一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法

摘要

一种取材便利、成本低、重复性好以及无畸形芽的利用大白菜球叶叶片获得再生植株的方法。其特征包括以下步骤：(1)选取结球期大白菜外部球叶，在无菌条件下消毒灭菌。(2)将灭菌后的叶片正面向上平置于芽诱导培养基上进行培养。(3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，转入MS基本培养基中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转入生根培养基诱导生根。(4)再生芽基部形成大量毛根后，将再生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。本方法直接从田间生长植株取材，不需要经过种子萌发过程，对及时保存优良珍贵大白菜材料意义重大，同时为大白菜转基因育种研究提供稳定的受体新材料。

说明书

技术领域

本发明涉及大白菜组织培养技术领域，特别涉及一种取材便利、 成本低、重复性好以及无畸形芽的利用大白菜球叶获得再生植株的培 养方法。

背景技术

大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour)Olsson)是我 国栽培面积最大的十字花科芸薹属植物，在全国蔬菜生产和消费中一 直处于重要地位。目前生物技术在提高大白菜育种效率中的作用日益 凸显。组织培养作为最重要的生物技术手段之一，对大白菜种质材料 的保存和快繁，以及在基因工程育种中获得大量稳定的转基因植株具 有重要意义。大白菜属于芸薹属AA基因组，携带有抑制芽再生的基 因，较属内其他基因组型离体再生难度大。不同品种之间再生频率也 存在较大差异。

此外，大白菜的商品性状往往在结球后期才能充分的表现，对田 间材料的综合性状调查也主要集中于该时期。若能在此时对发现的优 良材料进行及时保存与扩繁，则能提前对优良大白菜材料展开育种利 用。而目前的再生方法往往无法及时保存珍贵优良的种质材料，并且 对于转基因获得成功的材料不能及时扩繁，无法为后续的研究提供大 量研究材料，制约了大白菜生物技术育种的发展。

前人采用子叶、子叶柄-子叶、下胚轴、花器官(Pernell等，2002； 孙宝娟等，2005)等外植体通过诱导不定芽获得大白菜再生植株；采 用小孢子、花药、原生质体培养通过诱导胚获得再生植株。在目前建 立的再生体系中最常用的外植体为子叶柄-子叶，在此基础上，不同 研究者以保留不同比例子叶的子叶柄-子叶外植体进行再生，研究结 果差异较大。而子叶柄-子叶外植体只能一次性取材，每次获得的外 植体数量有限。

大白菜真叶再生国内外研究较少。成细华等(2001)首先利用苗 龄为3周的无菌苗顶部第2-3片嫩叶为外植体，切割为2-4mm见方， 通过诱导愈伤组织获得不定芽。在刘学成等(2011)的研究中，当大 白菜无菌苗长出第2片真叶时，以第1片真叶的叶柄插入培养基，从 叶柄基部诱导获得不定芽；而将真叶片切割为5mm见方，平铺在诱 导培养基上则无不定芽分化。目前尚未见利用成株大白菜结球叶片进 行植株再生的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种取材便利、成本低、重复性好以及无畸 形芽的利用大白菜球叶叶片获得再生植株的方法。省去以往大白菜组 织培养过程中的无菌苗培养环节，使田间发现的优良植株及搜集的珍 贵材料能够得到及时保存和扩繁，并为大白菜基因工程研究提供新的 受体。

本发明的技术方案是：一种利用大白菜球叶获得再生植株的方 法，其特征在于包括以下步骤：

1)选取结球期大白菜外部球叶，去掉叶柄。在无菌条件下，先 用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量 分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌水轻轻漂洗15min，期间换 水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸将叶片残留水分吸干。

2)将灭菌后的叶片切分为边长1.5-2.0cm的叶块，避开较粗叶脉， 叶正面向上平置于芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光 周期16h/d，温度24±1℃条件下进行培养。

3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，之后转入MS基本培 养基(表2)中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽 切下，转入生根培养基诱导生根。以上培养条件均为：光照强度 1500-2000Lux，光周期16h/d，温度24±1℃。

4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再 生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质 采用蛭石和草炭体积比1∶1混合而成。盆口用保鲜薄膜覆盖保湿。 3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐加 大。覆膜培养10d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。 基质栽培过程中，均给予自然光照。

步骤2)中所述的芽诱导培养基为MS+4mg/L6-BA+1mg/L NAA+4mg/LAgNO₃+30g/L蔗糖+0.7mg/L琼脂，pH为5.8。

步骤3)中所述的生根培养基为MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖 +0.7mg/L琼脂，pH为5.8。

