三元纳米复合药物、其制备方法和其用于制备治疗肿瘤的药学组合物的用途

摘要

本发明涉及一种三元纳米复合药物、其制备方法和其用于制备治疗肿瘤的药学组合物的用途。该三元纳米复合药物包含核心载体、药物活性成分和用于包裹所述核心载体与药物活性成分的稳定剂。该核心载体包含能够被超声波激发从而产生活性自由基的第一纳米粒子、具有医学成像信号的基于第一纳米粒子的复合纳米粒子或其组合；该药物活性成分负载于所述核心载体上；该稳定剂包括亲水性聚合物、表面含有羟基或羧基的脂质体、牛血清白蛋白纳米球、人血清白蛋白纳米球，或其组合。本发明还涉及不含稳定剂的二元纳米复合药物用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途。本发明可实现超声波治疗与化疗协同的肿瘤靶向治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米复合药物，特别是涉及一种三元纳米复合药物、其制备方法、其于制备治疗肿瘤的药学组合物的用途。本发明还涉及该三元纳米复合药物与二元纳米复合药物用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途。本发明可实现化学药物与超声波协同治疗恶性肿瘤，特别是多药耐药肿瘤的治疗。 

背景技术

化疗是临床治疗恶性肿瘤的主要方法。然而，化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有不同程度的损伤，破坏人体的免疫系统，影响患者的生存质量。严重的化疗副作用会导致肿瘤患者免疫力低下、身体衰弱，是化疗无法继续进行的主要原因之一。困扰化疗治疗肿瘤的另一瓶颈是肿瘤细胞的多药耐药性。耐药肿瘤细胞是由化疗药物诱导产生的、能耐受多种化疗药物的一种突变恶性肿瘤细胞。统计表明，在肿瘤化疗中，超过90%的患者死亡与肿瘤多药耐药相关。因此，在降低化疗药物副作用的同时，克服肿瘤的多药耐药性，对癌症的治疗具有重要意义。 

TiO₂是一种宽禁带n型半导体材料，其锐态矿型带隙能为3.2eV，相当于波长为387nm的光子能量。当TiO₂受到能量大于或等于带隙能的光线或辐射激发后，会在价带和导带上分别产生强氧化性的光生空穴（h⁺）和强还原性的光生电子（e^-）。当处于水溶液中的TiO₂受到激发后，会产生反应活性很高的氢氧自由基和活性氧类分子等自由基。上述自由基能够破坏生物组织，导致细胞的死亡。因此，纳米TiO₂已被广泛应用于肿瘤细胞的光动力治疗研究领域。然而，通常TiO₂需要紫外线或更短波长的射线来激发，这极大地限制了TiO₂光动力治疗肿瘤的实际应用。为了克服激发源的困扰，日本学者金平幸辉等人提出采用超声波 激发纳米TiO₂治疗肿瘤。其机理在于，超声波穿透能力强，可引起组织机械振动和温热效应，从而引发组织产生OH¹、OH、H₂O₂、O等活性自由基（ROS），破坏肿瘤细胞结构（授权国家：中国，公布日期：2009年1月14日，专利号：200680049369.5.专利名称：超声波癌治疗促进剂和杀细胞剂）。 

在肿瘤化疗药物输送方面的研究显示，以纳米粒子为载体的药物输送体系与肿瘤细胞接触后，细胞膜发生内陷并将纳米粒子载药体系包裹形成内涵体，从而进入细胞内。这个过程能够避免细胞膜表面的p-糖蛋白所介导的药物外排作用，从而克服肿瘤细胞的多药耐药。基于以上机理，一些生物相容性好、毒性低、比表面积大的无机纳米材料，如Fe₃O₄、SiO₂、TiO₂、ZnO等已被广泛地用于耐药肿瘤细胞的药物输送，并取得了良好的研究进展。以纳米粒子为载体的药物输送体系虽然利用细胞膜内吞作用巧妙地避免了p-糖蛋白对药物的外排，但是耐药肿瘤细胞的耐药分子机制依然存在，药物在内涵体内被释放后，p-糖蛋白依然可将与其临近的药物排到细胞外。因此，绝大多数基于纳米粒子的药物输送体系只能在一定程度上逆转多药耐药现象，但不能完全克服肿瘤细胞的多药耐药性。由于半导体材料良好的光电效应，以低毒纳米半导体材料为载体的药物输送与载体材料本身具备的光动力治疗能力相结合，发展出了耐药肿瘤细胞的多模式治疗。东南大学王雪梅教授课题组在多模式治疗耐药肿瘤细胞方面取得了重要的研究进展。他们将阿霉素（Doxorubicin,简称DOX）装载于ZnO纳米粒子上构建药物输送体系，利用紫外线激发ZnO产生ROS，实现了光动力治疗与化疗相结合的耐药肿瘤细胞的双模式治疗（H.Zhang,B.Chen,H.Jiang,C.L.Wang,H.Wang,X.M.Wang.Biomaterials,2011,32:1906-1914.）。然而，如前所述，以紫外线为激发源将限制半导体材料光动力治疗的应用。 

因此，存在需求来解决肿瘤治疗过程中化疗药物的副作用以及肿瘤细胞的多药耐药现象，以及解决半导体材料光动力治疗的激发源受限的问题。 

发明内容

本发明的目的是解决半导体材料光动力治疗的激发源受限的问题，并解决肿瘤治疗过程中化疗药物副作用与肿瘤细胞多药耐药现象。 

本发明的第一方面提供一种三元纳米复合药物，其包含： 

核心载体，其包含能够被超声波激发从而产生活性自由基的第一纳米粒子、具有医学成像信号的基于所述第一纳米粒子的复合纳米粒子，或其组合； 

药物活性成分，其负载于所述核心载体上；和 

用于包裹所述核心载体与药物活性成分的稳定剂，所述稳定剂包括亲水性聚合物、表面含有羟基或羧基的脂质体、牛血清白蛋白纳米球(简称BSA)、人血清白蛋白纳米球，或其组合。 

