一种检测扎那米韦及含扎那米韦制剂中杂质的HPLC测定方法

摘要

本发明公开了一种检测扎那米韦及含扎那米韦制剂中杂质的HPLC测定方法，选用亲水作用色谱法（hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC）来分离扎那米韦及其有关物质，具体是以色谱柱为HILIC柱，流动相选自极性有机溶剂-缓冲盐溶液、极性有机溶剂-弱酸溶液或者极性有机溶剂水溶液，检测波长200nm~240nm等作为检查扎那米韦及含扎那米韦的相关制剂中杂质的测定方法。本发明的测定方法可快速准确的检测出扎那米韦的工艺杂质和降解产物，具有操作简捷、灵敏度高、重复性好、结果可靠的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测扎那米韦及含扎那米韦制剂中杂质的HPLC测定方法，属于药物杂质分析检测领域。

背景技术

扎那米韦由葛兰素史克公司研发，于1999年8月由美国FDA批准上市，主要用于治疗A型和B型流感，与罗氏公司研发的磷酸奥司他韦胶囊（商品名：达菲）为目前国际上公认的流感治疗药物。扎那米韦是自1993年金刚乙胺上市后第一个获得批准的流感治疗药，也是第一个神经氨酸酶抑制剂类流感病毒治疗药。其化学名为：5-乙酰氨基-4-[（氨基亚氨基甲基）-氨基]-2,6-氢-3,4,5-三去氧-D-丙三醇基-D-半乳糖-2-烯醇酸。分子式C₁₂H₂₀N₄O₇，相对分子量332.3。本品为白色或类白色粉末，20℃是水中的溶解度约为18mg/ml。

现有的扎那米韦杂质分析技术中色谱柱的选择主要有C18色谱柱和氨基柱两类，但都存在明显缺陷。反相体系以C18色谱柱为代表对扎那米韦均不保留，尽管通过选用离子对试剂，能够适当增加扎那米韦的保留，但分析时间过长，不适合作为杂质质量控制的分析方法。另一方面由于扎那米韦显弱酸性，易在氨基柱中键合吸附，造成色谱分离不稳定，因此氨基色谱柱不适用于定量定性用。

HILIC柱是一种新型的色谱柱，是正相色谱的变体，其保留强度与溶质极性成正比，而与流动相成反比。HILIC色谱使用极性固定相，与高有机相比例的流动相。极性固定相从吸附水或其他极性溶剂使固定相表面建立一层水层或极性层，而流动相的主体则是非质子化溶剂。HILIC色谱是多重保留机制同时作用的过程，而首先发生的是液液分配。在分析过程中化合物在流动相与固定相表面的水层或极性层之间进行液液分配，极性化合物倾向于分配进入高极性的水层或极性层获得保留，之后还能与固定相表面发生吸附作用和/或离子交换作用进一步增强保留，因此HILIC色谱能够使极性分析物得到好的保留与分离，并能够提供相对于反相色谱近乎正交的选择性。

HILIC色谱柱适用于在反相色谱柱上不保留的化合物的分离，尤其是对强极性化合物的保留能力增强。除了对极性化合物表现出优异保留能力外，HILIC色谱柱能够提高LC/ESI-MS（液质联用（电喷雾离子源））响应信号，样品溶液直接兼容SPE（固相萃取）洗脱剂，并且与传统反相HPLC具有互补的选择性。

HILIC硅胶柱还具有寿命长，与各种LC（高效液相）检测器兼容，色谱柱间重现性好的特点。

因此，鉴于扎那米韦及含扎那米韦制剂中杂质的现有检测技术的缺陷，对应用HILIC色谱柱检查扎那米韦及含扎那米韦的相关制剂中杂质的测定方法进行研究是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于通过对固定相、流动相、检测波长等方面的改进，提供一种检测扎那米韦及含扎那米韦制剂中杂质的HPLC测定方法。该发明选用HILIC柱进行检测，不但扎那米韦能够得到适当保留，而且流动相配制简单，重现性好，分析时间合适，与MS（质谱）匹配度好，灵敏度高，分析方法稳定，柱寿命长等优势。

