一种检测淋巴细胞归巢受体的荧光方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测淋巴细胞归巢受体的荧光方法及其试剂盒，该方法首先将阳离子型共轭聚合物与荧光素标记的带负电荷的透明质酸通过静电吸引结合，并发生从共轭聚合物到荧光素的荧光共振能量转移，荧光素的荧光强度显著增大；当加入CD44时，它与透明质酸发生特异性结合，使阳离子型共轭聚合物与带荧光素基团的透明质酸的结合削弱，分子间距离增大，从而使能量转移效率降低，共轭聚合物的荧光逐渐恢复，荧光素的荧光逐渐减弱，且能量转移效率下降的程度与CD44的浓度相关。该方法操作简便，响应速度快，成本较低，具有较高的选择性和灵敏度，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感及分析领域，特别涉及一种利用阳离子型共轭聚合物和透明质酸探 针检测淋巴细胞归巢受体（CD44）的荧光方法及其试剂盒。

背景技术

共轭聚合物的吸光能力非常强，还具有“分子导线”功能，允许采集的光能或光激发电子 在共轭主链上迅速迁移、传递，从而对被检测分子迅速产生群体响应，体现出特有的荧光信 号放大作用。因此，共轭聚合物成为近年来传感领域中颇受青睐的报告器材料，相对于传统 小分子荧光材料，常具有更好的信号倍增效应和实时检测效果。为了把共轭聚合物应用于生 物传感，常在聚合物侧链上引入离子基团，使水溶性增强；通过引入阳离子基团，可使整条 聚合物链在水溶液中带正电荷，能与带负电荷的生物分子进行静电结合。

1934年，Meyer等首先在牛眼玻璃体中发现了透明质酸，随后在人体内也发现了它的存 在。它和蛋白质、核酸一样，都是生命过程的基本物质，广泛存在于生物体的软结缔组织中， 如眼玻璃体、人的脐带、皮肤、关节滑液、雄鸡冠等许多地方。透明质酸是由（1-β-4）D-葡 糖醛酸（1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的带负电的线性黏多糖（Toole  BP.Nature,2004,4(7):528-539），相对分子量数量级在10⁴-10⁷，是构成细胞外基质和细胞间 质的主要成分（Evanko SP,Park W T,Wight T N.J Histochem Cytochem,2004,52(12): 1525-1535;Hascall V C,Majors A K,De La Motte C A,et al.Biochim Biophys Acta,2004, 1673(1-2):3-12)。透明质酸分子中含有的大量羧基、羟基、酰胺基，在生理条件或适当的pH 环境下，羧基可充分解离成负离子。因此，透明质酸具有突出的保水性能，它的水溶液既具 有凝胶的弹性、也具有溶液的粘性，即粘弹性的双重特征。透明质酸通过作用于细胞及其受 体，在间质的转移、肿瘤细胞的侵袭、畸胎癌细胞的分化等过程中起着重要作用。近年来， 基于透明质酸独特的理化性质和生理功能，它已经在诸多方面得到广泛应用，例如：保护眼 睛、保护和润滑关节、促进血管生成、促进伤口愈合及肿瘤的治疗等。

目前所研究的透明质酸在抗肿瘤中的作用主要是通过其与受体CD44结合而实现的。 CD44，又称淋巴细胞归巢受体，是多种恶性肿瘤细胞表面的一种跨膜糖蛋白，相对分子质量 为（80-90）×10³（Fujita Y,Kitagawa M,Nakamura S,et al.FEBS Letter,2002,528(1-3):101-108)， 它与恶性肿瘤细胞周围的透明质酸通过特异性作用结合，利用透明质酸形成的水合性通道促 进肿瘤细胞的转移。研究表明，CD44的表达与肿瘤的转移和表达呈正相关，对透明质酸与 CD44的结合进行有效地控制已在一些肿瘤细胞的转移和生长抑制中取得了令人瞩目的成就。 因此，对CD44进行高效的检测在肿瘤的早期诊断和治疗等方面具有重要的理论和应用研究 价值。

目前市面上检测CD44的常见方法是利用双抗体夹心法的ELISA试剂盒。它的原理是先 利用CD44的单克隆抗体固定待检测的CD44抗原，再与修饰了生物素功能基团的CD44抗 体作用，然后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物； 经过彻底洗涤后用底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色。TMB在HRP的催化下转化成 蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深度和样品中的CD44浓度呈正相关。用 酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。这种方法虽然可以达到高的灵 敏度和优良的特异性，但是操作费时，成本较高。找到一种既能特异性检测CD44，又操作简 便、快速、成本低的检测方法，成为亟待解决的问题。

