一种免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法

摘要

本发明公开了一种免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法。免疫磁珠的制备为将奥奈达希瓦氏菌特异性抗体与活化的羧基化聚苯乙烯磁性微球进行孵育即可获得。快速检测方法为将免疫磁珠放入样品溶液中，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合；去除样品基质得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体，洗涤干净，加显色液发生显色反应，再加入硫酸溶液终止显色反应，检测其OD450nm值，若OD450nm值0.029以上，说明样品中含有奥奈达希瓦氏菌。本发明方法具有较高的灵敏度，检测限为5.0×103cfu/ml，操作方便、迅速，可用于实地现场检测；且具有很好的特异性，检测结果几乎不受其他常见微生物的影响。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法。

背景技术

奥奈达希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1，S. oneidensis）属于γ-变形菌纲的革兰氏阴性兼性厌氧菌，广泛存在于海水，海洋沉积物和淡水环境。在厌氧条件下，奥奈达希瓦氏菌能够在降解有机物的同时还原重金属离子。它在环境污染修复领域具有广泛的应用前景，例如它直接能够将水溶性的U (VI)) 还原成U (IV)。此外它还能还原硫代硫酸盐产生硫离子，继而与重金属离子结合形成硫化物沉淀。鉴于奥奈达希瓦氏菌在环境领域的应用前景，开发低成本的快速检测方法具有重要意义。目前，针对奥奈达希瓦氏菌的检测方法，有表面增强拉曼光谱法和微阵列杂交法。然而，这些方法不但操作复杂而且检测灵敏度较低。

免疫磁分离技术是免疫学和磁性载体技术相结合而发展起来的一种新型富集分离技术。该技术采用的磁性微球包被有特异性抗体，可与相应的靶物质特异性结合形成免疫磁珠抗原复合物，通过外加磁场作用，免疫磁珠抗原复合物和溶液快速分离。因此，具有检测时间短、灵敏度较高和不受样品基质影响等优点。近年来，采用免疫磁分离技术与现代信号放大系统相结合的原理，开发了众多新型检测方法。例如，免疫磁珠分离技术与PCR、流式细胞术和ELISA等相结合。但是，这些方法具有检测时间长、成本高和需要复杂的仪器等。已有研究表明，奥奈达希瓦氏菌80％的膜结合的c型细胞色素位于细胞外膜，而且这些C型细胞色素与辣根过氧化物（HRP）具有相似的过氧化氢酶活性。对现有的技术检索发现，目前还没有针对奥奈达希瓦氏菌的免疫磁分离检测方法。因此，利用奥奈达希瓦氏菌细胞外膜过氧化氢酶活性，结合免疫磁珠分离技术，可以开发出一种新型的奥奈达希瓦氏菌的快速检测方法。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明能过研究，将基于奥奈达希瓦氏菌胞外过氧化氢酶活性的信号放大作用与免疫磁珠分离技术相结合进行创造性地结合，构建快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法，该方法具有特异性高，操作简单，检测迅速。

本发明的目的在于提供一种免疫磁珠。

本发明的另一目的在于提供快一种快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种免疫磁珠，其制备方法包括以下步骤：

1）制备奥奈达希瓦氏菌特异性抗体；

2）将羧基化聚苯乙烯磁性微球活化，洗涤干净，然后与步骤1）中制备的奥奈达希瓦氏菌特异性抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合；

3）将孵育的磁珠洗涤干净，然后封闭，清洗干净，4℃保存，即可获得免疫磁珠。

一种快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法，包括以下步骤：

1）将上述免疫磁珠加入待测样品溶液中，在18～27℃下振荡反应，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合；

2）步骤1）中结合反应完成后，用磁铁将免疫磁珠与样品基质分开，去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体； 

3）将2）中得到的免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体洗涤干净，加入显色液，发生显色反应，使蓝色产物生成完全； 

4）向蓝色产物中加入硫酸溶液终止显色反应，蓝色产物转化为黄色产物，检测其在450纳米处OD值，若OD值在0.029以上，说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。