本发明的有益效果是：本发明以大白菜球叶叶片为外植体，对诱 导培养基中6-BA与NAA浓度配比进行了优化。较传统大白菜组织 培养过程简化，省去了无菌苗培养环节，节省了时间。培养过程简单， 外植体在添加激素的诱导培养基培养28d后，可直接放到无任何激素 的MS基本培养基上继续诱导不定芽，节省了激素用量，降低了组织 培养成本。取材便利，外植体制备量大，对及时保存珍贵材料具有重 要应用价值。同时本发明为大白菜转基因育种提供新的转化受体，也 为转基因植株的迅速扩繁提供高效的再生途径，具有广泛的应用前 景。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1为‘新北京三号’大白菜消毒后的球叶叶片接种于芽诱导培养 基图片；

图2为‘新北京三号’大白菜叶片在芽诱导培养基中培养7d的图 片，叶片边缘膨大，形成不定根；

图3为‘新北京三号’大白菜叶片在芽诱导培养基中培养14d的图 片，萌发不定根的叶缘处形成愈伤组织；

图4为‘新北京三号’大白菜叶片在芽诱导培养基中培养14d的图 片(底部)，不定根基部形成较大愈伤团；

图5为‘新北京三号’大白菜叶片在芽诱导培养基中培养22d的图 片，由叶缘愈伤组织处诱导形成若干不定芽；

图6为‘新北京三号’大白菜叶片在MS基本培养基中培养15d 的图片，不定芽叶片伸长，增大；

图7为‘新北京三号’大白菜叶片再生芽在生根培养基中培养10d 的图片；

图8为‘城阳青’大白菜叶片再生芽在生根培养基中培养15d的图 片；

图9为‘新北京三号’大白菜球叶再生植株转移到栽培基质中培 养10d后的图片；

图10为‘城阳青’大白菜球叶再生植株转移到栽培基质中培养10d 后的图片。

具体实施方式

一种利用大白菜球叶获得再生植株的方法，包括以下步骤：

1)选取结球期大白菜外部球叶，去掉叶柄。在无菌条件下，先 用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量 分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌水轻轻漂洗15min，期间换 水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸将叶片残留水分吸干。

2)将灭菌后的叶片切分为边长1.5-2.0cm的叶块，避开较粗叶脉， 叶正面向上平置于芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光 周期16h/d，温度24±1℃条件下进行培养。

3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，之后转入MS基本培 养基(表2)中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽 切下，转入生根培养基诱导生根。以上培养条件均为：光照强度 1500-2000Lux，光周期16h/d，温度24±1℃。

4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再 生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质 采用蛭石和草炭体积比1∶1混合而成。盆口用保鲜薄膜覆盖保湿。 3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐加 大。覆膜培养10d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。 基质栽培过程中，均给予自然光照。

步骤2)中所述的芽诱导培养基为MS+4mg/L6-BA+1mg/L  NAA+4mg/LAgNO₃+30g/L蔗糖+0.7mg/L琼脂，pH为5.8。

步骤3)中所述的生根培养基为MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖 +0.7mg/L琼脂，pH为5.8。

实验1：

1)选取结球期大白菜‘新北京三号’和‘城阳青’两个品种的外部球 叶，去掉叶柄。在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒 30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量分数5％的NaClO溶液灭菌10min， 无菌水轻轻漂洗15min，期间换水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸 将叶片残留水分吸干。

2)将灭菌后的叶片切分为边长1.5-2.0cm的叶块，避开较粗叶脉。 叶正面向上平置于不同6-BA/NAA配比(表1)，附加4mg/L AgNO₃的芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光周期16h/d，温度 24±1℃条件下进行培养。每个处理30-35个外植体，重复三次。4周 后统计不定芽再生情况。

表1 不同6-BA与NAA浓度配比对大白菜不定芽再生的影响

注：采用LSD法进行多重比较，同列数据后字母相同者表示在 5％水平上差异不显著。

表2 MS基本培养基配方

培养基为MS基本培养基+4mg/L AgNO₃+30g/L蔗糖+0.7mg/L琼 脂，pH均为5.8。基本培养基配方见表2。

不定芽再生率(％)＝有不定芽再生的外植体数/接种外植体总数 ×100％

芽/外植体(个)＝具有独立生长点的再生不定芽数/接种外植体总 数

由表1可知，培养基中只有6-BA存在时，不能诱导出不定芽。 培养基中6-BA为4mg/L，NAA为1mg/L时，‘新北京三号’和‘城阳 青’两个品种叶片不定芽再生率均达到最高，分别为88.46％和 73.77％。在该浓度组合下，‘新北京三号’每个外植体平均再生芽数最 高，显著高于其他浓度组合；‘城阳青’每个外植体平均再生芽数为 1.64，低于6-BA4mg/L，NAA0.5mg/L时平均再生芽数1.72，但两者 无显著差异。在本实验中，两个品种在MS+4mg/L6-BA+1mg/L  NAA+4mg/LAgNO₃+30g/L蔗糖+0.7mg/L琼脂的培养基中再生效果最 好。将该培养基定为本发明后续实验中的芽诱导培养基。

