一种甜菜碱饲料添加剂质量综合评估方法

摘要

本发明公开了一种甜菜碱饲料添加剂质量综合评估方法，采用高效液相色谱法对甜菜碱饲料添加剂样品进行色谱分析，通过外标法对样品中的甜菜碱进行定量，并根据色谱出峰结果，判断样品中杂质的种类。本发明方法能全面的、综合性的反映出甜菜碱饲料添加剂的质量情况，避免了甜菜碱常用的几种检测方法的弊端和局限，具有以下优点：1、操作方法较简便易行，分析方法准确可靠，易于在饲料企业普及；2、能检测到甜菜碱饲料添加剂中含有的杂质成分，具有一定的鉴别能力，解决了检测产品中掺假的问题；3、检测过程避免了有毒化学试剂与人体的直接接触，减少了对人体的危害。

说明书

技术领域

本发明涉及一种甜菜碱饲料添加剂质量综合评估方法，属于饲料添加剂检测技术领域。

背景技术

甜菜碱为一种白色或微棕色结晶的化合物，是一种季胺型生物碱，广泛存在于动植物中，尤以甜菜糖蜜中含量最高。甜菜碱天然、无毒害、无污染、无残留、无致突变性，其生物效价可相当于蛋氨酸的三倍，50%氯化胆碱的1.8倍，能部分代替蛋氨酸和氯化胆碱，降低饲料成本。此外，其还具有抗病抗应激作用、提高畜禽生产性能、改善畜禽胴体性状、改善畜禽肌肉品质等作用。基于此，甜菜碱在畜牧业上具有广阔的应用前景，是一种十分重要的、安全的饲料添加剂。

因为甜菜碱的良好性能，其在饲料领域具有很好的应用，目前，有很多不法商贩为了降低成本，在甜菜碱中加入一些含氮化合物，以次充好，此外，甜菜碱含量不达标也对其质量产生较大影响。目前，饲料领域甜菜碱的检测方法有酸碱滴定法、比色法、重量法、薄层扫描定量法、凯氏定氮法、高氯酸非水滴定法、分光光度法、气相色谱法、离子色谱法等。在检测甜菜碱时，可根据实验室条件和测定要求选择适当的方法。目前执行的产品标准是GB/T 21515-2008《饲料添加剂天然甜菜碱》。其含量检测采用的是高氯酸非水滴定法，该法缺点：①该法采用结晶紫指示剂，终点颜色变化不明显，较难判定终点；②采用的高氯酸和冰醋酸有很强的腐蚀性；③高氯酸标准溶液放置过久会变成黄色，对化验室外部环境控制要求较高，受环境温度、湿度影响较大，要经常配制、标定。④利用此法进行检测只要样品中具有碱性基团的化合物如胺类、氨基酸类、含氮杂环化合物、某些有机碱的盐及弱酸盐、钠离子等，都会影响高氯酸非水滴定法检测的准确性。此法在检定纯品甜菜碱时非常有效和准确，但如有掺假时，此法很难辩其真伪。故此类产品含量检测需使用GB/T 21515-2008中仲裁法离子色谱法，但由于离子色谱价格较高，还需要关注色谱仪、色谱柱和抑制器的日常维护，维护成本也较高、因此离子色谱法在饲料企业不易普及。同时用离子色谱进行检测时还需注意标准溶液的保存期，注意峰面积的变化。用离子色谱测定时误差较大，如果谱图无误，还需用凯氏定氮法进行对照。用凯氏定氮法测定样品中的氮，通过甜菜碱和氮含量的换算公式得到甜菜碱的量，此法是饲料企业较常采用的方法，可减少空气污染对操作人员健康的危害，也可排除环境温度、湿度的变化对高氯酸非水滴定法的影响，但在检测纯品时检测误差比高氯酸滴定法高，并且不能排除含氮物质的干扰，也不能解决产品中掺假的问题。

发明内容

本发明针对上述几种检测方法存在的缺陷，提供了一种甜菜碱饲料添加剂质量综合评估方法，该方法依托于高效液相色谱检测法，能很好的检测出添加剂中甜菜碱的含量，也能检测出甜菜碱中的杂质种类，判断是否存在掺假现象，能较好、较全面的判断甜菜碱饲料添加剂的质量优劣。

本发明提供了一种高含量的甜菜碱饲料添加剂的质量综合评估方法，具体是采用以下技术方案实现的：

一种甜菜碱饲料添加剂质量综合评估方法，其特征是：采用高效液相色谱法对甜菜碱饲料添加剂样品进行色谱分析，通过外标法对样品中的甜菜碱进行定量，同时根据色谱出峰结果，判断样品中杂质的种类。该方法除了测定样品中甜菜碱含量外，还可以从多方面判断样品的质量，更便于对样品的质量、品质进行全面的综合性的评价。

