控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因及其应用

摘要

本发明公开降低水稻株高、提高抗倒伏能力、增加水稻分蘖数和产量的SDT基因及其应用。SDT基因编码OsmiR156h。在半矮化多分蘖的sdt水稻突变体中，sdt基因转录的mRNA的3’-UTR长度比野生型SDT基因转录的3’-UTR短，导致sdt基因转录水平比野生型SDT基因表达水平更高。遗传分析表明sdt是一个半显性突变，它能抑制茎秆细胞的纵向分裂来控制各节间长度和株高，进而提高水稻的抗倒伏能力；同时，它能增加水稻有效分蘖数，进而提高水稻每株穗粒数和产量。本发明首次证明调控OsmiR156h基因转录mRNA的3’-UTR长度可以改变该基因的表达水平，进而实现培育具有优良性状的水稻的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。具体地，本发明涉及一种控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因及其应用。本发明还涉及该基因的非编码区序列。 

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上十分重要的粮食作物之一，水稻单产提高与保障粮食安全和农业可持续发展气息相关。在目前农业生产中，水稻产量的提高依赖于大量的外加施肥，但是这样会加大在水稻成熟期产生倒伏减产的危险性，从而又限制了肥料的施用量。应对这个矛盾的方法是水稻半矮秆基因sd1的广泛应用^1，2——该基因又被称为“绿色革命”基因，其应用导致了上世纪60年代开始影响至今的水稻大幅增产的“第一次绿色革命”^3，4。在第一次绿色革命的基础上，如何继续提高水稻单产以适应不断增长的人口和粮食需求，是水稻育种家的追求目标。尽管sd1基因已在目前农业生产中被广泛应用，但是倒伏问题仍然是一个高产育种面临的瓶颈。在高产水稻新品种培育的过程中，迫切需要发掘新型的半矮化基因，能够保证在sd1基因的应用基础上继续提高抗倒能力和产量。本发明就描述了一种新的可以提高水稻抗倒能力，同时提高水稻分蘖数和产量的水稻基因SDT(SEMID WARFAND HIGH-TILLERING)。 

发明内容

本发明涉及一种控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因及其应用。更具体地，本发明人利用水稻半矮化多分蘖突变体sdt与水稻晚3杂交构建的遗传群体，采用QTL分析和图位克隆的方法首次克隆了控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因(SDT与其3’-UTR变短的突变体sdt)，并通过构建含有SDT基因启动 子驱动下的SDT和sdt cDNA的载体转化皖稻44(野生型)材料的阳性转基因植株来验证SDT与sdt基因的功能。 

本发明的目的在于提供一种从水稻中分离克隆的一个可同时提高抗倒伏能力和产量的重要功能基因及其应用。 

本发明通过杂交，利用图位克隆的方法，将SDT基因精细定位到水稻第六号染色体长臂26.3Kb的物理范围内，该区段有三个预测的候选基因，测序比较分析表明只有其中一个基因LOC_Os06g44034的第二个外显子上检测到片段插入和缺失突变。该基因有5个外显子，编码OsmiR156h基因的pre-mRNA。编码OsmiR156h茎环结构(SEQ ID NO：5序列)位于第一个外显子，之后的第一外显子及第二到五外显子产生一个长的3’-UTR(3’-非编码区)尾巴。 

本发明的第一个方面，指通过回交和分子标记辅助筛选，构建了含有突变的半矮化多分蘖基因sdt的水稻材料，包括皖稻44-sdt、安选6-sdt、9311背景下的染色体片段置换系材料CSSL-sdt和近等基因系9311-sdt/sd1、9311-sdt/SD1、与优异等位变异OsSPL14^WFP杂交得到的近等基因系NIL-OsSPL14^WFP/sdt等。 

本发明的第二方面涉及控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列： 

(1)SEQ ID NOs：1-4中的任何一个所示的核苷酸序列； 

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列； 

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％序列同一性的核苷酸序列； 

(4)经过剪接之后与SEQ ID NOs：1-4具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％的序列同一性的核苷酸序列；； 

(5)以(1)的核苷酸序列为作用核心而衍生的核苷酸序列 

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或 

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。 

其中，控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因的野生型形式用SDT表示，其3’-UTR变短的突变体形式用sdt表示。SDT cDNA序列及其突变体、相关启动子和3’-UTR的核苷酸序列由SEQ ID NOs：1-10所示，具体参见下表1。 

本发明的第三方面包括控制水稻株高、抗倒伏能力、有效分蘖数和产量的基因的非编码区序列(包括启动子和3’-非编码区序列等)，其包含如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列： 