另一优选例中，所述第一纳米粒子包含TiO₂和/或ZrO₂。 

另一优选例中，以重量为基准，所述核心载体、药物活性成分和稳定剂的含量比为1：0.01：0.4至1：0.5：1。较佳地，该核心载体、药物和稳定剂的含量比为1：0.01：0.5至1：0.5：1。更佳地为1：0.01：0.5至1：0.1：0.8。 

另一优选例中，该复合药物的粒径为10至200纳米。更佳地为50至150纳米。 

另一优选例中，该医学成像信号包括T₁加权的磁共振成像信号、T₂加权的磁共振成像信号、电子计算机X射线断层扫描信号、近红外激发上转换荧光信号，或其组合。 

另一优选例中，该复合纳米粒子包含所述第一纳米粒子，与选自Gd₂O₃、Fe₃O₄、ZnFe₂O₄、NiFe₂O₄、Au、NaYF₄:Er³⁺/Yb³⁺、NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺、NaYF₄:Tm³⁺/Er³⁺和NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺/Er³⁺中的一种或多种。 

另一优选例中，该亲水性聚合物包括非离子型聚合物、阳离子型聚合物、含羧基聚合物，或其组合。 

另一优选例中，该亲水性聚合物包含聚乙二醇(简称PEG)、葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酸，或其组合。 

另一优选例中，该药物活性成分包含抗肿瘤药物。 

另一优选例中，该抗肿瘤药物包含蒽环类抗肿瘤药物和/或紫杉醇。 

另一优选例中，该抗肿瘤药物包含阿霉素和/或紫杉醇。 

另一优选例中，该复合药物还包括用于靶向肿瘤的含有配体分子的表面修饰层。 

另一优选例中，该配体分子是通过酰胺键（-CO-NH-）连接到该稳定剂的表面。 

另一优选例中，该配体分子为叶酸、叶酸衍生物、RGD肽（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）、肿瘤特异性抗体，或其组合。优选为叶酸。 

本发明的第二方面提供一种制备上述本发明三元纳米复合药物的方法，其包含以下步骤： 

(a)将所述核心载体分散于水中，从而形成核心载体分散液； 

(b)混合所述核心载体分散液与所述药物活性成分，从而形成二元水溶胶；和 

(c)混合所述二元水溶胶与含所述稳定剂的溶液，从而形成所述三元纳米复合药物。 

另一优选例中，该方法还包含步骤(d)，其用于先活化步骤(c)得到的三元纳米复合药物，和使用含有配体分子的溶液对所述活化后的三元纳米复合药物进行表面修饰，从而获得包括表面修饰层的三元纳米复合药物，所述表面修饰层含有配体分子。 

本发明的第三方面提供一种如前述的三元纳米复合药物用于制备治疗肿瘤的药学组合物的用途。 

另一优选例中，该三元纳米复合药物是用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途。 

本发明的第四方面提供一种超声波治疗系统，其包含用于发射超声波的装置，和如前述的三元纳米复合药物。 

本发明的第五方面提供一种二元纳米复合药物用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途，所述二元纳米复合药物包含： 

核心载体，其包含能够被超声波激发从而产生活性自由基的第一纳米粒子、具有医学成像信号的基于所述第一纳米粒子的复合纳米粒子，或其组合；和 

药物活性成分，其负载于所述核心载体上。 

另一优选例中，该第一纳米粒子包含TiO₂和/或ZrO₂。 

另一优选例中，以重量为基准，所述核心载体与药物活性成分的含量比为1：0.01至1：0.5。更佳地为1：0.01至1：0.1。 

另一优选例中，该医学成像信号包括T₁加权的磁共振成像信号、T₂加权的磁共振成像信号、电子计算机X射线断层扫描信号、近红外激发上转换荧光信号，或其组合。 

另一优选例中，该复合纳米粒子包含所述第一纳米粒子，与选自Gd₂O₃、Fe₃O₄、ZnFe₂O₄、NiFe₂O₄、Au、NaYF₄:Er³⁺/Yb³⁺、NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺、NaYF₄:Tm³⁺/Er³⁺和NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺/Er³⁺中的一种或多种。 

另一优选例中，该药物活性成分包含抗肿瘤药物。 

另一优选例中，该抗肿瘤药物包含阿霉素和/紫杉醇。 

本发明的第六方面提供一种超声波治疗系统，其包含用于发射超声波的装置，和前述的二元纳米复合药物。 

附图说明

图1是说明实施例1中TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物表征的红外光谱吸收(a图)、Zeta电位(b图)。 

图2是说明实施例1中PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物表征的粒径分布。 

图3是说明实施例1中使用MTT法检测阿霉素和三种PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物对人乳腺癌多药耐药细胞的杀伤能力。 

图4是说明实施例1中通过激光共聚焦显微镜研究PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物在人乳腺癌多药耐药细胞内的分布规律。 

图5是说明实施例10中使用MTT法检测TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物抗人乳腺癌细胞MCF-7(药物敏感细胞，a图)、MCF-7/ADM(多药耐药细胞，b图)的效果。 

图6是说明实施例10中TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物在人乳腺癌细胞 MCF-7(药物敏感细胞，a图)、MCF-7/ADM(多药耐药细胞，b图)分布的X射线同步辐射结果。 