实验中观察到，外植体在添加NAA的培养基中首先诱导大量不 定根。培养12-14d后，在不定根基部发生浅绿色愈伤组织。培养20 天后可见明显不定芽叶形成。而在不含NAA的培养基中，只诱导形 成绿色致密愈伤，无不定根形成，后期也无不定芽形成。

3)外植体在芽诱导培养基中培养28d，之后转入MS基本培养 基中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转入 MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+0.7mg/L琼脂的生根培养基诱导生根。 以上培养条件均为：光照强度1500-2000Lux，光周期16h/d，温度 24±1℃。

在本实验中，若外植体在芽诱导培养基上连续继代，诱导的不定 芽叶片增多，但畸形叶比例较大，并出现玻璃化现象。因此，我们将 外植体在含有激素的培养基上诱导28天(4周)之后，转入不含激 素的MS基本培养基，此时外植体已有较多不定芽形成，且已从诱导 培养基中吸收了一定量的6-BA和NAA，在MS基本培养基上能够维 持不定芽后期的生长，并仍能诱导形成新的不定芽。不定芽在MS基 本培养中生长正常，生长点明显，极少玻璃化，且伸长较迅速。此方 法简化了组织培养成本，简化了操作，并有利于不定芽的正常生长。

4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再 生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质 采用蛭石和草炭体积比1∶1混合而成。盆口用保鲜薄膜覆盖保湿， 3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐加 大。覆膜培养10d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。 基质栽培过程中，均给予自然光照。

实验2：

1)从田间获取结球期大白菜‘新北京三号’的叶球，塑料薄膜包 裹。在4℃条件下放置30h。取去掉叶柄的球叶，在无菌条件下，先 用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌水漂洗一遍。再倒入质量 分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌水轻轻漂洗15min，期间换 水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸将叶片残留水分吸干。

2)将灭菌后的叶片切分为边长1.5-2.0cm的叶块，避开较粗叶脉， 叶正面向上平置于芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光 周期16h/d，温度24±1℃条件下进行培养。重复三次。

3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，之后转入MS基本培 养基中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转 入生根培养基诱导生根。以上培养条件均为：光照强度1500-2000Lux， 光周期16h/d，温度24±1℃。

4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再 生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质 采用蛭石和草炭体积比1∶1混合而成。盆口用保鲜薄膜覆盖保湿。 3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐加 大。覆膜培养10d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。 基质栽培过程中，均给予自然光照。

5)实验结果分析

由表3可知，低温处理30h后，‘新北京三号’平均不定芽再生率 为79.34％，较未处理前(实验1)略有下降，但仍维持较高水平。

表3 低温(4℃)处理30h后‘新北京三号’球叶不定芽再生情况

本实验证明大白菜叶球在短时间低温保存后，叶片再生效果与常 温时相差不大。对于不能及时消毒接种的材料可短期低温保存，增加 了实验操作的灵活度。

实验3：

1)选取春大白菜品种‘强春’、‘菊锦’结球期外部球叶，去掉叶柄。 在无菌条件下，先用体积分数70％的酒精表面消毒30s，无菌水漂洗 一遍。再倒入质量分数5％的NaClO溶液灭菌10min，无菌水轻轻漂 洗15min，期间换水5-6次。消毒完毕，用灭菌吸水纸将叶片残留水 分吸干。

2)将灭菌后的叶片切分为边长1.5-2.0cm的叶块，避开较粗叶脉， 叶正面向上平置于芽诱导培养基上。在光照强度1500-2000Lux，光 周期16h/d，温度24±1℃条件下进行培养。重复三次。

3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，之后转入MS基本培 养基中继续培养。将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转 入生根培养基诱导生根。以上培养条件均为：光照强度1500-2000Lux， 光周期16h/d，温度24±1℃。

4)再生芽基部形成大量毛根后，打开培养瓶盖炼苗4-5d，将再 生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。基质 采用蛭石和草炭体积比1∶1混合而成。盆口用保鲜薄膜覆盖保湿。 3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔数逐渐增加，孔隙逐渐加 大。覆膜培养10d后，揭去保鲜薄膜，将再生植株置于室温下培养。 基质栽培过程中，均给予自然光照。

5)实验结果分析

由表4、表5可知，‘强春’平均不定芽再生率为71.61％，平均每 个外植体再生芽数为1.44个。‘菊锦’平均不定芽再生率为57.82％， 平均每个外植体再生芽数为1.57个。

表4 ‘强春’球叶不定芽再生情况

表5 ‘菊锦’球叶不定芽再生情况