℃水浴10～30min， 并不时摇动。

(3)冷却至室温后，4℃，12000rpm离心15min。

(4)转移上清至另一无菌2.0mLEppendorf管中，加入等体积的酚/ 氯仿/异戊醇，轻轻颠倒Eppendorf管数次，静置10min后，4℃，12000rpm 离心10min。

(5)转移上清至另一无菌2.0mL Eppendorf管中，加入等体积氯仿/ 异戊醇，轻轻颠倒Eppendorf管数次，静置10min后，4℃，12000rpm离心 10min。

(6)转移上清至另一无菌1.5mL Eppendorf管中(切勿吸到中间层及 下层)，加入1/10体积的3M NaAc，充分混匀后，加入2/3体积的的异丙醇， 混匀，-20℃沉淀30min后，4℃，12000rpm离心10min。

(7)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤2次。4℃，12000rpm，离心 10min。

(8)弃上清，在超净台吹干(滤纸上慢慢倒扣，防止沉淀脱落)，加 入适量的灭菌ddH₂O或TE溶解DNA。

表2分析使用的SSR引物

表2分析使用的SSR引物

2)PCR反应体系为：总计10μl，包括10×PCRBuffer1μl，25mMMgcl₂1μl，2mMdNTPMixture0.2μl，引物工作液1.5μl，Taq-DNA聚合酶(5U/μl) 0.1μl，模板DNA1μl，无菌蒸馏水5.2μl。所述引物为：

上游引物：5'–ACGGCGAGAAGGTGCTC–3'

下游引物：5'–CATGAAAGGCAAGTTCGTCA–3'

3)扩增程序为：94℃预变性5min，前两个循环94℃变性45s，65℃退 火45s，72℃延伸55s，随后每两个循环退火温度降2℃，直至55℃，保持 退火温度55℃扩增25个循环，最后72℃延伸10min，然后降至4℃保存。

4)电泳为6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，将PCR扩增产物加入等体积的 Loading buffer，在PCR仪上95℃变性5分钟，快速取出并放至冰水混合物 2分钟以上备用，变性后的PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采 用银染法检测。

2、ABI3730荧光标记检测分析

取10株小苗叶片混合，在液氮中磨样。按照CTAB法提取全基因组DNA (和上面步骤一样)，用1×TE稀释至20ng·μl^-1备用。

本研究扫描了106个荧光SSR位点(见表3)。于2013年在中国农科 院作科所完成。

PCR反应体系为：总计10μl，包括4ng/μl模板DNA，1×PCRbuffer， 2mmol/LMg2⁺，0.2μmol/L荧光引物，25mmol/LdNTP，0.6U/μl Taq-DNATaq  DNA聚合酶；

扩增程序为：94℃预变性5min，前两个循环94℃变性45s，65℃退火 45s，72℃延伸55s，随后每两个循环退火温度降2℃，直至55℃，保持退火 温度55℃扩增25个循环，最后72℃延伸10min，然后降至4℃保存；

PCR扩增产物检测：在扩增产物中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，用 70％乙醇洗涤，然后溶解于30μl无离子水中，用DNA测序仪ABI3730进行 分析，通过GeneMapper3.0进行扩增条带的读取。

表3、用于检测的荧光SSR引物汇总表

四、溶剂保持力检测

1、溶剂保持力的测定

试剂：蒸馏水；

50％蔗糖溶液：称取50g蔗糖(分析纯)溶解于50g蒸馏水。

5％碳酸钠溶液：称取5g碳酸钠(分析纯)溶解于95g蒸馏水。

5％乳酸：将已知浓度的DL型乳酸(分析纯)，按一定配比添加蒸馏水 稀释至5％。

步骤：抽取参试品种收获后种子样品磨成全麦粉，然后进行包括水、5％ 乳酸、5％碳酸钠和50％蔗糖等4种SRC的检测，检测方法参照AACC56-11进 行，并按比例缩小至1克粉等。

