绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种绿豆尾孢菌叶斑病的抗病性快速鉴定方法，该方法为将绿豆种子进行表面消毒，将表面消毒后的绿豆种子点播到培养盘内；光照黑暗交替下培养，并定期观察绿豆苗生长情况；采集绿豆两叶一心期的叶片，清水洗净后放吸水纸上，并与吸水纸放入盒中保持湿润，在叶片上用牙签造成小伤口并接种6mm的菌饼，在温室条件下光照，观察其发病情况，本发明的鉴定体系是在培养室中观察发病情况。已有的观察和研究表明，病原菌的活动受到温度、光照等环境因素的影响。由于培养室的环境条件较稳定，加之本发明的鉴定体系本身是一个完全封闭的系统，使得鉴定结果的重复性和可靠性得到保证。

说明书

技术领域

本发明涉及农业-植物保护技术领域，具体地指一种绿豆尾孢菌 叶斑病的抗病性快速鉴定方法。

背景技术

绿豆尾孢菌叶斑病由变灰尾孢菌(Cercospora canescens)引起， 主要侵染叶片，严重时也浸染茎和荚，在生长季碰到高湿天气尤为盛 行。绿豆尾孢菌叶斑病是绿豆生产上的毁灭性病害，发病初期叶片上 出现水渍状褐色小点，扩展后形成边缘红褐色至红棕色、中间浅灰色 至浅褐色的近圆形病斑。湿度大时，病斑上密生灰色霉层，病情严重 时，病斑融合成片，很快干枯。轻者减产20-50％，严重的高达90％ 以上。

目前对于绿豆尾孢菌叶斑病的防治主要是化学药剂防治。培育抗 病品种是控制该病最有效的方法之一，而建立快速简便的抗性鉴定体 系是进行绿豆尾孢菌叶斑病抗病育种的关键。

由于该病菌的分离培养和产孢比较困难，而品种抗病性鉴定研究 需要大量菌源，因此给绿豆抗病品种的鉴定和筛选带来了一定困难， 相关的研究报道也较少。

发明内容

本发明目的在于针对绿豆抗病育种的特点和现有技术的不足，建 立一种室内可重复、快速准确鉴定绿豆品种对尾孢菌叶斑病抗性的方 法。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种绿豆尾孢菌叶斑病的抗 病性快速鉴定方法，包括以下步骤：

1)挑选颗粒饱满，大小相似的绿豆种子进行表面消毒，备用；

2)将培养土装袋后进行高压灭菌，灭菌后的有机培养土分装到 培养盘内，将表面消毒后的绿豆种子点播到培养盘内；光照黑暗交替 下培养，并定期观察绿豆苗生长情况；

3)将尾孢菌菌株在V8果蔬汁培养基平板上，并将平板置于28℃ 恒温培养箱中活化7天，再用无菌的、直径6mm的打孔器在活化好的 菌种菌落生长边缘打孔，将菌丝面扣在新的V8蔬菜汁培养基中进行 扩大繁殖，以备接种。

4)采集绿豆两叶一心期的叶片，清水洗净后放吸水纸上，并与 吸水纸放入盒中保持湿润，在叶片上用牙签造成小伤口并接种6mm 的菌饼，在温室条件下光照，让叶子发病；一个品种做4个重复，每 个重复3片叶子，一组对照。

5)观察其发病情况，接菌7d后，测量叶片病斑大小，根据病斑 大小，进行分级，计算病情指数；其中0级：无可见侵染病斑；1级： 叶片上仅有小点状病斑，直径2mm以下；2级：病斑直径3mm以下， 边缘褐色；3级：直径3～6mm以上的中型斑，边缘褐色，中央有灰白 色坏死组织；4级：直径6mm以上的不规则型病斑，其中0、1级属于 抗病型，记以R，2级属于中间型，记以I，3、4级属感病型，记以S。

作为优选方案，所述步骤1)中，先用体积分数为75％的酒精消 毒2s，然后用质量分数1％的NaClO溶液消毒3min，最后无菌水洗3次。

作为优选方案，所述步骤3)中，V8果蔬汁培养基包括V8果蔬汁： 200mL/L、CaCO₃：3g/L、琼脂：20g/L。

本发明的有益效果在于：

1、本发明能直接观察绿豆苗的发病情况

2、本发明可在较短时间内连续鉴定较大数量的绿豆苗，有利于 大规模筛选绿豆尾孢菌叶斑病抗病种苗

3、本发明的鉴定体系是在培养室中观察发病情况。已有的观察 和研究表明，病原菌的活动受到温度、光照等环境因素的影响。由于 培养室的环境条件较稳定，加之本发明的鉴定体系本身是一个完全封 闭的系统，使得鉴定结果的重复性和可靠性得到保证。

4、本发明绿豆尾孢菌叶斑病抗病鉴定时容易进行人工控制，满 足不同试验需要。

5、本发明明确绿豆种子质量对于绿豆叶斑病的抗性，是绿豆抗 叶斑病的前提条件，为抗病亲本选择提供依据。选育抗尾孢菌叶斑病 的绿豆品种资源是最经济有效地方法。本发明为了从根本上减少尾孢 菌叶斑病对绿豆产量和质量的损失，从抗病育种的角度基于豆类叶斑 病现有的抗性鉴定方法，研究通过菌丝块接种离体叶片，旨在建立一 种室内可重复、快速准确鉴定绿豆品种对尾孢菌叶斑病抗性的方法。