图7是说明实施例10中TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物在人乳腺癌细胞MCF-7(药物敏感细胞，a图)、MCF-7/ADM(多药耐药细胞，b图)分布的激光共聚焦显微镜结果。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现以具有超声激活性质的纳米粒子或复合纳米粒子为核心载体，将药物装载于核心载体上，并且为保持纳米复合药物的稳定性，延长其在体内的循环时间，再用稳定剂(例如亲水性聚合物等)包裹于外面，从而获得三元纳米复合药物。通过控制核心载体的粒径、药物搭载量、稳定剂用量等控制复合药物的粒径，使其对肿瘤组织具有较好的透过性及滞留效应（EPR效应，即被动靶向肿瘤作用）；或者可进一步通过对纳米复合药物表面修饰靶向肿瘤的配体分子使其具有主动靶向肿瘤作用。使用本发明的三元纳米复合药物或申请人已提交的专利申请案(申请号为20111039712.7)中记载的二元纳米复合药物，加上通过一定剂量超声波辐射肿瘤部位，可实现超声波治疗与化疗协同的肿瘤靶向治疗，使用医学成像仪器可对肿瘤部位成像或者对两种治疗模式的协同效果进行实时疗效评价。在此基础上完成了本发明。 

三元纳米复合药物 

本发明三元纳米复合药物包含： 

核心载体，其包含能够被超声波激发从而产生活性自由基的第一纳米粒子、具有医学成像信号的基于所述第一纳米粒子的复合纳米粒子，或其组合； 

药物活性成分，其负载于所述核心载体上；和 

用于包裹所述核心载体与药物活性成分的稳定剂，所述稳定剂包括亲水性聚合物、表面含有羟基或羧基的脂质体、牛血清白蛋白纳米球(简称BSA)、人血清白蛋白纳米球，或其组合。 

术语“活性自由基”是指能破坏肿瘤细胞结构的自由基，例如OH¹、OH、 H₂O₂、O等。 

另一优选例中，所述第一纳米粒子包含TiO₂和/或ZrO₂。另一优选例中，该第一纳米粒子是TiO₂纳米粒子。 

另一优选例中，该第一纳米粒子的粒径范围优选为1-150纳米。 

另一优选例中，该医学成像信号包括T₁加权的磁共振成像信号、T₂加权的磁共振成像信号、电子计算机X射线断层扫描信号、近红外激发上转换荧光信号，或其组合。 

另一优选例中，该复合纳米粒子包含所述第一纳米粒子，与选自Gd₂O₃、Fe₃O₄、ZnFe₂O₄、NiFe₂O₄、Au、NaYF₄:Er³⁺/Yb³⁺、NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺、NaYF₄:Tm³⁺/Er³⁺和NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺/Er³⁺中的一种或多种。 

另一优选例中，该核心载体是具有医学成像信号的基于所述第一纳米粒子的复合纳米粒子，例如具有T₁加权MRI信号的Gd₂O₃与TiO₂、ZrO₂其中一种或两种的复合纳米粒子，优选为Gd₂O₃-TiO₂复合纳米粒子，其制备方法可参考下面实施例5；或具有T₂加权MRI信号的Fe₃O₄、ZnFe₂O₄、NiFe₂O₄其中的一种或多种与TiO₂、ZrO₂其中的一种或两种的复合纳米粒子，优选为Fe₃O₄-TiO₂复合纳米粒子，其制备方法可以参照申请人已申请的中国发明专利CN102125699A；或具有CT信号的Au与TiO₂、ZrO₂其中一种或两种的复合纳米粒子，优选为Au-TiO₂复合纳米粒子，其制备方法参考文献：Z.W.Seh,S.Liu,M.Low,S.Y.Zhang,Z.Liu,A.Mlayah,M.Y.Han.Janus Au-TiO₂ photocatalysts with strong localization of plasmonic near-fields for efficient visible-light hydrogen generation.Advanced Materials2012,24:2310-2314.；或者具有近红外激发上转换荧光信号性质的纳米材料与TiO₂、ZrO₂其中一种或两种的复合纳米粒子，优选为NaYF₄:Er³⁺/Yb³⁺、NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺、NaYF₄:Tm³⁺/Er³⁺、NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺/Er³⁺其中的一种与TiO₂的复合纳米粒子，更优选为NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂复合纳米粒子，其制备方法可以参照申请人已申请的中国发明专利CN102743752A。 

另一优选例中，该复合纳米粒子的粒径范围优选5-150纳米，更佳为50-150纳米。 

另一优选例中，该亲水性聚合物包括非离子型聚合物、阳离子型聚合物、含 羧基聚合物，或其组合。 

另一优选例中，该亲水性聚合物包含聚乙二醇(简称PEG)、葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酸，或其组合。 

另一优选例中，该药物活性成分包含抗肿瘤药物。 

另一优选例中，该抗肿瘤药物包含蒽环类抗肿瘤药物和/或紫杉醇。 

另一优选例中，该抗肿瘤药物包含阿霉素和/或紫杉醇。 

另一优选例中，该复合药物还包括用于靶向肿瘤的含有配体分子的表面修饰层。 

另一优选例中，该配体分子是通过酰胺键（-CO-NH-）连接到该稳定剂的表面。 

另一优选例中，该配体分子为叶酸、叶酸衍生物、RGD肽（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）、肿瘤特异性抗体，或其组合。优选为叶酸。 

另一优选例中，该药物活性成分是以非共价连接方式负载于所述核心载体上。所述非共价连接方式可以是通过物理吸附、静电作用力、分子间作用力其中的一种或几种方式连接。 

另一优选例中，用于包裹所述核心载体与药物活性成分的稳定剂为PEG修饰的脂质体纳米球，其制备方法参考文献：王向涛,李沙,张小滨,侯新朴.PEG修饰脂质体对阿霉素载药量的影响.北京大学学报(医学版),2002,34(3):286-289；或者优选BSA纳米球，其制备方法参考申请人发表的论文：Z.Shen,W.Wei,H.Tanaka,K.Kohama,G.Ma,T.Dobashi,Y.Maki,H.Wang,J.Bi,S.Dai.“A galactosamine-mediated drug delivery carrier for targeted liver cancer therapy.Pharmacological Research”,2011,64:410-419。 

