S100钙结合蛋白A8制备舒张气道平滑肌药物的新用途

摘要

本发明涉及蛋白药物领域，具体公开了一种S100钙结合蛋白A8在制备舒张气道平滑肌药物的用途及含有该蛋白的药物制剂。本发明揭示了S100钙结合蛋白A8舒张气道平滑肌的新功能，S100A8能明显舒张气道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的气道阻力，起到治疗哮喘的作用，可用于哮喘疾病的治疗以及哮喘治疗药物的制备；以针剂或喷雾剂的形式应用于哮喘疾病的质量，具有使用安全、有效、稳定等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白药物领域，具体公开了一种S100钙结合蛋白A8制备哮喘治疗药物的用途及含有该重组蛋白的哮喘治疗药物。>

背景技术

S100A8蛋白是S100蛋白家族的重要成员，又被称作钙粒蛋白A(Calgranulin-A)、迁移抑制因子相关蛋白8(Migration inhibitory factor-related protein8)、囊性纤维化抗原(Cystic fibrosis antigen)、白细胞L1轻链蛋白(Leukocyte L1 complex light chain)、泌尿系结石蛋白A(Urinary stone protein band A)等。该蛋白在骨髓中细胞分化早期阶段和处于循环状态的粒细胞、单核细胞、活化巨噬细胞中广泛表达，在非髓系细胞如内皮细胞、平滑肌细胞中也有表达。研究显示在细胞外液中也可检测到不同表达水平的S100A8蛋白，表明S100A8同时具有细胞内和细胞外的功能。当S100A8蛋白与Ca2+结合，在EF-2的HIII位置构象会发生改变，从而暴露出HIV上的疏水残基，使其可以与靶蛋白结合，进而通过与相应靶蛋白作用产生不同的生物学效应。研究表明S100A8蛋白与肿瘤和炎症等病理过程密切相，S100A8蛋白主要通过对中性粒细胞的趋化作用激活炎症细胞和炎性因子、结合并活化膜受体RAGE和TLR4，介导细胞内的炎症信号转导等途径，在炎症中发挥重要的调节作用。此外，也有研究发现了S100A8蛋白的抗炎症活性，说明S100A8在不同的病理生理条件下可能发挥更为复杂的生物学调节功能。我们研究发现S100A8具有舒张气道平滑肌，降低气道阻力的功能，而目前国内外尚没有关于此功能的报道，这一新的功能可能为哮喘防治提供新方法。>

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有舒张气道平滑肌功能，并能治疗哮喘的蛋白S100A8(S100钙结合蛋白A8：NP_446274)，并将其应用于哮喘治疗药物的制备。>

本发明的第一方面公开了一种S100钙结合蛋白A8(S100A8)在制备舒张气道平滑肌药物中的应用。>

进一步的，所述舒张气道平滑肌药物为哮喘治疗药物。>

所述S100钙结合蛋白A8既可以为分离纯化获得的天然蛋白，也可以为通过基因技术生产的重组蛋白。>

本发明经大量的体外实验和体内实验证实，重组蛋白S100 A8具有舒张气道平滑肌的功能，并应用于哮喘病的治疗，具有较好的临床应用前景。>

本发明第二方面公开了一种舒张气道平滑肌的药物组合物，包含S100钙结合蛋白A8。>

较佳的，所述S100钙结合蛋白A8为该药物组合物的唯一有效成分。>

更进一步的，所述舒张气道平滑肌的药物组合物为哮喘治疗药物。>

本发明第三方面公开了一种舒张气道平滑肌的药物制剂，含有安全有效量的S100钙结合蛋白A8，余量为药学上可接受的载体。>

药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和/或赋形剂，包括(但不限于)糖类(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)，淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉)，纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素)，黄蓍胶粉末，麦芽，明胶，滑石，固体润滑剂(如硬脂酸和硬脂酸镁)，硫酸钙，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)，海藻酸，乳化剂(如Tween、聚氧乙烯蓖麻油)，润湿剂(如月桂基硫酸钠)，着色剂，调味剂，压片剂、稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水，等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等；该载体可根据需要提高配方的稳定性、活性及生物有效性等。>

较优的，所述S100钙结合蛋白A8占所述药物制剂总质量的0.0004％～99％。>

本发明的药物制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的制剂形式。>

较优的，本发明所述药物制剂为针剂或喷雾剂。>

更优的，所述针剂中药学上可接受的载体选自磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。>

最优的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2～7.4。>

进一步的，所述舒张气道平滑肌药物制剂为治疗哮喘的药物制剂。>

本发明揭示了S100钙结合蛋白A8舒张气道平滑肌的新功能，S100A8能明显舒张气道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的气道阻力，起到治疗哮喘的作用，可用于哮喘疾病的治疗以及哮喘治疗药物的制备；具有使用安全、有效、稳定等优点。>

附图说明

图1：pET-22b(+)载体图谱>

图2：SDS-PAGE检测显示转化重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株经0.1mM IPTG 16℃诱导16h后，检测Calgranulin A(Calculated Mw：11.3KD)有过量表达。>