进一步的，上述方法中，高效液相色谱所用的色谱条件为：

检测器：紫外检测器；

色谱柱：ODS C18反相色谱柱；

流动相：甲醇、水、磷酸的混合物，其中甲醇与水的体积比为10:90，磷酸的用量为甲醇与水总体积的0.2%；

柱温：30℃；

波长：210-215nm；

流速：0.8-1.0ml/min；

样品进样量:15μl；

进样的样品浓度: 0.5-14mg/ml。

进一步的，上述方法中，外标法检测样品中甜菜碱含量时，计算公式如下：

   其中：W—样品中甜菜碱的质量分数；A_样—样品中甜菜碱的峰面积；A_对—甜菜碱对照品的峰面积；M_对—甜菜碱对照品的质量；M_样—甜菜碱样品的质量；P—甜菜碱对照品的纯度。

进一步的，上述方法中，样品用流动相溶解。

本发明在甜菜碱饲料添加剂检测中引入高效液相色谱检测法，目前还没有采用高效液相色谱检测甜菜碱饲料添加剂的技术公开。高效液相是实验室常用的检测仪器，大多饲料企业都具备该仪器，操作方法简便易行，分析方法准确可靠，易于在饲料企业普及。通过研究筛选出适合检测高纯度的饲料添加剂甜菜碱的最佳的色谱条件，从而使该方法能很好的对甜菜碱进行定量，还能辨别出饲料添加剂甜菜碱中是否含有其他成分，判断添加剂中是否存在甜菜碱掺假情况。

本发明方法能全面的、综合性的反映出甜菜碱饲料添加剂的质量情况，避免了甜菜碱常用的几种检测方法的弊端和局限，具有以下优点：1、操作方法较简便易行，分析方法准确可靠，易于在饲料企业普及；2、能检测到甜菜碱饲料添加剂中含有的杂质成分，具有一定的鉴别能力，解决了检测产品中掺假的问题；3、检测过程避免了有毒化学试剂与人体的直接接触，减少了对人体的危害。

具体实施方式

下面进一步对本发明方法以及实验条件的筛选过程进行说明，以证明本发明方法的优异性和非显而易见性。

下述实施例中，所用仪器和试剂如下：

Lc-20AT高效液相色谱仪：（岛津）：

色谱柱：VP-ODS 150mm×4.6 mm  5μm，（岛津）；

检测器：SPD-20A紫外检测器（岛津）；

电子天平：万分之一（岛津）；

实验试剂：甜菜碱标准样品(98．0％，国药集团化学试剂有限公司)；

甲醇(色谱纯，J.T.Baker)；

磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；

磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

实验用水均为二次去离子水再经石英制备的高纯水。

实施例1 对适合的波长进行筛选

采用UV2600自动分光光度计，在200～260 nm范围内，对甜菜碱水溶液进行波长扫描，结果见图1。从图中可以看出，甜菜碱在210nm-215nm有最大吸收，可以选择此范围内的任一波长作为检测波长，以下实施例中选择214nm作为检测波长。

实施例2对适合的流动相进行筛选的部分实验

1、色谱条件

检测器：SPD-20A紫外检测器；

色谱柱：VP-ODS （即ODS C18反相色谱柱）；

流动相为下述任一种：1、乙腈：水（10:90体积比）；2、乙腈：水（30:70体积比）；3、乙腈：水（50:50体积比）；4、甲醇：水（10:90体积比）；5、甲醇：水（30:70体积比）；6、甲醇：水（50:50体积比）； 7、乙腈：20mmol/l的磷酸二氢钾水溶液（10:90体积比）；8、乙腈：30mmol/l的磷酸二氢钾水溶液（10:90体积比）；9、甲醇：20mmol/l的磷酸二氢钾水溶液（10:90体积比）；10、甲醇：30mmol/l的磷酸二氢钾水溶液（10:90体积比）；11、乙腈：水（10:90体积比），另加乙腈和水总体积0.1%的磷酸；12、乙腈：水（10:90体积比），另加乙腈和水总体积0.2%的磷酸；13、甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.05%的磷酸；14、甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.1%的磷酸；15、甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.2%的磷酸；16、甲醇：水（30:70体积比），另加甲醇和水总体积0.3%的磷酸；17、甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.4%的磷酸；

柱温：30℃；

波长：214nm；

流速：1.0ml/min；

进样量：15μl。

、测定方法

2.1精密称定0.5g甜菜碱样品，加流动相溶解并定容至50ml。

2.2将配好的样品溶液注入高效液相色谱仪中，获得色谱图。

按照上述方法，分别采用上述十七组不同的流动相检测样品，实验结果显示：使用第1-6组的流动相时，甜菜碱均能出峰，但是峰型极差，根本无法定量。其中，甲醇：水（10:90体积比）的流动相的液相色谱图如图2所示。第7-10组是加入缓冲盐磷酸二氢钾的流动相，但是加入磷酸二氢钾后峰型仍很差，仍无法定量。其中，第9组的流动相的液相色谱图如图3所示。 