另一优选例中，该稳定剂经冷冻干燥后，可以具有增强超声造影成像信号的功能。该稳定剂的粒径优选为30-250纳米，更佳为50-200纳米。 

另一优选例中，以重量为基准，所述核心载体、药物活性成分和稳定剂的含量比为1：0.01：0.4至1：0.5：1。较佳地，该核心载体、药物和稳定剂的含量比为1：0.01：0.5至1：0.5：1。更佳地为1：0.01：0.5至1：0.1：0.8。 

另一优选例中，该复合药物的粒径为10至200纳米。更佳地为50至150纳 米。 

另一优选例中，该三元纳米复合药物为具有前述的超声激活性质且含有抗肿瘤药物的复合纳米结构，优选TiO₂-阿霉素，更优选PEG包裹的TiO₂-阿霉素；或者是同时具有前述的超声激活性质与T₁加权MRI信号且含有抗肿瘤药物的复合纳米结构，优选PEG包裹的Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素；或者是同时具有前述的超声激活性质与T2加权MRI信号且含有抗肿瘤药物的复合纳米结构，优选PEG包裹的Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素；或者是同时具有前述的超声激活性质与CT信号且含有抗肿瘤药物的复合纳米结构，优选PEG包裹的Au-TiO₂-阿霉素；或者是同时具有前述的超声激活性质与近红外激发上转换荧光信号且含有抗肿瘤药物的复合纳米结构，优选PEG包裹的NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素。 

本发明的三元纳米复合药物具有超声激活性质，即该三元纳米复合药物经频率优选为800-10000K Hz且能量为优选为0.5-2W/cm²的超声波辐射后，能够在生物组织内产生OH¹、OH、H₂O₂、O等活性自由基（ROS）。 

制备三元纳米复合药物的方法 

制备上述本发明三元纳米复合药物的方法，其包含以下步骤： 

(a)将所述核心载体分散于水中，从而形成核心载体分散液； 

(b)混合所述核心载体分散液与所述药物活性成分，从而形成二元水溶胶；和 

(c)混合所述二元水溶胶与含所述稳定剂的溶液，从而形成所述三元纳米复合药物。 

另一优选例中，该方法还包含步骤(d)，其用于先活化步骤(c)得到的三元纳米复合药物，和使用含有配体分子的溶液对所述活化后的三元纳米复合药物进行表面修饰，从而获得包括表面修饰层的三元纳米复合药物，所述表面修饰层含有配体分子。 

三元纳米复合药物用于制备治疗肿瘤的药学组合物的用途 

本发明还提供一种如前述的三元纳米复合药物用于制备治疗肿瘤的药学组合物的用途。 

另一优选例中，该三元纳米复合药物是用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途。 

使用本发明三元纳米复合药物作用于肿瘤，通过一定剂量超声波辐射肿瘤部位，可实现超声波治疗与化疗协同的肿瘤靶向治疗，使用医学成像仪器可进行肿瘤部位成像或者对两种治疗模式的协同效果进行实时疗效评价。 

治疗肿瘤时，可以通过静脉滴注，或者通过肿瘤部位注射，或者通过肿瘤部位涂抹的方式，将该三元纳米复合药物投药于肿瘤部位。 

另一优选例中，实现超声波治疗与化疗协同的治疗可以使用频率为800-10000KHz，最高能量为2W/cm²的超声波辐射瘤部位。更佳地频率为1000KHz，能量为0.5W/cm²。 

适用于该三元纳米复合药物治疗的肿瘤可以是对化疗药物敏感的肿瘤，或者是多药耐药肿瘤。 

该超声波治疗与化疗协同的肿瘤靶向治疗的机理推测为：投药后，该三元纳米复合药物靶向富集于肿瘤组织、肿瘤细胞将该三元纳米复合药物摄入，然后其中的药物活性成分在细胞内被释放，其中的TiO₂或者ZrO₂经超声波辐射产生OH¹、OH、H₂O₂、O等ROS，药物活性成分与自由基共同对肿瘤细胞进行杀伤或破坏，从而实现两种治疗模式的协同；或者是投药后，该三元纳米复合药物靶向富集于肿瘤组织后，由于肿瘤组织的酸性微环境，药物活性成分被释放，给予的超声辐射增强了药物活性成分对细胞的渗透，提高了药物活性成分对肿瘤的杀伤；或者是前述两种情况的综合。 

所述医学成像仪器可以是磁共振成像仪、电子计算机X射线断层扫描仪，或者是能侦测材料在近红外光激发后产生上转换荧光现象的仪器。 

超声波治疗系统 

本发明第一种超声波治疗系统包含用于发射超声波的装置和如前述的三元纳米复合药物。 

适用于本发明的用于发射超声波的装置可为已知的医疗用的超声波装置，只要能发射出前述频率与能量范围即可。 

二元纳米复合药物用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途，与超声波治疗系统 

本发明也提供将二元纳米复合药物用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途，该二元纳米复合药物包含核心载体与负载于所述核心载体上的药物活性成分，且核心载体与药物活性成分的定义分别与前述三元纳米复合药物中所包含的核心载体与药物活性成分相同。 

