人脐带间充质干细胞复合细胞因子在制备修复皮肤损伤的生物制剂中的应用

摘要

本发明提供了人脐带间充质干细胞复合细胞因子在制备修复皮肤损伤的生物制剂中的应用，所述的皮肤损伤包括激光灼伤，也可以是热灼伤、冷冻伤或普通外伤皮肤物理化学性损伤。本发明首次将脐带干细胞复合生长因子用于人皮肤激光损伤治疗当中，在一定保存条件下，人脐带间充质干细胞复合细胞因子可以保存最大活性，并发挥最大的损伤修复治疗作用。

说明书

技术领域

    本发明涉及一种人脐带间充质干细胞复合细胞因子在制备修复皮肤损伤的生物制剂中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

人脐带间充质干细胞是一种来自与人体脐带组织的间充质细胞，具有高度增殖、自我更新和多向分化能力。间充质干细胞来源广泛，可来源于骨髓、脂肪、脐血、胎盘、羊水、脐带等等组织。体外培养应用不同的诱导培养基可分化为软骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪、神经、皮肤等等细胞。另外，间充质干细胞具有贴壁生长的特点，方便了条件培养基的收集。

 与其他来源的间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞更方便提取，并且更易获得。在再生医学的应用中，脐带间充质干细胞具有更强的抑制内皮细胞及组织凋亡，调节免疫的作用，而这些作用与其所分泌的复合细胞因子有非常密切的作用。在脐带间充质干细胞培养过程中会分泌肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF），粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，白介素6、7、8、11，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），脑源性营养因子（brain derived neurotrophic factor），神经生长因子（nerve growth factor, NGF），以及其他还没有被分离的分子物质。所以这种复合细胞因子具有这促进皮肤组织生长，调节损伤后免疫的功能可以用于激光灼伤等理化因素造成的皮肤损伤。

 随着美容整形市场的扩大，越来越多的人群选择应用激光祛斑、光子嫩肤等方法进行面部美容。皮肤激光美容术是通过光热作用进行皮肤治疗，通过产生高能量，准确聚焦，在人皮肤组织局部产生高能量，通过去除和破坏组织达到美容的目的。但是因为治疗选择不当、操作不当等原因造成术后并发症的人群在逐年增多。因操作不当会造成过多的组织损伤，严重的炎症反应，以及毛细血管怒张等等相反的效果。主要的副作用包括水肿、水疱、色素沉着、色素减退、毛细血管扩张、皮肤敏感性增高等等。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供人脐带间充质干细胞复合细胞因子在制备修复皮肤损伤的生物制剂中的应用，所述的皮肤损伤包括激光灼伤，也可以是热灼伤、冷冻伤或普通外伤皮肤物理化学性损伤，所述的复合细胞因子为人脐带间充质干细胞所分泌的细胞因子，所述的人脐带间充质干细胞复合细胞因子通过以下步骤制备而得：

1）从人脐带组织中提取脐带间充质干细胞；

2）将脐带间充质干细胞在体外进行扩增培养；

3）脐带间充质干细胞换用无血清的条件培养基进行培养，并且将培养基进行收集；

4）将条件培养基进行离心纯化，截留分子量3.5kDa的物质；

5）将离心后培养基（含>3.5kDa分子）进行透析浓缩，得到浓缩液；

6）将浓缩液进行冻干处理，得到人脐带间充质干细胞复合细胞因子冻干粉。

更加优选地，

所述的人脐带间充质干细胞复合细胞因子通过以下步骤制备而得：

1）脐带间充质干细胞的提取：通过抽脂手术以及其他手术中获取的人体脐带组织为原料，通过胶原酶消化后离心提取脐带间充质干细胞，将脐带间充质干细胞接种于培养皿中在饱和湿度5%二氧化碳浓度，37°C恒温下培养。

2）人脐带间充质干细胞的扩增培养：人脐带间充质干细胞为长梭形贴壁培养细胞，待细胞生长至80-90%融合时进行传代培养。

3）人脐带间充质干细胞条件培养基的收集：培养细胞至第三代，融合率达到80-90%进行细胞因子的收集，应用无血清培养基进行细胞正常培养后，将经过培养的无血清培养基进行收集。