进一步的，步骤1）中免疫磁珠与样品溶液体积比为（1～5）：50。

进一步的，步骤1）中所述振荡反应的时间为10～70min。

进一步的，步骤3）中所述洗涤的具体过程为先用含4～6%（v/v）吐温20的PBS缓冲液洗涤3～4次，再用纯水洗涤干净。

进一步的，步骤3）中所述显色液的体积与样品溶液体积的比为（0.8～1.2）：5。

进一步的，步骤3）中所述显色液含有的0.1～5mM过氧化氢，90～110mM柠檬酸钠，190～210mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺，pH值为 4～5。

进一步的，步骤3）中所述显色反应时间为5～60min。

本发明的有益效果是：

（1）本发明所述的免疫磁珠具有完全超顺磁性，单分散性，悬浮性好；

（2）奥奈达希瓦氏菌具有胞外过氧化氢酶活性，在过氧化氢存在下能够催化氧化四甲基联苯胺，产生蓝色反应产物，达到快速检测的目的；

（3）本发明所述的奥奈达希瓦氏菌的检测方法具有较高的灵敏度，对奥奈达希瓦氏菌的检测限为5.0×10³ cfu/ml，检测过程方便、迅速，可用于实地现场检测；

（4）本发明所述的奥奈达希瓦氏菌检测方法具有很好的特异性，常见的其他微生物对检测几乎不产生影响。

附图说明

图1为免疫磁珠制备示意图；

图2为快速检测奥奈达希瓦氏菌的示意图；

图3为奥奈达希瓦氏菌和免疫磁珠复合体的光学显微镜头和扫描电镜图；

图4为奥奈达希瓦氏菌和免疫磁珠的类过氧化物酶活性检测；

图5为快速检测奥奈达希瓦氏菌的工作条件的优化；

图6为奥奈达希瓦氏菌检测的回归曲线；

图7为特异性实验结果图；

图8为样品基质成分对本发明检测方法的影响。

具体实施方式

免疫磁珠的制备

（1）制备免疫抗原：所述免疫抗原采用1%福尔马林灭活奥奈达希瓦氏菌液而制成；

（2）制备奥奈达希瓦氏菌特异性抗体：所述奥奈达希瓦氏菌特异性抗体采用灭活免疫抗原免疫新西兰白兔方法得到抗血清，并且采用两步硫酸铵盐析法纯化抗血清，获得奥奈达希瓦氏菌特异性抗体；

（3）制备免疫磁珠：所述免疫磁珠采用纯化的奥奈达希瓦氏菌特异性抗体与活化的羧基化聚苯乙烯磁性微球振荡孵育偶联制备而成；

快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法

1）将上述制备的免疫磁珠加到待测样品液中，室温（18～27℃）振荡反应10～70min，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合；其中免疫磁珠与样品溶液体积比为（1～5）：50；

2）用磁铁将免疫磁珠与样品基质分开，去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体； 

3）将2）中得到的免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体洗涤干净，加入显色液，显色液的体积与样品溶液体积的比为（0.8～1.2）：5，发生显色反应5～60min，使蓝色产物生成完全； 

4）向蓝色产物中加入硫酸溶液终止显色反应，蓝色产物转化为黄色产物，检测其在450纳米处OD值，若OD值在0.029以上，说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。

优选的，步骤1）中免疫磁珠与样品溶液体积比为4：50。

优选的，步骤1）中所述振荡反应的时间为50min。

优选的，步骤3）中所述显色液的体积与样品溶液体积的比为1：5

优选的，步骤3）中所述洗涤的具体过程为先用含4～6%（v/v）吐温20的PBS缓冲液洗涤3～4次，再用纯水洗涤干净。

优选的，步骤3）中所述显色液含有的0.1～5mM过氧化氢，90～110mM柠檬酸钠，190～210mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺，pH值为 4～5。

最优选的，步骤3）中所述显色液含有2mM过氧化氢，100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺，pH为 4.3。

优选的，步骤3）中所述显色反应时间为30min。

下面简要介绍一下本发明方法的技术原理：

在有奥奈达希瓦氏菌存在下，免疫磁珠与奥奈达希瓦氏菌发生抗原抗体结合形成免疫复合体；在外磁场作用下，免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体与样品基质分离，以移液器吸取样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体；用含有1%BSA的PBST洗涤洗去非特异性结合的奥奈达希瓦氏菌；在有过氧化氢存在时，奥奈达希瓦氏菌外膜c型细胞色素催化氧化四甲基联苯胺（TMB），产生了蓝色反应产物；该蓝色产物与硫酸反应转化成黄色，可用酶标仪于450纳米处检测OD值。检测得到OD值与奥奈达希瓦氏菌数量在一定范围正相关。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：免疫磁珠的制备