另一优选例中，以重量为基准，所述核心载体与药物活性成分的含量比为1：0.01至1：0.5。更佳的为1:0.01至1:0.1。 

本发明第二种超声波治疗系统包含用于发射超声波的装置，和前述的二元纳米复合药物。该二元纳米复合药物的定义同上述。 

本发明的主要有益效果包括： 

(1)本发明提供了一种肿瘤治疗用三元纳米复合药物的制备方法，该方法简单易行，成本低廉，利于工业化生产和市场推广。 

(2)本发明三元纳米复合药物可实现超声波治疗与化疗协同的肿瘤靶向治疗，特别是多药耐药肿瘤的治疗，有效降低化疗药物的副作用。 

(3)本发明三元纳米复合药物中的核心载体是具有医学成像信号的基于该第一纳米粒子的复合纳米粒子时，能够实现肿瘤的成像诊断以及肿瘤治疗过程中的实时疗效评价。 

(4)由于超声波的非侵入性、无创性、可控性和良好的组织穿透能力，本发明提供的三元纳米复合药物可实现肿瘤，尤其是多药耐药肿瘤的靶向无创治疗与实时疗效评价。 

(5)本发明还提供将二元纳米复合药物应用于制备利用超声波激发从而治疗肿瘤的药学组合物的用途。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。。 

<材料来源> 

1.阿霉素：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；型号：D107159。 

2.PEG600：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；型号：P103727。 

3.PEG1500：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；型号：P103721。 

4.PEG4000：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；型号：P103724。 

5.牛血清白蛋白纳米球：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；型号：A104912。 

6.叶酸：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；型号：F103635。 

实施例1：PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

(1.1)制备： 

(a)TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物： 

(a-1)制备TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物： 

取粒径为30-50nm纳米、具有超声激活性质的TiO₂粉体（制备方法参考申请人发表的论文：A Wu,T Paunesku,EMB Brown,A Babbo,C Cruz,M Aslam,et al.NANO2008,3,27-36.）溶于超纯水中，制得0.075mol/L的TiO₂纳米粒子水溶胶100mL，避光、通氮气搅拌0.5小时；在搅拌状态下，逐滴加入0.005mol/L阿霉素水溶液8.25mL，避光、密闭空气搅拌12小时，使阿霉素充分吸附到TiO₂纳米粒子表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次后；投入100mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol，pH7.4）并将沉淀重悬，经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物，并保存于4℃待用；或者重复离心操作两次后，将复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用。所获得的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的粒径范围为50-70纳米。 

(a-2)TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的表征： 

采用傅立叶变换红外光谱仪、动态光散射仪对(a-1)所制备的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物进行红外吸收、Zeta电位表征。表征结果如图1所示，图1a与1b中以TiO₂/DOX曲线及柱状图表示TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的测量结果， 而TiO₂与DOX分别表示单独的TiO₂和阿霉素的测量结果(图2至图7中TiO₂/DOX、TiO₂与DOX定义相同，后面不再重复说明)，图1中a图显示阿霉素(DOX)装载到TiO₂后，没有出现新的红外吸收峰，说明阿霉素通过比较弱的作用力与TiO₂结合，b图显示在中性水溶液中TiO₂表面为负电，阿霉素装载到TiO₂后，TiO₂的Zeta电位降低，由于阿霉素分子中的氨基基团在中性水溶液中带正电，说明阿霉素通过静电吸附的方式装载于TiO₂纳米粒子表面。 

(a-3)TiO₂表面阿霉素装载率的计算 

将阿霉素溶于超纯水中，配制成浓度梯度为3.00、1.50、0.75、0.38、0.19、0.09、0.04、0.01mg/mL溶液，分别取上述溶液0.5mL，使用紫外-可见光谱仪检测不同浓度阿霉素的吸收，计算阿霉素浓度-吸收标准曲线。 

收集(a-1)中三次离心的上清液，使用紫外-可见光谱仪检测三次上清液中阿霉素的吸收，根据前一步得到的阿霉素浓度-吸收标准曲线计算三次上清液中阿霉素的含量，即未装载于TiO₂表面的阿霉素量，根据投入的阿霉素总量，计算(a-1)得到的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物中TiO₂表面阿霉素的装载率为1.1%。 

(a-4)TiO₂-阿霉素的药物体外释放规律 

取(a-1)制备的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物干粉60mg，分散于30mL超纯水中，等分为三份，每份10mL，置于三个透析袋中，将透析袋分别置于pH5、6、7的90ml磷酸盐缓冲液，将透析装置放置于37°恒温箱中透析48小时，每1小时，测量一次透析液中阿霉素的紫外-可见吸收光谱，根据(a-3)中的阿霉素浓度-吸收标准曲线，计算药物在不同酸性条件下的释放曲线。 

(b)PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的制备： 

(b-1)PEG600-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物：将(a-1)获得的100mL TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶在避光条件下，通氮气搅拌0.5小时；将0.05mol/L PEG（分子量600）溶液10mL逐滴加入到TiO₂-阿霉素水溶胶中，避光、密闭空气搅拌24小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为 12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次；投入100mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol，pH7.4）并将沉淀重悬，经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即PEG包裹的TiO₂-阿霉素纳米复合药物)，并保存于4℃待用；或者重复离心操作两次后，将三元纳米复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用。所获得的三元纳米复合药物的平均粒径为170纳米。 

(b-2)PEG1500-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物：同(b-1)，差异仅在于使用的PEG的分子量是1500。 

(b-3)PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物：同(b-1)，差异仅在于使用的PEG的分子量是4000。 

(1.2)PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的表征： 

采用动态光散射粒径分布仪对(1.1)所制备的PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物进行粒径分布表征。表征结果如图2所示，图2中以TiO₂-DOX-PEG4000表示PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的测量结果，图2显示TiO₂表面搭载药物以及PEG后，粒径明显变大。 

(1.3)抗多药耐药肿瘤细胞的评价 

(1)取实施例1制备的(1.1)三种PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(PEG分子量各为600、1500、4000)以及相同药物浓度的阿霉素无菌溶液待用。 

(2)取对数生长期的人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，或者接种于6孔细胞培养板，每孔2mL。细胞在5%CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时。 