4）人脐带间充质干细胞条件培养基的离心过滤，浓缩及冻干：将所收集的间充质干细胞条件培养基进行过滤离心，所用离心滤膜为截留分子量为3.5kDa的分子滤膜。将离心后的条件培养基通过超滤的方式进行进一步的浓缩，通过Slide-A-Lyzer等透析膜浓缩2-20倍。将最终的浓缩液放置于容器中进行最终冻干，制备成冻干粉。注意全程无菌化处理。

一种含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子的修复材料，所述的修复材料包括人脐带间充质干细胞复合细胞因子和透明质酸，每10ml修复材料中含有0.1ng-100mg人脐带间充质干细胞复合细胞因子。制备方法包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞复合细胞因子浓缩液或冻干粉按照一定比例加入透明质酸中，配置成每10ml修复材料中含有0.1ng-100mg复合细胞因子的修复材料。

所述的修复材料为胶状修复材料、面膜修复材料或膏状修复材料。

本发明具有如下技术效果：

1）激光灼伤主要病理变化包括局部皮肤粘膜细胞的变性坏死以及免疫功能异常等等。按照严重程度可按照烧（灼）伤的标准三度四分法进行判定，如1度烧伤仅伤及表皮，局部红肿；二度伤及真皮，局部出现水泡；三度伤及皮肤全层，深达皮肤、肌肉、骨骼等等。但是激光灼伤也具有自身的特点，如皮肤点状损伤，后期愈合后毛细血管怒张等等。复合细胞因子具有多种细胞因子有效成分，能够对损伤组织进行修复，促进损伤组织的生长愈合，调节免疫反应等等。

2）透明质酸材料为一种酸性粘多糖，溶解后比例为0.1-10%，理想浓度为1%，是人体的一种成分，富含水分，具有特殊的保水作用，对激光创面以及其他理化损伤创面保持湿润环境。

3）脐带间充质干细胞的复合细胞因子为肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF），粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，白介素6、7、8、11，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），脑源性营养因子（brain derived neurotrophic factor），神经生长因子（nerve growth factor, NGF），以及其他还没有被分离的分子物质等多种有效成分的混合物，具有明显的治疗作用。本发明首次将脐带干细胞复合生长因子用于人皮肤激光损伤治疗当中，在一定保存条件下，复合细胞因子可以保存最大活性，并发挥最大的损伤修复治疗作用。

附图说明

图1(a1)为脐带间充质干细胞的形态图；

图1(a2)为脐带间充质干细胞培养至第三代形态图；

图1(a3)为第三代脐带间充质干细胞的流式细胞分析结果；

图2为使用上述皮肤修复材料的人皮肤二氧化碳激光点阵扫描后修复图。其中：FxCR 8mJ 照射后应用复合细胞因子（T1），FxCR 8mJ 照射后应用对照空白培养基（C1），FxCR 16mJ照射后应用复合细胞因子（T2）,FxCR 16mJ 照射后应用对照空白培养基（C2）。

图3a为 二氧化碳激光后不同组之间（T：实验组；C：对照组）应用红斑指数（Erythema index）测量恢复情况对照曲线。

图3b为 二氧化碳激光后不同组之间（T：实验组；C：对照组）应用黑色素指数（Melanin index）测量恢复情况对照曲线。

具体实施方式

实施例1   制备含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子

含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子的制备方法，包括如下步骤：

1） 脐带间充质干细胞的提取

通过抽脂手术以及其他手术中获取的人体脐带组织为原料，通过胶原酶消化后离心提取脐带间充质干细胞，将脐带间充质干细胞接种于培养皿中在饱和湿度5%二氧化碳浓度，37°C恒温下培养。