发明内容

技术问题：本发明要解决的第一个技术问题是针对现有ELISA试剂盒检测CD44方法的 不足，提供一种利用透明质酸探针，并用阳离子型水溶性共轭聚合物进行荧光信号放大来检 测CD44的方法，灵敏度和特异性好，并且操作简便、快速，成本低。

本发明要解决的第二个技术问题是提供采用上述检测方法的试剂盒。

技术方案：本发明为一种基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸探针检测CD44的 荧光方法，运用该方法可以实现对CD44的定性和定量检测。该技术的核心是利用CD44与 透明质酸探针发生特异性结合前后，阳离子型水溶性共轭聚合物与透明质酸上标记的荧光基 团之间荧光共振能量转移效率的差异进行CD44检测。当CD44浓度为零时，共轭聚合物与 透明质酸探针通过静电作用结合，在光激发下产生荧光共振能量转移，荧光基团的荧光强度 倍增；当CD44浓度增大时，CD44与荧光基团标记的透明质酸发生特异性结合，大大削弱了 共轭聚合物与透明质酸探针的静电结合作用，使两者的距离增大，因此荧光基团的荧光明显 减弱，而共轭聚合物的荧光得以恢复；荧光共振能量转移效率的变化程度与CD44的浓度相 关，因此根据本方法可以对CD44进行定量检测。

本发明的一种检测淋巴细胞归巢受体的荧光方法基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明 质酸探针，包括以下步骤：

1）制备荧光基团标记的透明质酸探针；

2）将阳离子型水溶性共轭聚合物与所述透明质酸探针结合，进行荧光检测；

3）在上述检测体系中再加入待检测的淋巴细胞归巢受体，透明质酸探针与淋巴细胞归巢受 体CD44结合，再次进行荧光检测。

所述荧光基团包括荧光素的荧光小分子结构中的发色团。

所述阳离子型水溶性共轭聚合物，其荧光发射峰与荧光基团标记的透明质酸探针的紫外- 可见吸收峰有光谱重叠，以便发生高效的荧光共振能量转移。

所述阳离子型水溶性共轭聚合物与透明质酸探针是通过静电吸引作用结合。

所述透明质酸探针与CD44的结合，是透明质酸与CD44间发生特异性识别并结合的过 程。

检测体系中，所使用的缓冲溶液是0.05MTris-HCl，pH=8。

检测体系的温度为25℃。

加入待测CD44溶液5分钟后再次测量荧光发射光谱。

所述的荧光检测是用荧光分光光度计进行检测，激发波长在阳离子型水溶性共轭聚合物 最大紫外-可见吸收峰处，发射波长扫描范围为415－600nm。

本发明的一种利用透明质酸探针检测CD44的试剂盒为：

将荧光基团标记的透明质酸探针与阳离子型水溶性共轭聚合物按摩尔浓度1:50的配比制 成的混合物，构成检测CD44的试剂盒。

有益效果：本发明所述的荧光检测方法基于水溶性共轭聚合物信号倍增和实时检测的优 势，以及CD44与透明质酸能发生特异性结合的特点，利用CD44与透明质酸探针发生特异 性结合前后，阳离子型水溶性共轭聚合物与透明质酸上标记的荧光基团之间荧光共振能量转 移效率的差异进行CD44检测。该方法操作简便，响应速度快，成本较低，且具有较高的选 择性和灵敏度，是一种分析效率较高的检测方法。

附图说明

图1为阳离子型水溶性共轭聚合物的分子结构式。

图2为透明质酸的分子结构式。

图3为氨基荧光素的分子结构式。

图4为利用阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸探针检测CD44的工作原理图。

图5为基于阳离子型水溶性共轭聚合物和透明质酸探针的荧光检测方法对不同浓度的 CD44进行检测的荧光光谱图。CD44浓度范围为0～1.0×10^-5g/mL。

图6为荧光共振能量转移效率的相对变化值ΔFRET与不同浓度CD44对应的关系曲线图。 注解：小图表示荧光共振能量转移效率的相对变化值ΔFRET与0～1.0×10^-6g/mL浓度范围内 的CD44的线性关系图。

图7为特异性分析图。分别为检测底液中加入CD44,牛血清蛋白（BSA）,凝血酶 （Thrombin）和空白缓冲溶液的对比结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面以阳离子型水溶性共轭聚合物和荧光素标记的透明质酸探针检测 CD44的实验为例，说明本发明技术的具体实施方式。