（1）奥奈达希瓦氏菌特异性抗体制备

将奥奈达希瓦氏菌甘油保存液以1:100比例接种于500ml三角瓶中，在温度为30℃，转速160rpm的恒温摇床中振荡培养16h。将培养菌液以5000g离心20min，收集沉淀，以PBS洗涤3遍后，以PBS将菌液浓度调至10⁹cfu/mL。以1%福尔马林灭活菌悬液24h后，再以PBS洗涤3遍，将菌液浓度调至10⁸cfu/mL，并且与弗氏佐剂按照1:1（V/V)充分乳化制得免疫抗原。将制备抗原免疫新西兰白兔，首次免疫30天后，每隔10天免疫一次，总共免疫4次。在最后一次免疫后10天，收集耳朵静脉血，分离得到奥奈达希瓦氏菌特异性抗血清。制备的抗血清以50%、33%饱和度硫酸铵各盐析一次，然后以PBS透析72h，将透析液以聚乙二醇20000浓缩后，分装保存于-20℃。

（2）免疫磁珠制备

如图1所示，取1ml直径为1-2μm的羧基化聚苯乙烯磁性微球，以2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液（MES）(0.05 M, pH 5.5)洗涤3次，分别加入200微升1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液（100mg/ml）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液（100mg/ml）和600微升MES，室温振荡30min。将活化的免疫磁珠以MES洗涤3次后，加入1.4mg/ml纯化奥奈达希瓦氏菌抗体，室温振荡3h后以PBS洗涤3遍，重悬于1%牛血清白蛋白溶液（W/V）进行封闭，4℃保存，即可。

实施例2：快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法

1）在1.5ml离心管中加入10～50实施例1中制备的免疫磁珠和500μL待测样品，室温（18～27℃）振荡50～60min； 

2）将离心管置于磁铁上5min，使得磁珠与溶液完全分开，用移液器从离心管底部吸去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体；

3）将2）中得到的复合体用含4～6%（v/v）吐温20的PBS洗涤液洗涤3次，用纯水洗涤1次后转移至96孔板，在96孔板中加入100μL显色液(0.1～5mM过氧化氢，90～110mM柠檬酸钠，190～210mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺，pH为4～5)，室温（18～27℃）显色反应5～60min；

4）加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，通过磁分离，取上清液，用酶标仪检测其在450nm处OD值，若OD值在0.029以上，说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。

实施例3：快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法

快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法的示意图如图2所示，具体操作步骤为：

1）在1.5ml离心管中加入40μL实施例1中制备的免疫磁珠和500μL 5.0×10⁶ CFU的奥奈达希瓦氏菌液，室温（18～27℃）振荡60min； 

2）将离心管置于磁铁上5min，使得磁珠与溶液完全分开，用移液器从离心管底部吸去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体；

3）将2）中得到的复合体用含5%（v/v）吐温20的PBS洗涤液洗涤3次，用纯水洗涤1次后转移至96孔板，在96孔板中加入100μL显色液(100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH 4.3)，室温（18～27℃）显色反应30min；

4）加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，通过磁分离，取上清液，用酶标仪检测其在450nm处OD值（OD值为0.60），即可。

为了进一步确认免疫磁珠与S. oneidensis（奥奈达希瓦氏菌）的结合是否与免疫磁珠表面的抗体有关，分别用磁珠和免疫磁珠去捕获S. oneidensis，对捕获结果进行检测，结果显示磁珠未能捕获到S. oneidensis，如图3a所示，其中光学显微镜图和扫描电镜图中均无杆状的菌体，而在免疫磁珠捕获图中（如图3b所示），其光学显微镜图和扫描电镜图中均可看到那杆状的S. oneidensis菌体，说明本发明的免疫磁珠是通过其表面的抗体与S. oneidensis菌体表面抗原的特异性识别而进行结合的。