通过实验结果反映的规律，发现流动相的组成、酸度对峰型有很大影响，经反复试验发现流动相为体积比为10:90的乙腈或甲醇与水的混合物+0.2%磷酸时峰型最好。当磷酸添加量为0.2%（体积比）时，此时甜菜碱主峰拖尾因子为0.591，分离度为1.946，理论塔板数为5024.197，完全符合定量要求。无论水-乙腈体系还是水-甲醇体系添加0.2%的磷酸做为流动相，均能实现定量要求。第15组流动相的液相色谱图如图4所示。

实施例3

1、色谱条件

检测器：SPD-20A紫外检测器；

色谱柱：VP-ODS （即ODS C18反相色谱柱）；

流动相为下述任一种：1、乙腈：水（10:90体积比），另加乙腈和水总体积0.2%的磷酸；2、甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.2%的磷酸；

柱温：30℃；

波长：214nm；

流速：1.0ml/min；

进样量：15μl；

2、测定方法

2.1精密称定0.5g甜菜碱样品，加流动相溶解并定容至50ml。

2.2将配好的样品溶液注入高效液相色谱仪中，获得色谱图。

甲醇-水体系所得的色谱图如图6所示。乙腈-水体系所得的色谱图如图5所示， 从图中可以看出，虽然水-乙腈体系和水-甲醇体系添加0.2%的磷酸做为流动相均能实现甜菜碱定量要求，但是选择水-甲醇体系添加0.2%的磷酸做为流动相时，甜菜碱中的杂质羟基乙酸、氯乙酸能明显出峰，且峰型较好，易于辨别上述两种杂质，而水-乙腈体系时杂质不好辨别。由此可以看出，水-甲醇体系添加0.2%的磷酸做为流动相时能更为全面的反映出产品的质量优劣。因此优选水-甲醇（10:90体积比）体系，另加总体积0.2%的磷酸做为流动相。

实施例4 对适合的样品浓度进行筛选

1、色谱条件

检测器：SPD-20A紫外检测器；

色谱柱：VP-ODS （即ODS C18反相色谱柱）；

流动相为下述任一种：甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.2%的磷酸；

柱温：30℃；

波长：214nm；

流速：0.8ml/min；

进样量：15μl。

、测定方法

精密称定甜菜碱对照品，用流动相分别配置成不同浓度的甜菜碱溶液，其浓度见表1。按照上述色谱条件将各浓度的试样分别进行色谱检测，所测得的各试样的峰面积见表1。

以峰面积A为纵坐标，以浓度C(mg/ml)为横坐标，建立甜菜碱工作曲线，如图7所示。从图中可以看出，甜菜碱在浓度为0.5～14 mg/mL范围内呈线性关系，其线性回归方程为Y=353999x-31820,R²=0.9995，其线性良好，完全符合定量要求。本发明采用单点外标法，故选择进样浓度为10mg/ml。

实施例5 

从上述实验可以看出，本发明最佳的检测条件为：

检测器：紫外检测器；

色谱柱：VP-ODS （即ODS C18反相色谱柱）；

流动相：甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.2%的磷酸；

柱温：30℃；

波长：214nm；

流速：1.0ml/min；

进样量：15μL；

样品浓度：10mg/ml。

对上述最佳检测条件进行准确度考察实验，方法如下：

精密称取甜菜碱对照品200mg、300mg、400mg、500mg、600mg,加入适宜的辅料，配置成不同含量的产品见表2。按含量测定方法测定，回收率= 测定量÷加标量×100%。结果见表2。

从表2可以看出本发明方法准确度良好。

实施例6

取杭州万景新材料有限公司、南京泽朗医药科技有限公司、郑州天耀科技有限公司销售的甜菜碱饲料添加剂，编号分别为1#、2#、3#，采用本发明方法对这三种产品的质量进行分析评估，方法如下：

1、色谱条件

检测器：紫外检测器；

色谱柱：VP-ODS （即ODS C18反相色谱柱）；

流动相：甲醇：水（10:90体积比），另加甲醇和水总体积0.2%的磷酸；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：15μL。

甜菜碱对照样品(98．0％，国药集团化学试剂有限公司)。

、测定方法

2.1精密称定0.5g甜菜碱样品，加流动相溶解并定容至50ml，另称取甜菜碱对照品0.5g，用流动相溶解并定容至50ml。

2.2将配好的样品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，根据样品色谱图中的峰面积和对照品中峰面积,采用外标法进行定量计算，每种样品平行连续测定5次。计算结果见表3。

以上厂家生产的甜菜碱含量均符合要求，且未见其他明显杂质峰。

实验证明，本发明的一种甜菜碱含量的检测方法，分析方法准确可靠，操作简便易行，易于普及。还能检测到甜菜碱中的某些杂质成分，具有一定的鉴别能力，同时解决了检测产品中掺假的问题，并且检测过程避免了有毒化学试剂与人体的直接接触，减少了对人体的危害。