附图说明

图1为灰尾孢高粱产孢形态图；

图2为V8果蔬汁培养灰尾孢形态图(扇变)；

图3为不同品种离体叶片室内抗病性测定结果图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明 的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

1、V8果蔬汁培养基配料及制作方法：

V8果蔬汁培养基配料：100％的蕃茄、胡萝卜、甜菜、菠菜、 生菜、西芹、西洋菜(watercress)及洋莞茜8种田园蔬菜汁。购买品 牌：金宝Campbell's。

固体V8果蔬汁培养基配料及制作方法：每升培养基中含有V8 果蔬汁：200mL、CaCO₃：3g、琼脂：15～20g。将各个材料按照比例 分装到250mL的三角瓶中，用1mol/L氢氧化钠调节pH值在6.5～7.0 之间，灭菌后使用。

液体V8果蔬汁培养基配料及制作方法：按照每升培养基中含有 V8果蔬汁：200mL、CaCO₃：3g的比例加入到250mL三角瓶中，调 节pH值到6.5～7.0之间，封口灭菌后使用。

2、病原菌分离和培养

2.1材料与设备

从田间采集到的具有典型灰斑病症状的发病绿豆病叶，携带回实 验室进行病原菌的分离。共长岭县、公主岭市、镇赉县、通榆县、前 郭县和洮南市等六个地方采集了叶斑病的标样。

配置好的体积分数为：75％的乙醇溶液、质量分数为1％的次氯 酸钠溶液、摩尔浓度为：1mol/L的氢氧化钠溶液；

灭过菌的纯水、V8蔬菜汁、燕麦片、新鲜的番茄、高粱米、琼 脂、碳酸钙等；

250mL三角瓶、50mL三角瓶、培养皿、烧杯、剪刀、镊子、玻 璃棒等。

2.2方法步骤

选取发病叶片，按常规组织分离法对发病的绿豆叶片进行单病斑 分离：

a.将从田间采集的发病叶片轻轻的冲洗干净，选取病健交界的组 织切成3mm×3mm的小块；

b.表面消毒：用镊子夹住剪好的小叶片在75％乙醇溶液中浸泡 2～3s，再用1％次氯酸钠消毒3min，后用灭菌水冲洗3次；

c.将表面消毒过的叶片放置于倒好的V8固体培养基平板上，在 28℃条件下培养。

d.根据菌落颜色、形态，将不同的菌落挑出，在V8培养基上转 接再纯化1～3次，纯化后的菌株在V8果蔬汁培养基平板上28℃培养。

2.3病原菌形态

灰尾孢引起的叶斑病斑点生于叶片的正反两面，近圆形或不规则 形，叶片斑点红褐色至暗褐色，或中央浅褐色，边缘暗褐色，叶背面 斑点浅褐色或者浅灰褐色。在V8液体培养基中接菌，摇菌20天后 观察孢子形态：分生孢子鞭形或蠕虫形，无色，有3-5～12个隔膜， 基部截形，顶端略尖，直或稍弯(图1)。这一观察结果与郭英兰描 述的寄生在豆科植物上的尾孢菌基本一致，故确认绿豆叶斑病的病原 菌为尾孢菌。

灰尾孢在培养过程中由于高频率的变异和基因重组而发生形态 上可辨识的表现型分离时，可出现扇形菌落(图2)。

3、室内与田间的抗病性测定

将绿玉翡翠、绿珍珠、十八罗汉、中绿一号等4个品种为实验材 料，采集两叶一心期的叶片，用自来水洗净备用，将塑料箱铺上适量 的吸水纸，用小喷壶均匀喷上一层水于纸上便于保湿。用直径6mm 的打孔器在V8培养基上的菌丝前沿取菌丝块，在每片叶片的正面中 部稍偏叶脉部位用牙签造成小伤口后，接种菌丝块，将有菌丝面朝下 贴着叶片的表面。用保险膜蒙在塑料箱上有利于保湿条件，放入温室 25℃条件下光照保湿培养。每个品种4个重复，每个重复3次。接种 病原菌后7d，按照0-4级的病害评价等级对绿豆苗进行病害等级鉴 定。

其中0级：无可见侵染病斑；1级：叶片上仅有小点状病斑，直 径2mm以下；2级：病斑直径3mm以下，边缘褐色；3级：直径3～6mm 以上的中型斑，边缘褐色，中央有灰白色坏死组织；4级：直径6mm 以上的不规则型病斑。其中0、1级属于抗病型，记以R(Resistant)，2 级属于中间型，记以I(Intermediate)，3、4级属感病型，记以 S(Susceptible)。鉴定结果见表1和图3。

表14个绿豆品种的抗病性结果

由上表可知，供试4个品种的平均病害等级与田间病害评价的结 果一致，证明应用本发明提供的鉴定方法能够快速、准确地区分绿豆 尾孢菌叶斑病的感病品种和抗病品种。

由此可见，关于品种抗病性鉴定，利用室内人工菌丝块接种，使 材料发病。实验结果表明，绿豆叶斑病的抗病性存在差异，其中培养 条件对发病程度有很大的影响。因此以后在对育种材料进行抗病性鉴 定时，应控制温度和湿度，提供具有实际育种意义的抗性评价。该方 法可以用来快速地筛选出抗尾孢菌叶斑病的绿豆品种，为以后的绿豆 生产提供上种子品系的选择提供参考。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施 例，这些实施例都属于本发明保护范围。