一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法

摘要

本发明涉及一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法。本发明使用生物反应器微载体悬浮培养工艺代替现有转瓶培养工艺生产猪圆环病毒2型抗原，该方法可以大量降低生产成本和提高产量，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％～90％，生产周期减少7天，产量提高3～10倍；因为其可以多次收获抗原，因而较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低40％～50％，产量提高3～5倍，此发明生产的抗原无血清残留，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器微载体悬浮培养技术大规模高密度生产猪圆环病毒2型 疫苗抗原的方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

目前，猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)疫苗抗原生产主要采用细胞转瓶培 养方法，少数采用细胞悬浮培养方法，转瓶工艺生产半成品抗原病毒含量较低，仅为 10^4.5～6.0TCID₅₀/ml，不能提供稳定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量应≥10^5.5TCID₅₀)，需 要进行高倍浓缩。且转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个转瓶，需多人同时进行 长时间的消化传代操作，增加污染风险；生产周期长，需要10天；效率较低，每次培养只能 收获一次；培养基中含有一定浓度的牛血清，抗原杂蛋白比较多，易造成应激反应；生产成 本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和GMP厂房；不同 生产批次及同一生产批次的转瓶之间存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异， 进而影响疫苗质量的稳定性；转瓶清洗需要大量水，并且产生的含毒废水需要专门处理，容 易对环境造成污染，如处理不当会造成生物安全和公共卫生问题。而普通细胞微载体悬浮培 养工艺，较转瓶工艺虽有提高，但仍存在较大改进空间，传统微载体悬浮培养工艺，其生产 周期仍需6～7天，且每次培养只能收获1次；仍依靠转瓶提供带毒细胞，无法避免转瓶清洗 产生的带毒废水，另传统转瓶工艺及传统反应器微载体悬浮培养工艺，其生产的抗原中存在 较高含量的血清，所产疫苗，会使动物机体产生不同程度的不良反应。

发明内容

本发明的目的在于克服现有转瓶培养法及传统细胞悬浮微载体培养法的不足之处，提供 一种应用反应器微载体悬浮培养技术大规模高密度生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。该 方法可以大量降低生产成本和提高产量，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％～90％，生产周 期减少7天，产量提高3～10倍；较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低40％～50％，产量 提高3～5倍，因为其可以收获抗原多次。且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境 要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高 产品的产量及质量。

为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：

一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，该方法包括如下步骤：

(1)种子细胞的制备将无菌生理盐水预热处理，使用预热后的生理盐水洗涤长满单层 的健康克隆细胞PK-15W作为种细胞，加入20～40ml胰酶进行消化，消化期间，时刻观察细 胞层变化，待细胞层呈白色雾状并部分脱落时，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的 有血清低糖DMEM的细胞生长液，种子细胞终止消化，迅速摇动转瓶，使壁上细胞脱落，反 复吹打分散细胞后，按照1:3至1:5的传代比例分瓶；

(2)制苗细胞的制备根据最终培养体积称取Cytodex-1微载体，使其终浓度为 5～10g/L，用PBS进行浸泡清洗，灭菌后，在搅拌式生物反应器中使用细胞生长液进行平衡， 备用；选取生长状态良好的种子细胞接种生物反应器，接种密度为1～5×10⁵个/ml；

(3)接毒随后，以最终培养体积的3％～8％接种PCV2种毒；接种后，设定反应器控 制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为80～120r/min；

(4)病毒的收获和含量测定待细胞在前述条件下，细胞生长液中培养48～72h后静置， 排出上清，加入含有伴刀豆球蛋白A和水解酪蛋白的无血清低糖DMEM细胞维持液，调整 反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min，继续维持 48～72h后静置，进行第一次上清收获，观察细胞状态，如细胞状态良好则补加与收获上清等 量的新鲜细胞维持液，在pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min的条 件下继续培养48～72h后静置，进行第二次上清收获，重复此过程直至微载体上的细胞全部脱 落，结束整个培养过程，收获上清后，将微载体进行回收处理，并将收获的抗原反复冻融3 次后作为半成品，进行病毒含量测定。

(5)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗。

(6)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗的方法，包括：将PCV2株在 PK-15W细胞中大量增殖，经甲醛灭活后加入常用佐剂进行乳化，制备常规的佐剂疫苗。

具体实施方式

采用生物反应器作为培养设备、微载体作为支持细胞生长的载体、克隆细胞PK-15W(原 名PK-15B1，CCTCC No.C200936)作为制苗细胞、PCV2作为制苗种毒；采用含有伴刀豆球 蛋白A和D-氨基葡萄糖的低糖DMEM作为制苗细胞生长液；采用含有伴刀豆球蛋白A和水解酪 蛋白的无血清低糖DMEM作为制苗细胞维持液；并包括如下步骤：