原AACC56-11法如下：

1)量取蒸馏水、5％乳酸、5％碳酸钠溶液和50％蔗糖溶液制备检测溶 液；

2)称取5Oml离心管(包含管盖)的质量(M₁)；

2)准确称取5.000±0.05克面粉(其水分含量已知)放进已经称重的 离心管中；

3)将25.00±0.05克溶剂加入离心管中，同时开始按表计时；

4)将管盖扣紧，摇晃约5秒钟，使面粉悬浮；

5)使面粉与溶剂溶涨20分钟，并每隔5分钟(即5、10、l5、20分钟 时)各摇晃一次(每次约5秒钟)；

6)迅速将试验样品放入离心机，在1000g力条件下离心15分钟(不包 含到达1000g离心力前的时间)；

7)待离心机停稳后小心取出离心管，待上清液缓慢倒出后将试管垂直 倒置于吸水纸上静置10分钟；

8)再次称取离心管(包括管盖)的质量(M₂)；

9)计算各溶剂的SRC值。

本试验中按照标准法以1克粉样品用量按比例缩小；准确称量(1.000± 0.001)g全麦粉倒入10ml离心管中；随后加入5.00g所需溶液；待溶涨20min 后开始离心，期间每隔5min振荡一次(约5s)；离心后倒干上清液，并将离 心管倒立于吸水纸上静置10min后称重。

SRC值计算公式如下：

SRC％＝{[(离心管+盖子+凝胶的质量)-(离心管+盖子的质量)]/面粉质 量×86/(100-面粉水分)-1}×100

五、标记与性状的关联定位分析

对2009-2011的供试品种的四种SRC等品质性状分别进行关联定位分 析。采用了TASSEL2.1软件的GLM(generallinearmodel)模型，以个体 Q值为协变量将SRC值分别对标记变异进行回归分析，分析模型为：

Yj＝α+βIpj+β1X1j+β2X2j+...+βkXkj+εj

上述公式中的Yj表示第j个品系某性状的表型值，Ipj表示第j品种 第p个等位变异的指示变量，α为供试群体该位点各等位变异的平均效应， β为第j个品种第p个等位基因的效应，X1j～Xkj表示第j个材料基因组 变异源于第1～k群体的概率Q值，β1～βk表示亚群中各位点各等位变 异的平均效应，εj为残差。

六、结果

3年度关联定位分析共检测到18个SSR引物与溶剂保持力SRC极显著相 关联(P<0.01)。其中位于2B上的wmc592 3年度均被检测到，分别与乳酸 SRC、水SRC、碳酸钠SRC均极显著相关联，解释表型变异的5.3％-6.98％； 位于3D上的barc42 3年度均被检出，分别与水SRC和乳酸SRC极显著相关 联，解释表型变异的6.68％-10.0％；位于2A的wmc658两年度被检测到，与 乳酸SRC和水SRC极显著相关联，解释表型变异的10.81％-14.00％；位于3D 的cfd152两年度被检测到，均与乳酸SRC极显著相关，解释表型变异的 6.4％-7.93％。(表4)。

3年度定位结果表明不同溶剂保持力与荧光SSR引物极显著相关联的标 记有25个(表5)，其中gwm642-1D三年度均与水溶剂保持力极显著相关联， 表型解释率分别为10.57％、15.68％和13.11％。

表4、2009-2010年度与SRC显著相关联(P<0.01)的标记位点及其对表型变异的解释率(％)

表5、106个荧光标记3年度关联定位结果汇总

gwm642-1D的不同等位变异表型效应值根据F.Breseghello提出的无效 等位变异方法进行估算；SSR标记不同等位位点的表型效应值估算：ai＝Σ xij/ni－ΣNk/nk，其中ai表示第i个等位位点的表型效应值，xij为携有 第i个等位位点的第j个品种表型性状观察值，ni为携有第i等位位点的品 种数目；Nk为携有无效等位位点的第k个品种的表型观察值，nk为携有无 效等位位点的品种数目；当ai值大于0时可认为该位点为增效等位变异， 否则该位点为减效等位变异。计算结果表明，分子量大小为202bp的条带对 小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188bp的条带对 小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。(见图1、图2)

本申请的创新在于定位的gwm642-1D三年度均与水溶剂保持力极显著相 关联，表型解释率分别为10.57％、15.68％和13.11％。此前未见文献发表， 为利用分子标记进行水溶剂保持力的品质辅助筛选提供了技术支撑。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。