图3：菌体超声破碎后上清可溶部分含有Calgranulin A。>

图4：经Chelating SFF(Ni)column分离纯化，蛋白主要集中在D、E中。>

图5：S100A8纯化蛋白，纯度达到90％，Buffer：20mM Tris,20％glycerol,pH8.0。>

图6：用大鼠S100A8蛋白特异性抗体(Santa Cruz sc-8113,1:2000)进行Western blot实验验证，结果表明该纯化蛋白为大鼠S100A8蛋白。>

图7：S100A8蛋白降低哮喘大鼠气道阻力。>

图8：S100A8蛋白降低Mch诱导的气道平滑肌收缩张力。>

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。>

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。>

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域 常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。>

实施例1 S100A8蛋白重组表达纯化>

1.1扩增S100A8DNA>

按照NCBI组织分布信息，选择正常大鼠肺组织，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成cDNA，作为S100A8基因PCR扩增模板，在DNA taq酶的作用下进行PCR扩增，PCR扩增的引物为：>

PCR扩增程序为：总量为20ul的反应体系于94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后72℃延伸5min；扩增产物序列如SEQ ID NO：3所示。与NCBI数据库中大鼠S100A8基因100％匹配，序列完全正确。>

1.2表达S100A8重组蛋白>

将扩增后的产物经Nde I(CATATG)和Xho I(CTCGAG)酶切后，T4DNA连接酶连接到pET-22b(+)载体(质粒图谱见图1)的相应酶切位点，获得原核表达克隆。测序检测正确的重组载体经42℃热激转化至BL21(DE3)感受态细胞，Rosetta pLysS表达菌株，37℃培养过夜。在平板上挑单克隆接入3ml LB培养基中【BL21(DE3)含50ug/ml Ampicillin,Rosetta pLysS含50ug/ml Ampicillin,34μg/ml Chloramphenicol】，37℃250rmp振荡培养至OD600＝0.5-0.6后，(1)加入0.5mM IPTG37℃诱导3h；(2)加入0.1mM IPTG 16℃诱导过夜。SDS-PAGE检测显示转化重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3) 表达菌株经0.1mM IPTG16℃诱导16h后，检测S100A8(Calculated Mw：11.3KD)有过量表达，如图2所示。菌体超声破碎后上清可溶部分含有S100A8，如图3所示。>

根据表达筛选结果在100ml培养基中(含50ug/ml Ampicillin)接入BL21(DE3)表达菌株，37℃培养16h，转接到1L XY1培养基中(含50ug/ml Ampicillin)，37℃培养至OD600＝2后，加入0.1mM IPTG 16℃诱导过夜。>

样品上Chelating SFF(Ni)column(CV1ml)，以50mM Tris,500mM NaCl,pH8.0缓冲液平衡，以50mM Tris,500mM NaCl,500mM Imidazole,pH8.0缓冲液梯度洗脱，20mM Tris,20％glycerol,pH8.0缓冲液透析，浓缩得到纯化蛋白。将纯化的S100A8重组蛋白利用SDS-PAGE电泳分离，结果显示纯度为90％(如图4、5所示)。>

用大鼠S100A8蛋白特异性抗体(Santa Cruz sc-8113,1:2000)进行Western blot实验验证，结果表明该纯化蛋白为大鼠S100A8蛋白(如图6所示)。>

实施例2S100A8重组蛋白对哮喘大鼠呼吸功能影响>

1.实验材料>

1.1实验对象>

SPF级雄性SD大鼠，体重200～300g，随机分为6组，每组8只。>

1.2实验试剂>

1)腹腔注射致敏液，为含有1mg OVA和10mgAl(OH)₃的生理盐水，每只大鼠腹腔注射1ml。>

2)激发液为含有0.5％OVA的生理盐水溶液，按5mg/kg剂量颈外静脉注射激发。>

3)其他试剂均采用分析纯的药物用生理盐水配置获得。>

4)S100A8蛋白，实施例1制备。>

2.实验方法>

2.1哮喘模型的制备>

卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏SD大鼠，14天后对SD大鼠进行OVA颈外静脉激发。>

2.2实验组的制备>

卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏SD大鼠，14天后对SD大鼠进行OVA颈外静脉激发；激发前10分钟，将正常对照试剂(生理盐水)、生理盐水组(生理盐水)、阳性对照药物(特布他林)、不同剂量(10ng/kg，100ng/kg，1000ng/kg)S100A8蛋白，颈外静脉注射入大鼠体内。OVA激发后，检测大鼠呼吸功能。>