(3)24小时过后，弃掉培养孔板中的培养基，在培养板中分别加入新鲜培养液(对照组)、含有PEG600-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的培养基、含有PEG1500-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的培养基、含有PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的培养基、含有阿霉素的培养基，在5%CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育24小时。 

(4)采用MTT法检测该三种PEG-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物对人乳腺 癌细胞的杀伤能力；通过激光共聚焦显微镜研究PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物在肿瘤细胞内的分布规律。结果分别如图3与图4所示，图3中以TiO₂-DOX-PEG600、TiO₂-DOX-PEG1500、TiO₂-DOX-PEG4000的柱状图分别表示PEG600-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物、PEG1500-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物、PEG4000-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物的测量结果，图3显示与自由的阿霉素相比，不同分子量PEG包裹的纳米复合药物能够显着提高阿霉素抗耐药肿瘤细胞的活性。图4显示（A是对照组；B是单独阿霉素组；C是PEG4000-TiO₂-阿霉素组；蓝色荧光标记细胞核，红色荧光标记阿霉素），三元纳米复合药物能够显着提高阿霉素在耐药肿瘤细胞内的分布。 

实施例2：PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

(2.1)制备： 

(a)制备Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物： 

取粒径为40-60nm纳米、具有T₂加权的磁共振信号与超声激活性质的Fe₃O₄-TiO₂纳米复合物粉体(其制备方法可以参照前述的申请人已申请的中国发明专利CN102125699A)溶于超纯水中，制得0.1mol/L的Fe₃O₄-TiO₂纳米粒子水溶胶90mL，避光、通氮气搅拌0.5小时；在搅拌状态下，逐滴加入0.005mol/L阿霉素溶液10mL，避光、密闭空气搅拌24小时，使阿霉素充分吸附到Fe₃O₄-TiO₂表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次后，投入100mL超纯水并将沉淀重悬，获得Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶。 

(b)制备PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物： 

将(a)获得的100mL Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶在避光条件下，通氮气搅拌0.5小时；将0.1mol/L PEG（分子量1500）溶液10mL逐滴加入到Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素水溶胶中，避光、密闭空气搅拌24小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次；投入100mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol，pH7.4）并将沉淀重悬，经 0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即PEG包裹的Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素纳米复合药物)，并保存于4℃待用；或者重复离心操作两次后，将三元纳米复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用。所获得的三元纳米复合药物的粒径范围为50-80纳米，由于EPR效应，能够被动靶向肿瘤组织。 

(2.2)PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物抗多药耐药肿瘤的评价（动物实验） 

(1)在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养具有多药耐药特性的肝癌细胞HepG2，稳定传代3-4代后，取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶+0.02%的EDTA消化液消化，收集细胞，离心后以含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，进行细胞计数并将细胞密度调整为1×10⁷/mL。取4-6周龄BALB/C小鼠12只，于胸部皮下注射接种200μL的多药耐药肝癌细胞HepG2，建立小鼠肝癌多药耐药肿瘤模型，饲养3天后，随机分四组：对照组（3只）、阿霉素化疗组（3只）、PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物化疗组（3只）、PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物超声协同化疗组（3只）。 

(2)取(2.1)制备的PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物无菌水溶胶、阿霉素无菌溶液、无菌生理盐水，将阿霉素浓度调整到5μg/mL。分别将PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物于胸部肿瘤部位注射100μL给药于PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物化疗组、PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物超声协同化疗组；将阿霉素无菌溶液于胸部肿瘤部位注射100μL给药于阿霉素化疗组；将无菌生理盐水于胸部肿瘤部位注射100μL给药于对照组。 

(3)上述实验组给药后，每隔1小时，使用磁共振成像仪实时观察PEG-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物在肿瘤部位聚集，根据药物聚集情况，在肿瘤部位给予适当时间的超声波辐射（频率1000K Hz、能量0.5W/cm²），并使用磁共振成像仪实时监控治疗效果，并每天观察小鼠的皮肤、反应、食欲及精神状态。 

(4)作为验证实验，实验结束后，采用心脏抽血处死小鼠，解剖检查肿瘤体 积，并采用免疫组化法观察肿瘤组织切片中P-糖蛋白的表达，评价治疗效果。 

实施例3：BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

(a)制备Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物：同(2.1)。 

(b)制备BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物： 

将(a)制备的Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物经冷冻干燥得到粉末，取50mg粉末，溶于10mL超纯水中，配制成5mg/mL水溶胶。配制0.8mg/mL的氯化钠溶液50mL，用氢氧化钠将溶液pH值调至8-11。称取50mg BSA，将其溶于氯化钠溶液中，得到1mg/mL的BSA溶液。在室温、避光磁力搅拌下，将Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素逐滴加入到BSA溶液中，并逐滴滴加6mL无水乙醇，之后再逐滴加入10%的戊二醛溶液50μL，继续在室温、避光磁力搅拌陈化处理24小时，再滴加40mg/mL的赖氨酸溶液1mL，避光磁力搅拌2小时后，将反应体系置于超纯水中，避光透析24小时，除去多余的反应物，得到BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即包埋于BSA纳米球的Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素纳米复合物)，其粒径为80-130nm。经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物，并保存于4℃待用；或者将BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用。获得的干燥粉末可以具有增强超声造影信号的功能。 

实施例4：叶酸-BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

取实施例3制备的BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物10mL，室温、避光磁力搅拌下，加入4μL碳化二亚胺(简称EDAC)(50mmol/L)和6μL N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称NHS)(40mmol/L)对BSA表面的羧基活化，逐滴加入10mmol/L的叶酸溶液1ml，室温、避光磁力搅拌反应12小时。反应结束后，将反应体系置于超纯水中，避光透析24小时，除去多余的反应物，得到叶酸-BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即叶酸修饰的主动靶向肿瘤细胞的BSA-Fe₃O₄-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物)。此复合药物经0.2μm滤膜过滤后，并保存于4℃待用；或者将复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用。 