运用该技术包括如下四个步骤：

1）制备荧光素标记的透明质酸探针；

2）将阳离子型水溶性共轭聚合物与透明质酸探针结合，进行荧光检测；

3）在上述反应体系中再加入待检测的CD44，透明质酸探针与CD44结合，再次进行荧 光检测。

其中：

步骤1可参照文献（Anthony N.Dd Belder,K.Ove Wik,CorbohyrGare Research,1975，44， 251-257）进行，其反应机理为：氨基荧光素先与乙醛反应生成连接有荧光素基团的亚胺，再 与透明质酸，环己基异腈反应生成荧光素标记的透明质酸，即通过透明质酸的羧基与氨基荧 光素的氮原子相连接，使透明质酸标记上荧光素基团。透明质酸和氨基荧光素的分子结构式 如图1、图2、图3所示。

步骤2中的阳离子型水溶性共轭聚合物可参照文献（Huang Y Q,Fan Q L,Lu X M,Fang C, Liu S J,Li H,Wen Y,Wang L H,Huang W.,Journal of Polymer Science:PartA:Polymer  Chemistry2006,44(19),5778-5794）制备,其浓度以重复单元的摩尔浓度表示。透明质酸探针 的浓度也以其重复单元的摩尔浓度表示。该共轭聚合物通过静电吸引作用与透明质酸探针结 合，并在光激发下发生由共轭聚合物到荧光素的荧光共振能量转移（FRET），从而使荧光素 的信号得到显著的增强。这是本技术中的一个关键，利用了水溶性共轭聚合物优越的荧光信 号放大性能。荧光共振能量转移效率用荧光素与共轭聚合物最大荧光发射处的荧光发射强度 比值，即I_532nm/I_445nm来表示。当CD44浓度为零时，荧光共振能量转移效率用FRET₀表示。

荧光检测所用的仪器为岛津RF-5301PC荧光分光光度计。荧光光谱测量条件：氙灯激发， 激发波长为403nm，发射扫描范围为415-600nm。检测缓冲液为pH=8的0.05M Tris-HCl缓冲 液，用3mL石英比色皿进行测量，样品体积2mL；阳离子型水溶性共轭聚合物浓度为5×10^-7mol/L，透明质酸探针的浓度为2.5×10^-5mol/L，检测温度25℃。

步骤3在上述检测体系中再加入待检测的CD44，5分钟后测量荧光发射光谱。由于透明 质酸探针与CD44发生特异性结合，大大削弱了共轭聚合物与透明质酸探针的静电结合作用， 使两者的距离增大；再次进行荧光检测，荧光素的荧光明显减弱，而共轭聚合物的荧光得以 恢复，荧光共振能量转移效率下降。用FRET_c表示CD44浓度为C时的能量转移效率，计算 荧光共振能量转移效率下降的相对变化值ΔFRET：

ΔFRET=（FRET₀-FRET_c）/FRET₀

ΔFRET与CD44的浓度C相关，根据两者的关系曲线可以对CD44进行定量检测。

实施例1检测不同浓度的CD44

在温度为25℃，pH=8的Tris-HCl缓冲液中，向含5×10^-7mol/L阳离子型水溶性共轭聚 合物以及2.5×10^-5mol/L透明质酸探针的底液中加入一系列不同浓度的CD44，浓度分别为 1.95×10^-7，3.9×10^-7，6.5×10^-7，1.0×10^-6，1.0×10^-5g/mL，扫描其荧光发射光谱，实验结果如图 5所示。从图中可见随着CD44的浓度增大，由阳离子型水溶性共轭聚合物向透明质酸探针的 FRET效率逐渐降低。计算ΔFRET，对CD44的浓度作图得图6。该图表明在CD44浓度为10^-7g/mL数量级的范围内具有很好的线性范围，大于该范围，ΔFRET的曲线趋向平缓，表示加 入CD44的浓度趋于饱和。

该方法的检测限公式：LOD=3S₀/S，其中S₀表示空白样品的标准偏差，S表示在该方法 线性范围内的灵敏度。（Eggins B R,Chemical Sensors and Biosensors,John Wiley & Sons Ltd, West Sussex,England,2002）本实验空白样的标准偏差为0.05ΔFRET，结合线性曲线的灵敏度 计算得到检测限为1.8×10^-7g/mL。

实施例2特异性分析

检测1：将浓度为1.95×10^-7g/mL的CD44加入检测底液中，其它实验条件同实施例1。

同时，做如下试验作为对比。

检测2：用等体积的浓度为CD44100倍的牛血清蛋白（BSA）和凝血酶（Thrombin）进 行试验，作为阴性对照，其它实验条件同实施例1。

检测3：用等体积的空白缓冲溶液代替CD44进行试验，作为空白对照，其它实验条件同 实施例1。

结果如图7所示。加入CD44的检测体系的荧光共振能量转移效率相对变化值显著高于其他3 种对照体系，表明该方法对CD44的检测具有较高的特异性。