本发明采取的技术方案如下：

本发明提供了一种检测扎那米韦及含扎那米韦制剂中杂质的HPLC测定方法，其特征在于：固定相选用HILIC色谱柱，分离机制为亲水作用色谱法（hydrophilic interaction liquidchromatography,HILIC），流动相选自极性有机溶剂-缓冲盐溶液或极性有机溶剂-弱酸溶液或极性有机溶剂水溶液，检测波长范围为200nm~240nm。其中HILIC色谱柱为极性固定相，所述极性固定相选自未衍生化硅胶或修饰氨基、氰基和羟基等极性基团的硅胶柱等。

进一步，流动相为乙腈-缓冲盐溶液或乙腈-弱酸溶液或乙腈-水溶液，优选乙腈-缓冲盐溶液。再进一步，所述的流动相中乙腈与缓冲盐溶液的比例为50~90：50~10，优选60~70：40~30，所述的流动相中乙腈与弱酸溶液的比例为50~90：50~10，优选60~70：40~30，所述的流动相中乙腈与水的比例为50~90：50~10，优选60~70：40~30。

再进一步，所述的缓冲盐溶液选自甲酸铵缓冲盐体系、乙酸铵缓冲盐体系、磷酸盐缓冲盐体系或者它们之间任意配比形成的混合溶液，优选甲酸铵缓冲盐体系或乙酸铵缓冲盐体系。其中所述甲酸铵缓冲盐体系选自甲酸铵溶液、甲酸铵加甲酸溶液、甲酸铵加乙酸溶液；所述乙酸铵缓冲盐溶液选自乙酸铵溶液、乙酸铵加甲酸溶液、乙酸铵加乙酸溶液。

再进一步，所述缓冲盐溶液优选甲酸铵溶液。

再进一步，所述缓冲盐溶液的浓度范围为1mM~200mM，优选1mM~10mM。

再进一步，所述的缓冲盐溶液体系的pH范围为5.0~8.0，优选6.0~7.0。

再进一步，所述的弱酸溶液选自甲酸水溶液、乙酸水溶液。

再进一步，所述的弱酸溶液的浓度范围为1mM~200mM，优选1mM~10mM。

再进一步，所述的弱酸溶液的pH范围为5.0~8.0，优选6.0~7.0。

再进一步，所述的检测波长的范围为200nm~240nm，其中在210nm和234nm双波长下，扎那米韦及其有关物质均能被检测到。

本发明与现有技术相比，主要优势在于：

HILIC色谱柱对极性化合物具有优异的保留能力，能够提高LC/ESI-MS（液质联用（电喷雾离子源））响应信号，样品溶液直接兼容SPE（固相萃取）洗脱剂，并且与传统反相HPLC具有互补的选择性。该发明选用HILIC柱进行检测，不但扎那米韦能够得到适当保留，而且流动相配制简单，重现性好，分析时间合适，与MS（质谱）匹配度好，灵敏度高，分析方法稳定，柱寿命长等优势。

附图说明

图1为210nm波长项下扎那米韦的紫外吸收图谱。

图2为234nm波长项下扎那米韦的紫外吸收图谱。

图3为210nm波长项下检测到的酸破坏样品中的杂质图谱。

图4为234nm波长项下检测到的酸破坏样品中的杂质图谱。

图5为210nm波长项下检测到的碱破坏样品中的杂质图谱。

图6为234nm波长项下检测到的碱破坏样品中的杂质图谱。

图7为210nm波长项下检测到的氧化破坏样品中的杂质图谱。

图8为234nm波长项下检测到的氧化破坏样品中的杂质图谱。

图9为210nm波长项下检测到的光破坏样品中的杂质图谱。

图10为234nm波长项下检测到的光破坏样品中的杂质图谱。

图11为已有检测方法在210nm波长下各添加杂质的杂质图谱。

图12为已有检测方法在234nm波长项下各添加杂质的杂质图谱。

具体实施方案

以下是本发明的具体实施例，用以对本发明的技术方案做进一步的说明，而非对本发明的限制。

以下实施例中检测所用的扎那米韦原料药及吸入粉雾剂均由南京先声东元制药有限公司提供，批号为96110201。

实施例1：1.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂适量，精密称定，加适量的水超声溶解后，加流动相稀释制成每1ml中含扎那米韦20mg的溶液，作为供试品溶液。

1.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH6.5）=65:35；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：210nm和234nm；