实施例5：PEG-Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

(a)制备Gd₂O₃-TiO₂纳米复合物： 

称取六水硝酸钆（Gd(NO₃)₃·6H₂O）0.006mol，将其溶解到20mL一缩二乙二醇中，在140℃下磁力搅拌，得到A溶液待用。称取0.01mmol氢氧化钠（NaOH），将其溶解40mL一缩二乙二醇中，磁力搅拌，得到B溶液待用。将A溶液加入B溶液中，在140℃下磁力搅拌1小时，180℃下磁力搅拌4小时。将反应液进行透析：透析袋截留分子量3500，透析6次。将1.8mol/L的钛酸四丁酯溶液10mL逐滴加入上述透析液，继续搅拌；反应8小时后，向生成物中加入0.0008mol/L的CTAB15mL，并继续搅拌30min；在室温中进行陈化处理，陈化时间为18小时；将生成物进行离心，得到纯净的Gd₂O₃-TiO₂纳米复合物，经冷冻干燥获得固体粉末备用。 

(b)制备Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物： 

取(a)中制备的Gd₂O₃-TiO₂粉体2g，溶于90mL超纯水中，制得Gd₂O₃-TiO₂纳米粒子水溶胶，避光、通氮气搅拌0.5小时；在搅拌状态下，逐滴加入0.005mol/L阿霉素超纯水溶液10mL，避光、密闭空气搅拌12小时，使阿霉素充分吸附到Gd₂O₃-TiO₂表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次后，投入100mL超纯水并将沉淀重悬，获得Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶。 

(c)制备PEG-Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物： 

将(a)获得的100mL Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶在避光条件下，通氮气搅拌0.5小时；将0.05mol/L PEG（分子量1500）溶液10mL逐滴加入到Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素水溶胶中，避光、密闭空气搅拌12小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转/分钟，离心时间为20分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次；投入100mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol，pH7.4）并将沉淀重悬，经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的PEG-Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即PEG包裹的Gd₂O₃-TiO₂-阿霉素纳米复合药物)，并保存于4℃待用；或者重复离 心操作两次后，将复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用；所获得的复合药物的粒径范围为70纳米左右，由于EPR效应，能够被动靶向肿瘤组织。 

实施例6：PEG-Au-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

(a)制备Au-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物： 

取粒径为20nm纳米左右、具有CT信号与超声激活性质的Au-TiO₂纳米复合物粉体1g(此Au-TiO₂粉体制备方法可参考文献：Z.W.Seh,S.Liu,M.Low,S.Y.Zhang,Z.Liu,A.Mlayah,M.Y.Han.Janus Au-TiO₂ photocatalysts with strong localization of plasmonic near-fields for efficient visible-light hydrogen generation.Advanced Materials2012,24:2310-2314.)，溶于超纯水中，制得90mL Au-TiO₂纳米粒子水溶胶，避光、通氮气搅拌1小时；在搅拌状态下，逐滴加入0.01mol/L阿霉素溶液10mL，避光、密闭空气搅拌24小时，使阿霉素充分吸附到Au-TiO₂表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次后，投入100mL超纯水并将沉淀重悬，获得Au-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶。 

(b)制备PEG-Au-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物： 

将(a)获得的100mL Au-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶在避光条件下，通氮气搅拌1小时；将0.1mol/L PEG（分子量4000）溶液10mL逐滴加入到Au-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶中，避光、密闭空气搅拌24小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为30分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次；加入100mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol，pH7.4）并将沉淀重悬，经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的PEG-Au-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即PEG包裹的Au-TiO₂-阿霉素纳米复合药物)，并保存于4℃待用；或者重复离心操作两次后，将复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用；所获得的纳米复合药物的粒径范围为50纳米左右，由于EPR效应，能够被动靶向肿瘤组织。 

实施例7：PEG-NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

(a)制备NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物： 

取粒径为50-100纳米、具有近红外激发上转换荧光信号与超声激活性质的NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂纳米复合物粉体1g(此粉体制备方法可参照申请人已申请的中国发明专利CN102743752A)溶于超纯水中，NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺TiO₂纳米粒子水溶胶90mL，避光、通氮气搅拌1小时；在搅拌状态下，逐滴加入0.1mol/L阿霉素超纯水溶液10mL，避光、密闭空气搅拌24小时，使阿霉素充分吸附到NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转/分钟，离心时间为20分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次后，投入100mL超纯水并将沉淀重悬，获得NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物水溶胶。 

(b)制备PEG-NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物： 

将(a)获得的100mL NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素二元纳米复合物水溶胶在避光条件下，通氮气搅拌1小时；将0.05mol/L PEG（分子量1600）溶液20mL逐滴加入到NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素二元纳米复合物水溶胶中，避光、密闭空气搅拌24小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转/分钟，离心时间为20分钟；离心后弃去上清液，再投入100mL超纯水将沉淀重悬，重复离心操作两次；加入100mL磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol，pH7.4）并将沉淀重悬，经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的PEG-NaYF₄:Yb³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即PEG包裹的NaYF₄:Yb ³⁺/Tm³⁺-TiO₂-阿霉素纳米复合药物)，并保存于4℃待用；或者重复离心操作两次后，将纳米复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用；所获得的纳米复合药物的粒径范围为50纳米左右，由于EPR效应，能够被动靶向肿瘤组织。 