(1)种子细胞培养

利用预热的无菌生理盐水将长满的种子细胞单层洗涤一次，加入20～40ml胰酶消化液消 化，不断转动转瓶直至细胞全部脱落，加入细胞生长液终止消化，混匀，按照1:3至1:5的传 代比例分瓶；

(2)种子细胞制备接毒

1)生物反应器的准备根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道、补料 和辅助罐，换液接口，接上温度、pH、DO电极，进行电极的校正；

2)微载体的准备根据培养的体积和微载体浓度称取Cytodex-1微载体于已硅化处理的 玻璃瓶中，加入40～50倍微载体质量的PBS缓冲液浸泡1h，此后更换新鲜的PBS缓冲液继 续浸泡过夜；更换30倍体积的PBS缓冲液于玻璃瓶或生物反应器中准备灭菌；

3)灭菌灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方 可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，10L以下离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min， 灭菌结束后自然冷却；10L以上的反应器采用在位灭菌的方式。

4)制苗细胞培养在生物反应器中将Cytodex-1微载体的浓度设定为5～10g/L，并使用 制苗细胞生长液进行平衡备用；挑选生长状态良好的种子细胞接种生物反应器，接种密度为 1～5×10⁵个/ml，37℃培养(见图2中的图A)。

(3)接毒

约在细胞接入反应罐培养8～10小时，取样镜检可见接入细胞全部贴在微载体上时(见 图2中的图B)，按照细胞培养液体积的3％～5％接种接入猪圆环病毒2型种毒；接种后采用 制苗细胞生长液在37℃、pH 7.0～7.4、DO2 0％～80％、搅拌转速80～120r/min的条件下继续培 养；

(4)病毒的收获和含量测定

待细胞在前述制苗细胞生长液，pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌转速80～120r/min的条 件下培养48～72h(见图2中图C和图D)后，静置，放出上清，更换制苗细胞维持液，在 pH 7.0～7.4，DO 50％～70％，搅拌转速100～180r/min的条件下继续培养48～72h，静置后，放 出上清收获，观察若细胞大部分已脱落则连同微载体一起全部收获，若细胞状态良好则继续 收获上清，并再次加入制苗细胞维持液继续培养48～72h后静置，吸出上清收获，重复此过程 直至大部分细胞从微载体上脱落，将收获的抗原反复冻融2～3次后作为半成品，进行病毒含 量测定。

病毒含量测定采用IFA测定法，即将PCV2病毒液作10^-1到10^-8倍比稀释后用维持液分别接 种于长满单层的PK15-W细胞，每个稀释度4个孔，每孔0.2ml，同时设立阴性对照，37℃含 5％CO₂的温箱中培养48h后，无水乙醇固定细胞，用间接免疫荧光(IFA)测定每个稀释度含 有PCV2阳性细胞(呈绿色荧光)的孔数，按Karber氏法计算病毒的TCID50。

用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗

用以上所述的猪圆环病毒2型抗原制备疫苗的方法，包括：将PCV2株在PK-15W细胞中大 量增殖，经甲醛灭活加入佐剂进行乳化，制备佐剂灭活疫苗。

以上所述的生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度参数，适用于微载体 培养的生物反应器，容积为2L～1000L；所述的微载体为Cytodex-1，微载体的使用浓度为 5～10g/L，培养温度30～38℃、pH7.0～7.4、溶氧20％～80％、搅拌速度80～180r/min，微载体生 物反应器在使用前需要进行电极校正，准备，灭菌。

本发明所述种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM(AXF42461DC HYCLONE) 89％～94％，初生牛血清(NBCS，130502浙江天杭生物科技有限公司)5％～10％，双抗 1％。

本发明所述胰酶消化液中胰酶的浓度0.25％，EDTA的浓度0.02％。

本发明所述制苗细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM85％～92％，NBCS5％～10％， 双抗1％，D-氨基葡萄糖(C4875 SIGMA)0.5％～2％，伴刀豆球蛋白A(C5275 SIGMA)0.5％～ 2％。

本发明所述制苗细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM95％～98％，伴刀豆球蛋白 A0.5％～2％，水解酪蛋白(BCBL0573V 瑞士FLUKA)0.5％～2％，双抗1％。

本发明所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。

本发明所述生理盐水的成份与含量为：NaCl 0.9g/L，pH为7.0～7.4

本发明所述PBS缓冲液的成份与含量为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L；KH₂PO₄0.24g/L； Na₂HPO₄·12H₂O 3.65g/L，pH为7.2～7.4。