1.3测定：取5μl注入高效液相色谱仪，记录图谱（附图1、图2）。

实施例2：

2.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品溶液。

2.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH6.5）=65:35；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：210nm和234nm；

2.3测定：取5μl注入高效液相色谱仪，记录图谱（附图3、图4）。

实施例3：

3.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破环样品溶液。

3.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH6.5）=65:35；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：210nm和234nm；

3.3测定：取5μl注入高效液相色谱仪，记录图谱（附图5、图6）。

实施例4：

4.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品溶液。

4.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH6.5）=65:35；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：210nm和234nm；

4.3测定：取5μl注入高效液相色谱仪，记录图谱（附图7、图8）。

实施例5：

5.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg用流动相配成0.5mg/ml的供试液于4500lx的强光中放置数天，作为光破坏样品溶液。

5.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH6.5）=65:35；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：210nm和234nm；

5.3测定：取5μl注入高效液相色谱仪，记录图谱（附图9、图10）。

实施例6：

6.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品。

6.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,5μm)；

流动相：乙腈:水=70:30；

流速：1ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：200nm和240nm；

6.3测定：取10μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分离开。

实施例7：

7.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品。

7.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:水=70:30；

流速：1ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：200nm和234nm；

7.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分离开。

实施例8：

8.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品。

8.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵=65:35；

流速：1ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：200nm和234nm；

8.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分离开。

实施例9：

9.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品。

9.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:100mM甲酸铵=60:40；

流速：1ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：200nm和234nm；

9.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分离开。

实施例10：

10.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品。

10.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM乙酸铵=70:30；

流速：2ml/min；

柱温：20℃；

检测波长：210nm和234nm；

10.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上分离度良好，峰形好。

实施例11：

11.1样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品；

11.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵=70:30；

流速：0.8ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：220nm和234nm；

11.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上分离度良好。

实施例12：

12.1样品溶液配制：样品溶液配制：取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml，放置，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml中和，作为酸破环样品；取吸入粉雾剂约10mg，加流动相配成0.5mg/ml的供试液，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置，加0.1mol/L的盐酸溶液2ml中和，作为碱破坏样品；取吸入粉雾剂约10mg，用流动相配成0.5mg/ml的供试液，加过氧化氢一滴，室温放置，作为氧化破坏样品；

12.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:5mM甲酸铵=65:35；

流速：2ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：210nm和234nm；

12.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分离开，出峰时间较实施例4略有提前。

实施例2~实施例12检测结果比较，见表1。

表1实施例2~实施例12检测结果比较

实施例13：

13.1样品溶液配制：取脒基吡唑对照品、吡唑对照品、唾液酸、扎那米韦原料药，用流动相溶解并稀释制成混合溶液；

13.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH6.5）=65:35；

流速：1ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：210nm和234nm；

13.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上分离度良好，峰形好。

实施例14：

14.1样品溶液配制：取脒基吡唑对照品、吡唑对照品、唾液酸、扎那米韦原料药，用流动相溶解并稀释制成混合溶液；

14.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH8）=65:35；

流速：1ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：210nm和234nm；

14.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分开,但分离度欠佳。

实施例15：

15.1样品溶液配制：取脒基吡唑对照品、吡唑对照品、唾液酸、扎那米韦原料药，用流动相溶解并稀释制成混合溶液；

15.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters HILIC Silica(4.6*150mm,3μm)；

流动相：乙腈:10mM甲酸铵（pH5）=65:35；

流速：1ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：210nm和234nm；

15.3测定：取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质在色谱柱上可分开，但分离度欠佳。

实施例16：已有的扎那米韦杂质的检查方法。

16.1样品溶液配制：取脒基吡唑对照品、吡唑对照品、唾液酸、扎那米韦原料药，用流动相溶解并稀释制成混合溶液；

16.2仪器与色谱条件：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪；

色谱柱：Agilent150mm*4.6mmNH2P-50(5μm)；

流动相：乙腈:7.5mM硫酸溶液（用氨水调节pH至6.2±0.005）=60:40；

流速：1ml/min；

检测波长：210nm和234nm；

16.3测定：取10μl注入高效液相色谱仪，记录图谱，主峰及各杂质分离度良好，但该法重现性不佳，柱损失严重。