实施例8：PEG/脂质体-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物 

称取氢化大豆磷脂0.76g、胆固醇0.45g、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000单甲氧醚0.22g，各等分为两份。其中一份用10mL氯仿-正己烷(1:1,体积比)溶解，加入实施例1的(1.1)(a)制备的TiO₂-阿霉素溶液2mL，超声分散成乳后，经减压旋转蒸发至约2mL浓乳。另一份溶于5mL氯仿-正己烷(1:1,体积比)，加 入到含有TiO₂-阿霉素的浓乳中，混匀后，加入10mL赖氨酸缓冲液(0.02mol/L^-1)，充分振荡后，得到W/O/W乳剂，该乳剂经减压蒸发至不再产生气泡，吹氮气蒸发有机溶剂，室温超声2分钟，即得PEG/脂质体-TiO₂-阿霉素三元纳米复合药物(即包埋于PEG与脂质体的TiO₂-阿霉素纳米复合药物)，其粒径为60-100nm。经0.2μm滤膜过滤后，获得无菌的纳米复合药物，并保存于4℃待用；或者将纳米复合药物经冷冻干燥，获得干燥粉末备用。 

实施例9：体外评价TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的超声激发活性 

配制浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/mL的茜素红溶液，使用紫外-可见光谱仪检测吸收，绘制茜素红浓度-吸收标准曲线。取实施例1(a-1)制得的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物50mg，分散于50mL超纯水配制成1mg/mL的水溶胶并等分5份，在每份水溶胶中加入5mg茜素红。使用1000KHz、0.5W/cm²的超声波分别对5份反应液进行超声辐射，辐射时间分别为0.5、1、2、4、8分钟。辐射结束后检测茜素红的紫外-可见光谱吸收，根据前述茜素红浓度-吸收标准曲线计算分散液中残留的茜素红浓度，评价TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的超声激发活性。 

取TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物50mg，分散于50mL超纯水配制成1mg/mL的水溶胶并等分5份。使用1000K Hz、0.5W/cm²的超声波分别对5份反应液进行超声辐射，辐射时间分别为0.5、1、2、4、8分钟。辐射结束后使用ROS检测试剂盒定量评价TiO₂-阿霉素纳米复合物的超声激发活性。 

实施例10：TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物抗多药耐药肿瘤细胞的评价 

(1)取实施例1(a-1)制得的TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物以及相同药物浓度的阿霉素无菌溶液待用。 

(2)取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、多药耐药细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中，每孔100　L，或者接种于6孔细胞培养板，每孔2mL。细胞在5%CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时。 

(3)24小时过后，弃掉培养孔板中的培养基，在培养板中分别加入新鲜培养 液、含有TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的培养基、含有阿霉素的培养基，在5%CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中分别孵育2、4、6、24、48、72小时。 

(4)采用MTT法检测TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物对人乳腺癌细胞的杀伤能力；通过X射线同步辐射装置研究TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的Ti元素在肿瘤细胞内的分布规律；采用激光共聚焦显微镜研究TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物在细胞内的分布以及释放规律。检测结果如图5、图6和图7所示。 

图5是说明实施例10中使用MTT法检测TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物抗人乳腺癌细胞MCF-7(药物敏感细胞，a图)、MCF-7/ADM(多药耐药细胞，b图)的效果。图5显示TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物能够显着提高阿霉素抗耐药肿瘤细胞的效果。 

图6是说明实施例10中TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物在人乳腺癌细胞MCF-7(药物敏感细胞，a图)、MCF-7/ADM(多药耐药细胞，b图)分布的X射线同步辐射结果。图6显示纳米复合药物中Ti元素在细胞内的分布规律。 

图7是说明实施例10中TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物在人乳腺癌细胞MCF-7(药物敏感细胞，a图)、MCF-7/ADM(多药耐药细胞，b图)分布的激光共聚焦显微镜结果。图7显示纳米复合药物能够显着提高阿霉素在耐药肿瘤细胞内的摄入。(“叠加”图表示“细胞膜/核”图与“细胞膜/DOX”图的叠加结果) 

实施例11：超声与化疗双模式协同治疗多药耐药肿瘤细胞的评价 

(1)取实施例1(a-1)制备的无菌TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物以及相同药物浓度的阿霉素无菌溶液待用。 

(2)取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7、多药耐药细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中，每孔100　L，或者接种于6孔细胞培养板，每孔2mL。细胞在5%CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时。 

(3)24小时后，弃掉培养孔板中的培养基，在培养孔中分别加入新鲜培养液、含有TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物或者阿霉素的培养基，作用两小时后，使用1000KHz、0.5W/cm²的超声波分别对细胞辐射3分钟，采用施药但未被超声波 辐射的细胞作为对照，在5%CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中分别培养2、4、6、24、48、72小时。 

(4)采用MTT法检测超声与化疗协同作用下TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物对人乳腺癌细胞的杀伤效果；通过X射线同步辐射装置研究双模式治疗作用下TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物的Ti元素在细胞内的分布规律；采用激光共聚焦显微镜研究双模式治疗作用下TiO₂-阿霉素二元纳米复合药物在细胞内的分布以及释放规律；使用ROS试剂盒检测超声与化疗双模式治疗下，肿瘤细胞中ROS的生成；通过Western-blot法检测双模式治疗作用下，肿瘤细胞p-糖蛋白的表达量；用RT-PCR方法检测双模式治疗下肿瘤细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多药耐药相关基因MDR1的表达。 

综上所述，以具有超声激活性质的纳米粒子或复合纳米粒子为核心载体，将药物活性成分装载于核心载体上，再用稳定剂包裹于外面，从而可获得可用于肿瘤治疗的三元纳米复合药物，另外，也可进一步通过对纳米复合药物表面修饰靶向肿瘤的配体分子使其具有主动靶向肿瘤作用。再者，未包含稳定剂的二元纳米复合药物与本发明三元纳米复合药物在被给药后，通过一定剂量超声波辐射肿瘤部位，可实现超声波治疗与化疗协同的肿瘤靶向治疗，可使用医学成像仪器对肿瘤部位成像或者对两种治疗模式的协同效果进行实时疗效评价。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。