本发明中所用生物材料和试剂除已注明来源外，其他均商品化的产品，购自国内试剂商 店。

本发明的有益效果

本发明涉及一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法。本发明使用生物反应器 微载体细胞悬浮培养工艺代替现有转瓶细胞培养工艺生产猪圆环病毒2型抗原，该方法可以 大量降低生产成本和提高产量，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％～90％，生产周期减少7 天，产量提高3～10倍；因为其可以多次收获抗原，因而较传统反应器培养工艺单位抗原成 本降低40％～50％，产量提高3～5倍，其制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提 高制品的产量及质量。

(1)本发明用生物反应器微载体细胞悬浮培养工艺代替现有转瓶细胞培养工艺生产猪圆 环病毒2型抗原,可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒含量低、降低成本、减少成品苗 应激反应的问题，通过生产技术和工艺的改变，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全 性。

(2)本发明应用生物反应器进行疫苗生产，较转瓶工艺自动化水平高，降低人工成本， 生产工艺简单稳定，操作简便易扩大，较传统生物反应器工艺，减少细胞传代次数，降低胰 酶对细胞的损伤，无血清培养，提高病毒收获次数，并在制苗细胞维持液中添加伴刀豆球蛋 白A，提高了病毒含量，进而提高了抗原的产量及滴度，进一步降低制苗成本。

(3)本发明的产品病毒含量比传统转瓶细胞培养法提高10～30倍，病毒含量可以稳定在 10^6.5～7.0TCID₅₀/ml之间；抗原质量稳定，每罐收获的病毒抗原均一，易于规模化生产，且整个 生产工艺过程带毒部分均完全在密闭的罐体和管道中进行，为不开放状态，不涉及传统转瓶 生产工艺及传统反应器生产工艺所存在的其他生物安全和公共卫生问题。

附图说明

图1：本发明的制备工艺流程图

图2：制苗细胞接入反应罐后生长情况图中A图是刚把细胞接入培养罐中细胞悬浮在 微载体间的培养液中；图B培养了8-10h后细胞已在载体上贴壁，溶液中没有游离细胞；图 C细胞培养48小时的状态；图D72小时已有少量细胞从载体上脱落，此时换液。

实施例

以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

一种大规模高密度生产PCV2抗原的方法，包括如下步骤：

(1)种子细胞在转瓶上的培养

利用预热的无菌生理盐水将长满单层的克隆细胞PK-15W(原名PK-15B1，CCTCC  No.C200936，由南京农业大学姜平教授提供)种子细胞洗涤一次，加入30ml胰酶消化液消化， 不断转动转瓶直至细胞全部脱落，加入种子细胞生长液终止消化，混匀，按照1:3的传代比 例分瓶；

(2)种子细胞在生物反应器上的接毒培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体(GE Healthcare产品)的密度设定为5g/L，用制苗细 胞生长液进行平衡，使微载体充分浸润在细胞生长液中；然后接入(1)培养的生长状态良好 的PK-15W细胞，接种密度为4×10⁵个/ml，按照细胞培养液的5％(V/V)接种PCV2种毒(保 藏号为CGMCC No.2389，由南京农业大学姜平教授提供)种子液；接种后采用细胞生长液在pH 7.2，DO(溶氧)50％，搅拌转速80r/min的条件下培养；

(3)病毒的收获和含量测定

待细胞在前述条件下培养48h经静置后，放出上清液，加入细胞维持液，调整反应器控 制条件为：pH7.2，DO为50％，搅拌速度为120r/min的条件下继续维持48h后静置，进行 第一次上清收获，观察细胞状态，细胞状态良好，补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液， 在pH7.2，DO为50％，搅拌速度为120r/min的条件下继续培养72h后静置，进行第二次上 清收获，观察细胞状态，细胞状态良好，补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.2， DO为50％，搅拌速度为120r/min的条件下继续培养72h后静置，进行第三次上清收获，观 察细胞状态，细胞状态良好，补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.2，DO为50％， 搅拌速度为120r/min的条件下继续培养48h后静置，观测细胞基本脱落，收获上清后，将微 载体回收处理，并将几次收获的抗原混匀反复冻融3次后，过滤去除细胞碎片，进行病毒含 量测定，-20℃冷冻保存作为半成品。

半成品检验

半成品病毒含量测定采用IFA测定法，即将PCV2病毒液作10-¹到10-⁸倍用维持液比稀释后 分别接种于长满单层的PK15-W细胞，每个稀释度4个孔，每孔0.2ml，同时设立阴性对照，37℃ 含5％CO₂的温箱中培养48h后，无水乙醇固定细胞，用间接免疫荧光(IFA)测定每个稀释度 含有PCV2阳性细胞(绿色荧光)的孔数，按Karber氏法计算病毒TCID50。

根据国家标准病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀/ml。此实施例中猪圆环病毒2型的半成品病毒含 量为10^6.66TCID₅₀/ml。

上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、DO(溶氧)、搅拌速度等参数， 适用于微载体培养的生物反应器，容积为7.5L。

