一种赖草属植物根尖染色体制片方法

摘要

本发明涉及一种赖草属植物根尖染色体制片方法，该方法包括以下步骤：⑴取材：赖草种子恒温萌发后5~7日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根并将其放入离心管中；⑵装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通N

说明书

技术领域

本发明涉及细胞遗传学领域中植物染色体中期分裂相标本的制备方法，尤其涉及一种赖草属植物根尖染色体制片方法。

背景技术

染色体是细胞核中的遗传物质，不同物种的染色体都有相对稳定而又特定的形态结构。染色体制片是细胞遗传学研究的基本方法，是研究生物遗传变异、物种演化、分类、远缘杂交以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段。植物染色体制片的基本流程包括取材、预处理、固定、解离、染色、制片及镜检等。染色体制片是以体细胞分裂中期染色体为研究对象，但分裂中期持续的时间很短，需要对材料进行合适的预处理，使染色体停留在分裂中期。预处理对染色体制片的质量至关重要，是染色体制片成败的关键步骤。

传统的预处理方法主要有：低浓度的秋水仙素溶液法，饱和的对二氯苯水溶液法，低浓度的8-羟基喹啉溶液法，α-溴萘的饱和水溶液法，低温法等。秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉、α-溴萘等药物具有阻止或破坏纺锤体形成的作用，毒性大，易对实验人员造成伤害。而低温法，实验时间长，一次处理需要24至64小时，且效果不稳定。20世纪中叶，?stergren发现笑气具有阻止微管形成的作用，可用于制备植物染色体中期分裂相标本。与传统方法相比，高压笑气法具有两大优点：短时间内可获得更多的分裂相细胞，安全、低毒、对实验人员身体损害小。

赖草属（Leymus Hochst.）的植物是适应性较广的禾草，稍喜湿润，又颇耐干旱，还能适应轻度盐渍化的生境。土壤生态适应幅度广，从暖温带、中温带的森林草原到干草原、荒漠草原、草原化荒漠以及4500米以上的高寒地带都有分布。该属多数种类是畜牧业上的优良牧草，通过引种驯化，可培育为适应我国西北干旱地区、轻盐渍化土壤刈牧兼用的栽培草种。赖草属的植物除作饲用外，根可入药，具有清热、止血利尿作用；又可用作防风固沙或水土保持草种。赖草属植物的一些种具有穗长、粒大、抗逆强的特点，还是小麦等作物现代育种的基因资源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、安全的赖草属植物根尖染色体制片方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种赖草属植物根尖染色体制片方法，包括以下步骤：

⑴取材：赖草（L. secalinus）种子在25℃恒温条件下萌发后5~7日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根1.5~2cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中；

⑵在25~27℃条件下，将所述步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.4~0.8MPa N₂O进行预处理，3~3.5h后即得预处理后的新根；

⑶将所述预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定20~24h，得到固定后的新根；

⑷将所述固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离2~10min，得到解离后的新根；

⑸将所述解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区0.5~1.5mm，取分生区0.5~1.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走所述薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在所述盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压所述盖玻片使细胞充分分散，得到压片；

⑹将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

所述步骤⑵中预处理过程是指压强按恒定值的方式通入N₂O进行或压强按梯度递增的方式通入N₂O进行。

所述步骤⑶中的卡诺氏液是由无水乙醇与冰醋酸按3mL：1 mL的比例混合而成。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用高压笑气对实验材料进行预处理，处理效果稳定，制片成功率高，较其它传统方法，取样时间不受限制，处理时间由几十小时缩短为几小时。同时，本发明预处理过程所用试剂安全、低毒、对实验人员身体损害小。

2、本发明获得的染色体样片经镜检和显微检测，可以发现染色体形态好且分散好的细胞比较多（参见图1），可用于荧光原位杂交实验，为赖草基因资源利用、遗传育种等后续研究奠定良好基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明赖草（L. secalinus）的染色体镜检结果和显微照相示意图。

具体实施方式

实施例1    一种赖草属植物根尖染色体制片方法，包括以下步骤：

⑴取材：赖草（L. secalinus）种子在25℃恒温条件下萌发后5日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根1.5cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在25℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.4MPa N₂O进行预处理，3h后即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定20h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液是由无水乙醇与冰醋酸按3mL：1 mL的比例混合而成。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离2min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区0.5mm，取分生区0.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例2    一种赖草属植物根尖染色体制片方法，包括以下步骤：

⑴取材：赖草（L. secalinus）种子在25℃恒温条件下萌发后7日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根2cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在27℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.8MPa N₂O进行预处理，3.5h后即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定24h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离10min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1.5mm，取分生区1.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例3    一种赖草属植物根尖染色体制片方法，包括以下步骤：

⑴取材：赖草（L. secalinus）种子在25℃恒温条件下萌发后6日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根1.8cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在26℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，通入0.6MPa N₂O进行预处理，3.2h后即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定22h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离6min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1mm，取分生区1mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例4    一种赖草属植物根尖染色体制片方法，包括以下步骤：

⑴取材：赖草（L. secalinus）种子在25℃恒温条件下萌发后5日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根1.5cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在25℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，先通入0.4MPa N₂O处理50min，然后在同一温度下继续通入N₂O，使其分压达到0.8MPa，继续处理2h10min，即得预处理后的新根。

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定20h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离2min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区0.5mm，取分生区0.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

实施例5    一种赖草属植物根尖染色体制片方法，包括以下步骤：

⑴取材：赖草（L. secalinus）种子在25℃恒温条件下萌发后7日，取生长旺盛的盆栽赖草的白色新根2cm，并将其放入一个敞口的1.5mL的内壁附着水分的离心管中。

⑵在27℃条件下，将步骤⑴中装有根尖的离心管置于高压容器装置内，先通入0.4MPa N₂O处理1h，然后在同一温度下继续通入N₂O至分压达到0.7MPa，处理2.5h，即得预处理后的新根

⑶将预处理后的新根用滤纸吸干水分，采用卡诺氏液固定24h，得到固定后的新根。

其中：卡诺氏液同实施例1。

⑷将固定后的新根用蒸馏水漂洗3次，吸干水分后在体积浓度为45%的冰乙酸中解离10min，得到解离后的新根。

⑸将解离后的新根中的水分吸干后置于载玻片上，用干净的刀片去掉根尖的最前端的根冠区1.5mm，取分生区1.5mm的长度，加一滴体积浓度为45%的冰乙酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫一薄刀片，用镊子的基部轻轻敲击盖玻片，使组织成为一薄层，取走薄刀片，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压盖玻片使细胞充分分散，得到压片。

⑹将压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相，以便进行荧光原位杂交，最后用玻璃刀做好盖玻片位置的标记，将做好的片子放入-80℃的冰箱保存即可。

上述实施例1~5中的用于预处理的高压容器装置是指中国科学院西北高原生物研究所研发的专利号为ZL201320543644.6的用于植物染色体制备预处理的自动计时控温控压装置。