2）人脐带间充质干细胞的扩增培养

人脐带间充质干细胞为长梭形贴壁培养细胞，待细胞生长至80-90%融合时进

行传代培养。

脐带间充质干细胞的形态（a1）和培养至第三代形态（a2）如图1（a1）和图1（a2）所示，流式细胞分析如图1（a3）所示，表明抗原，CD29(99.96%,b1), CD90(47.1%,b4), CD34(0.87%,b2), CD71(0.94%,b3), 阴性对照PE(0.56%,b5), FITC(1.09%,b6)。

3）人脐带间充质干细胞条件培养基的收集

培养细胞至第三代，融合率达到80-90%进行细胞因子的收集，应用无血清培

养基进行细胞正常培养后，将经过培养的无血清培养基进行收集。

4）人脐带间充质干细胞条件培养基的离心过滤，浓缩及冻干

将所收集的间充质干细胞条件培养基进行过滤离心，所用离心滤膜为截留分子量为3.5kDa的分子滤膜。将离心后的条件培养基通过超滤的方式进行进一步的浓缩，通过Slide-A-Lyzer等透析膜浓缩2-20倍。将最终的浓缩液放置于容器中进行最终冻干，制备成冻干粉。注意全程无菌化处理。

实施例2   

选择19名过去12个月未做过二氧化碳激光的志愿者参加实验，年龄24-33岁，Fitzpatrick皮肤分级为3-4级。在每个志愿者双手臂内侧共四处应用二氧化碳激光照射，相对称区域用8mJ及16mJ的辐射计量。图2为典型照射后图片，T为实验组，C为对照组，1为8mJ辐射，2为16mJ辐射，分别为术后1、7、14天图片。

分别统计红斑指数和黑色素指数，T为实验组，C为对照组，1为8mJ辐射，2为16mJ辐射，分别为术后0、1、4、7、14、21天。

对二氧化碳激光后不同组之间（T：实验组；C：对照组）应用红斑指数（Erythema index）测量恢复情况。T1、C1为8mJ激光，T2、C2为16mJ激光。如图3a所示，第一天实验组与对照组之间有明显差异（T检验，P<0.05）。

对二氧化碳激光后不同组之间（T：实验组；C：对照组）应用黑色素指数（Melanin index）测量恢复情况。如图3b所示，在术后第1、7、14、21天细胞因子组明显降低了黑色素含量（T检验，P<0.05）。

结论：应用含有细胞因子的修复材料可以明显改善伤口的恢复情况，降低伤口的红斑指数和黑色素指数。

 

实施例3   含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子的功能性修复材料

功能性修复材料：可应用于激光灼伤、急性创伤、挫伤等等皮肤创面的修复，含有高剂量细胞因子，对新鲜或陈旧未闭合创面的修复有非常强效的作用。10ml修复材料含：HA 0.1g，超纯水约10ml，人脐带间充质干细胞复合细胞因子100mg，碱性细胞生长因子100ng，表皮生长因子10μg。制备剂型为胶状涂抹修复材料，可直接涂抹于皮肤创口，并在表面贴服透气材料防止修复材料损失。

 

实施例4   含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子的日常护理面膜

日常护理面膜：主要用于日常的皮肤护理，将细胞因子加入面膜液中混匀制备为面膜，长期面部应用可以起到皮肤美白、修复、抗衰老的作用。具体成分如下：

聚乙烯醇         12%

甘油             10%

咪唑烷基脲       1%

乙醇             5%

月桂醇聚氧乙烯醚 7%

细胞因子液       0.1%

香精、防腐剂     适量

纯化水           补充至100%

其中细胞因子液中细胞因子浓度约为0.5μg/100ml。

所制备面膜中每片约含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子0.1ng。

 

实施例5   含有人脐带间充质干细胞复合细胞因子的即时修复材料

即时修复材料：主要用于皮肤损伤后的即时修复，主要针对的损伤为表皮破损或伤及真皮组织的损伤，包括激光损伤、皮肤擦伤等等，一般在创面形成后4小时内应用。在非清洁创面，需先对创面进行清创处理，清洁创面则可直接将修复材料涂抹于创面组织后进行低温护理。即时修复材料成分包括：透明质酸1%，纯化水99%，人脐带间充质干细胞复合细胞因子10mg均匀溶解于透明质酸1%胶状液中。