另外，有些研究报道一些磁珠本身具有类似于过氧化物酶的活性（Wei, H. & Wang, E. Fe₃O₄ magnetic nanoparticles as peroxidase mimetics and their applications in H₂O₂ and glucose detection. Anal. Chem. 80, 2250-2254 (2008).），为了进一步确认在本发明快速检测方法中所采用磁珠是否也具有类似于过氧化物酶的活性？其中的显色反应是否受所采用的磁珠的影响？分别将S. oneidensis、细胞色素 c（阳性对照）、S. oneidensis和免疫磁珠的复合体、免疫磁珠加入含 H₂O₂和TMB 的溶液中，进行显色反应，且扫描反应液的紫外－可见光光谱，结果如图4所示，其中S. oneidensis（图4a）、细胞色素 c（图4b）、S. oneidensis和免疫磁珠的复合体（图4c）均能产生蓝色反应产物，且在650nm处具有明显的吸光峰，而免疫磁珠组（图4d）和仅含H₂O₂和TMB的阴性对照组（图4e）中均无蓝色产物，还未出现相应的吸光峰，说明本发明选用的磁珠不具有类似于过氧化物酶的活性，对本发明的检测方法不存在干扰。

实施例4：快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法

为了获得最佳的检测效果，本实施例进一步对影响检测效果的参数（免疫磁珠体积浓度、H₂O₂浓度、免疫反应时间、显色反应时间）作进一步的优化。

免疫磁珠体积浓度优化：实验操作过程同实施例2，在奥奈达希瓦氏菌液浓度为5.0×10⁶ cfu/mL，体积为500μL，H₂O₂浓度为3mM、免疫反应时间60 min、显色反应时间30min的条件下研究最佳的免疫磁珠浓度，免疫磁珠加入的体积分别选取为10、20、30、40、50μL，最后检测加入不同体积免疫磁珠的反应液在450nm 处的OD值，检测结果如图5a所示，从中可以看出当免疫磁珠加入的体积为40 μL时，最终反应液在450nm 处的OD值最高，检测效果最灵敏，故最佳的免疫磁珠体积浓度为8%（40μL /500μL）。

H₂O₂浓度优化：本发明的快速检测方法依赖于奥奈达希瓦氏菌本身的过氧化物酶活性，而过氧化物酶活性的灵敏度应该会受到H₂O₂浓度的影响，故有必要探研本发明方法中最佳的H₂O₂浓度。 

在奥奈达希瓦氏菌液浓度为5.0×10⁶ cfu/mL，体积为500μL，免疫磁珠体积浓度为8%、免疫反应时间60 min、显色反应时间30min的条件下研究最佳的H₂O₂浓度，H₂O₂浓度的体积分别选取为0.1、1、2、3、4、5 mM，最后检测加入不同浓度H₂O₂的反应液在450nm 处的OD值，检测结果如图5b所示，从中可以看出当H₂O₂浓度为2mM时，最终反应液在450nm 处的OD值最高，检测效果最灵敏，故最佳的H₂O₂浓度为2mM。

免疫反应时间优化：在奥奈达希瓦氏菌液浓度为5.0×10⁶ cfu/mL，体积为500μL，免疫磁珠体积浓度为8%、H₂O₂浓度为2mM、显色反应时间30min的条件下研究最佳免疫反应时间，免疫反应时间分别选为10、20、30、40、50、60 min，最后检测加入不同免疫反应时间后的反应液在450nm 处的OD值，检测结果如图5c所示，从中可以看出当免疫反时间为10～50min时，OD值随免疫反应时间的增长而增大，当免疫反应时间为50～60min时，OD值趋于平缓，几乎不再增大，所以最优选的免疫反应时间为50min。

显色反应时间优化：在奥奈达希瓦氏菌液浓度为5.0×10⁶ cfu/mL，体积为500μL，免疫磁珠体积浓度为8%、免疫反应时间50 min、H₂O₂浓度为2mM的条件下研究最佳的显色反应时间，显色反应时间分别选为5、10、20、30、40 min，最后检测不同显色反应时间后的反应液在450nm 处的OD值，检测结果如图5d所示，从中可以看出当显色反应时间为30min时，最终反应液在450nm 处的OD值最高，检测效果最灵敏，故最佳的显色反应时间为30min。

根据上述对各参数的优化，可获得最优的快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法，包括以下操作步骤：

1）在1.5ml离心管中加入40μL实施例1中制备的免疫磁珠和500μL 菌液样品，室温（18～27℃）振荡50min； 

2）将离心管置于磁铁上5min，使得磁珠与溶液完全分开，用移液器从离心管底部吸去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体；