上述技术方案中，所述种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM 89％，NBCS 10％， 双抗1％。

上述技术方案中，所述胰酶消化液中胰酶的浓度0.25％，EDTA的浓度0.02％。

上述技术方案中，所述制苗细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM 87％，NBCS 10％， 双抗1％，D-氨基葡萄糖1％，伴刀豆球蛋白A1％。

上述技术方案中，所述制苗细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM 97％，伴刀豆球 蛋白A1％，水解酪蛋白1％，双抗1％。

上述技术方案中，所述双抗为含10000IU/ml青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。

上述技术方案中，所述生理盐水的成份与含量为：NaCl 0.9g/L，所述生理盐水的pH为 7.0～7.4

上述技术方案中,所述PBS缓冲液的成份与含量为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L；KH₂PO₄0.24g/L；Na₂HPO₄·12H₂O3.65g/L，所述PBS缓冲液的pH为7.2。

实施例2

一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，包括如下步骤：

(1)种子细胞在转瓶上的培养

利用预热的无菌生理盐水将长满单层的健康PK-15W细胞洗涤一次，加入30ml胰酶消化 液消化，不断转动转瓶直至细胞全部脱落，加入种子细胞生长液终止消化，混匀，按照1:3 的传代比例分瓶；

(2)种子细胞在生物反应器上的接毒培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为6g/L，用制苗细胞生长液进行平衡备 用；挑选生长状态良好的PK-15W种子细胞接种于生物反应器中，接种密度为2.5×10⁵个/ml， 按照细胞培养体积的5％接种PCV2种子液；接种后采用制苗细胞生长液在pH7.2，DO50％， 搅拌转速80r/min的条件下继续培养；

(3)病毒的收获和含量测定

待细胞在前述条件下培养72h后静置，排出上清，加入细胞维持液，调整反应器控制条 件为：pH7.2，DO为50％，搅拌速度为150r/min的条件下继续维持72h后静置，进行第一 次上清收获，观察细胞状态，细胞状态良好，补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.2， DO为50％，搅拌速度为120r/min的条件下继续培养72h后静置，进行第二次上清收获，观 察细胞状态，细胞状态良好，补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.2，DO为50％， 搅拌速度为150r/min的条件下继续培养72h后静置，进行第三次上清收获，观察细胞状态， 细胞状态良好，补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH 7.2，DO为50％，搅拌速度 为150r/min的条件下继续培养48h后静置，观测细胞基本脱落，收获上清后，将微载体回收 处理，并将几次收获的上清液混合后反复冻融3次，过滤去除细胞碎片后进行病毒含量测定， 并置-20℃冷冻保存作为半成品。

半成品检验及疫苗制造、成品检验

1.半成品病毒含量测定：根据国家标准病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀/ml，本实施例中的半成 品病毒含量测定结果为：10^7.0TCID₅₀/ml。

2.无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。

3.成品检验：成品检验按《猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)质量标准》要求进行，结果 无菌，无支原体，抗体效价为1：6400，符合要求。

上述技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用 于微载体培养的生物反应器，容积为100L。

上述技术方案中，所述种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM 89％，NBCS 10％， 双抗1％。

上述技术方案中，所述胰酶消化液中胰酶的质量分数0.25％，EDTA的质量分数0.02％。

上述技术方案中，所述制苗细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM 85％，NBCS 10％， 双抗1％，D-氨基葡萄糖2％，伴刀豆球蛋白A2％。

上述技术方案中，所述制苗细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM为97％，伴刀豆 球蛋白A1％，水解酪蛋白1％，双抗为1％。

上述技术方案中，所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。

上述技术方案中，所述生理盐水的成份与含量为：NaCl 0.9g/L，所述生理盐水的pH为 7.0～7.4

上述技术方案中，所述PBS缓冲液的成份与含量为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L；KH₂PO₄0.24g/L；Na₂HPO₄.12H₂O 3.65g/L，所述PBS缓冲液的pH为7.2。

实施例3

——不同工艺方法生产猪圆环病毒2疫苗抗原的比较

表1 不同工艺方法生产猪圆环病毒2疫苗抗原的比较

表1结果显示，发明工艺的TCID₅₀比起转瓶工艺明显要高0.5～1个滴度，且悬浮工艺 的收次间TCID₅₀比转瓶间的TCID₅₀更稳定，差异更小。各工艺生产的抗原配成成品苗后注 射小鼠，取血清用ELISA测定抗体，结果显示，发明工艺配成的苗抗体水平比转瓶要高。

在本说明书中所谈到的“实施例1”、“实施例2”，指的是结合该实施例描述具体特征、 结构或者特点。进一步来说，结合任一实例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张 的是结合其他实例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

尽管这里参照本发明的实例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可 以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和 精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部 件和/或布局进行多种变型和改进。