实验组具体分为以下6组，每组8个平行：>

A.正常对照组：正常大鼠，生理盐水致敏，生理盐水激发。>

B.生理盐水组：OVA造模大鼠，2周后颈外静脉注射生理盐水，剂量为0.1ml/Kg，10min后OVA激发。>

C.特布他林组：OVA造模大鼠，2周后颈外静脉注射特布他林，剂量为55μg/kg，10min后OVA激发。>

D.S100A8蛋白10ng组：OVA造模大鼠，2周后颈外静脉注射S100A8重组蛋白，剂量为10ng/kg，10min后OVA激发。>

E.S100A8蛋白100ng组：OVA造模大鼠，2周后颈外静脉注射S100A8重组蛋白，剂量为100ng/kg，10min后OVA激发。>

F.S100A8蛋白1000ng组：OVA造模大鼠，2周后颈外静脉注射S100A8重组蛋白，剂量为1000ng/kg，10min后OVA激发。>

用戊巴比妥钠以50mg/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，在颈部正中纵向切口插入连接有三通开关的直径为2.5mm的气管导管，用呼吸流量测定仪和Fleisch压差传感器测定潮气量(VT)和气流速率(V)。将食道作横向切口，插入头端有四个侧孔的注水导管，后联血压换能器供测定食道内压并用于代替胸内压(IPP)。食道内压经SMUP-B生物信号处理系统后，与VT、V经A/D转换后，由“呼吸流量测定”软件自动记录VT、V和IPP曲线，并自动计算气道阻力(R)。检测大鼠呼吸功能变化时，手术后记录呼吸状态15min，以12-14min数据均值作为初始基线值，于OVA激发前10min颈外静脉注射对照组药物和不同浓度的重组S100A8蛋白，0.5％OVA以5mg/kg用量注入大鼠体内激发哮喘，记录15min，OVA激发后第1-10min数据作为统计值。>

3.实验结果>

结果显示10ng/kg，100ng/kg，1000ng/kg剂量的S100A8重组蛋白在OVA激发后3min均能够改善哮喘大鼠的气道阻力(P均<0.01)，呈剂量依赖关系。1000ng/kg剂量效果最好(见图7)。>

动物整体水平的实验表明，重组大鼠S100A8蛋白能明显舒张气道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的气道阻力，并呈现一定的剂量依赖趋势，S100A8在1000ng/Kg的效应最为明显。>

实施例3 S100A8重组蛋白对大鼠气管螺旋条张力影响的离体组织实验>

1.实验材料>

1.1实验对象>

大鼠气管螺旋条制备方法(旋割法)：用戊巴比妥钠以50mg/kg体重腹腔注射麻醉SPF级雄性SD大鼠，解剖取出大鼠气管，迅速剥离周围结缔组织，将刀片固定保持刀刃向上，用一金属棒(直径2mm)穿入气管，将气管水平压于刀刃上，刀刃方向与玻棒螺旋旋转轴心成60度夹角，保持角度不变，螺旋旋转玻棒，将气管螺旋切割成约3mm*20mm的螺旋条。>

1.2实验试剂>

将S100A8蛋白(由实施例1制备)用pH7.4的PBS缓冲溶液配置浓度为1.5ug/ml的试剂备用。>

2.实验方法>

气管条经平衡后，分别在浴槽中加入不同剂量的阴性对照试剂(生理盐水)、阳性对照药物(阿托品组)、BSA组或S100钙结合蛋白A8试剂，检测气管螺旋条的张力变化。具体方法为：>

将制备的大鼠离体气管螺旋条固定于垂直组织恒温浴槽中，上端连接PL3508 PowerLab8/35数据采集系统(ADINSTRUMENTS，美国)，将气管条张力转换为脉冲电信号，用LabChart7.2软件实时记录。浴槽内温度恒定在36.5-37.5℃，持续供给95％O2和5％CO2的混合气体(1-2个气泡/s)，初始负荷调节在1.5g。各组标本平衡30min后，开始滴加不同剂量的Mch溶液刺激气管条收缩，每个刺激剂量记录10min，选取第6-10min数据的均值作为该剂量最后的张力数值。>

离体实验方法具体分为以下4组：>

A.正常对照组(n＝5)：提前加入生理盐水孵育12h；>

B.S100A8组(n＝5)：提前加入S100A8纯化蛋白(1.5μg/ml)孵育12h；>

C.BSA组(n＝5)：提前加入BSA(1.5μg/ml)孵育12h；>

D.阿托品组(n＝5)：平衡记录结束后，加入0.1μM的Atropine，10min后加入乙酰甲胆碱(Mch)刺激。>

3.实验结果>

结果显示：阿托品作为乙酰甲胆碱的竞争性抑制物，能与M胆碱能受体可逆行结合，实验结果显示阿托品完全阻断了Mch与M胆碱能受体的结合，说明实验体系可靠；BSA作为阴性对照蛋白与正常组比较无差异，无抑制Mch的效应；1.5μg/ml重组S100A8蛋白孵育12h能够明显降低Mch诱导的气管螺旋条收缩反应(P<0.01，见图8)。>

离体组织水平的实验显示，1.5μg/ml重组大鼠S100A8蛋白能明显舒张气道平滑肌，降低Mch刺激的大鼠气管螺旋条张力。>

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。>