3）将2）中得到的复合体用含5%（v/v）吐温20的PBS洗涤液洗涤3次，用纯水洗涤1次后转移至96孔板，在96孔板中加入100μL显色液(100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH 4.3)，室温（18～27℃）显色反应30min；

4）加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，通过磁分离，取上清液，用酶标仪检测其在450nm处OD值，OD值在0.029以上，即可说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。

下面对本明的免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法作进一步的效果评估。

一、灵敏性

将10⁸cfu/mL奥奈达希瓦氏菌悬液依次稀释为浓度分别为5.0×10⁷、5.0×10⁶、2.5×10⁶、1.25×10⁶、6.3×10⁵、3.2×10⁵、1.6×10⁵、8.0×10⁴、4.0×10⁴、2.0×10⁴、1.0×10⁴、5.0×10³cfu/mL的菌悬液，以实施例4所建立的最优检测方法检测这些不同浓度的奥奈达希瓦氏菌液，以菌体浓度为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制曲线，见图6，分析该曲线可知，其回归方程为Y=1.133^-7X + 0.027，(R²=0.9988)，根据信号噪音比等于3判断本发明方法可检测致浓度为5.0×10³cfu/mL，线性检测范围为5.0×10³～5.0×10⁶ cfu/mL。

二、特异性

分别配制浓度为5.0×10⁶cfu/ml的奥奈达希瓦氏菌菌液、大肠杆菌菌液和枯草芽孢杆菌菌液，以及空白对照，采用实施例4中确定的最优检测方法检测这些不同菌种的菌液，其OD值如图7所示，从中可以看出，本发明的免疫磁珠及其快速检测方法只对出奈达希瓦氏菌具有检测效果。说明本发明方法具有很的特异性和准确性。

为了进一步确定本发明方法适用于真实的检测过程，采集真正的河水分别配制浓度为5.0×10⁶cfu/ml的奥奈达希瓦氏菌菌液（River water + S. oneidensis）、大肠杆菌菌液(River water + E. coli)和枯草芽孢杆菌菌液(River water +B. subtilis)，以及同时含有该三种菌的混合菌液（Mixture，每种菌的浓度均为5.0×10⁶cfu/ml），以河水（River water）作为对照（如图8所示），检测结果显示，只有奥奈达希瓦氏菌菌液和混合菌液出现很强的吸光值，且二者的吸光值无显著差异（如图8所示），这说明河水中的成份及其他菌类不影响本发明免疫磁珠及其快速检测方法对奥奈达希瓦氏菌的特异性检测，本发明免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法具有很好的特异性，并适用于环境中对此菌的检测。

三、可重复性

对浓度为5.0×10⁶cfu/ml的奥奈达希瓦氏菌菌液进行5次生物学重复检测，检测结果均显示出类似的吸光值，相对准备差为5.41%，说明本发明方法具有很好的可重复性。

四、与其奥奈达希瓦氏菌检测方法的比较

与文献报道的其它奥奈达希瓦氏菌检测方法，如表面增强拉曼光谱法（Yang, X., Gu, C., Qian, F., Li, Y. & Zhang, J. Z. Highly sensitive detection of proteins and bacteria in aqueous solution using surface-enhanced Raman scattering and optical fibers. Anal. Chem. 83, 5888-5894 (2011).）和微阵列杂交法（Wu, L. et al. Development and evaluation of microarray-based whole-genome hybridization for detection of microorganisms within the context of environmental applications. Environ. Sci. Technol. 38, 6775-6782 (2004).），其最低检测限分别为10⁶cells/mL和2.5×10⁵ cells/mL相比较，本发明方法（最低检测限为5.0×10³ cells/mL）具有更好的检测性能。此外，根据文献报道，生物修复位点的低生物量水样的细菌浓度高达3×10⁶ cells/mL，因此，本发明方法能够满足生物修复过程功能微生物数量的监测。

综上所述，本发明的免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法具有较高的灵敏度，对奥奈达希瓦氏菌的检测限为5.0×10³ cfu/ml，检测过程方便、迅速，可用于奥奈达希瓦氏菌的实地现场检测；此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，常见的其他微生物及环境成分对检测不产生干扰。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。