(1)SEQ ID NOs：6-10所示的核苷酸序列； 

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列； 

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的核苷酸序列； 

(4)(1)-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或 

(5)与(1)-(4)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。 

表1：SEQ ID NOs：1-10的序列名称及来源 

本发明的第四方面包含控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因SDT的非编码区序列的构建体，其中所述非编码区序列包括SDT基因的启动子序列和3’-非编码区序列。其中所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。并且，其中所述的SDT基因的启动子序列如SEQ ID NO：7或8所示，3’-UTR(3’-非编码区)序列如SEQ ID NO：9或10所示。 

本发明的第五方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明所述的重组构建体，或在其基因组中整合有本发明所述的多核苷酸。所述宿主细胞可以选自动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞，农杆菌细胞，优选植物细胞，最优选水稻细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。 

本发明的第六方面涉及本发明的多核苷酸或本发明的重组构建体或本发明的重组宿主细胞在改良水稻性状中的用途。本发明还涉及改良水稻性状的方法，该方法包括制备含有本发明的多核苷酸或本发明的构建体的水稻，例如，所述方法可以包括从本发明的水稻细胞再生转基因水稻，或者利用常规的转染技术将SDT或sdt基因转染到水稻细胞中获得转基因水稻植株，或者将含有本发明所述的控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加分蘖数和产量的基因的植株与另一水稻杂交。所述性状包括但不限于：株高、倒伏指数、分蘖数和产量等。 

本发明的第七方面涉及本发明中描述的SDT作为microRNA影响水稻产量的创新用途。 

本发明的第八方面涉及本发明中分离的sdt突变基因的插入序列使得sdt基因的3’-UTR长度变短，导致基因表达水平增加这种新的调控mRNA表达水平的方法及相关序列。其中所述sdt突变基因的插入序列如SEQ ID NO：6所示。 

本发明人在研究中发现SEQ ID NO：6所示的插入序列可以插入到任意目标基因(不限于SDT基因)的3’-UTR，使所述目标基因的3’-UTR变短，从而改变所述目标基因的mRNA转录水平。由此实现对所述目标基因表达的调控。此处所述的“调控”包括目标基因mRNA转录水平的上调或下调。调节所述目标基因的mRNA转录水平，将影响植物的一些 性状。 

具体地，本发明涉及一种调控目标基因表达水平的方法，所述方法包括：将包含SEQ ID NO：6的构建体转入植物细胞中，使SEQ ID NO：6插入到所述目标基因的3’-UTR，使得所述目标基因的3’-UTR长度变短，导致所述目标基因的mRNA表达水平改变，从而实现所述目标基因表达的调控。此处所述的“调控”包括目标基因mRNA转录水平的上调或下调。 

本领域技术人员应该理解，将SEQ ID NO：6插入到所述目标基因的3’-UTR可以通过常规的分子克隆方法实现，例如，通过基因重组方法，利用SEQ ID NO：6两端侧连的与目标基因特定区域互补的同源序列，与目标基因的特定区域发生同源重组，从而使SEQ ID NO：6插入到适当的位置。 

优选地，本发明还涉及SEQ ID NO：6所示的插入序列在培育产量提高的作物中的应用。本发明涉及一种培育产量提高的作物的方法，所述方法包括：将包含SEQ ID NO：6的构建体转入作物中，使SEQ ID NO：6插入到OsmiR156h基因的3’-UTR，使得所述作物中OsmiR156h基因的mRNA表达水平增加，从而获得株高降低、抗倒伏能力增强、分蘖数和产量增加的作物，其中所述作物选自水稻或小麦。 

本发明的第九方面涉及一种培育产量提高的水稻的方法。该方法包括：从本发明的包含SDT或sdt基因的水稻宿主细胞再生转基因植物，或利用常规转基因法转染本发明的核苷酸序列而得到转基因水稻，或是适量调节SDT或sdt基因的表达水平，或是适量改变OsmiR156h成熟体的表达水平，或者将含有本发明的sdt基因的植株与另一植株杂交；其中所述植物优选是株高降低、抗倒伏能力增强、分蘖数增加和产量提升。 

综上所述，本发明提供下述实施方案： 

1.控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加水稻有效分蘖数和产量的基因，其为一种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列： 

(1)SEQ ID NOs：1-4中的任何一个所示的核苷酸序列； 

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交 条件下杂交的核苷酸序列； 

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％序列同一性的核苷酸序列； 

(4)经过剪接之后与SEQ ID NOs：1-4具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％的序列同一性的核苷酸序列； 

(5)以(1)的核苷酸序列为作用核心而衍生的核苷酸序列； 

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或 

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。 

2.一种重组构建体，其特征在于包含第1项的基因的多核苷酸序列，所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。 

3.一种重组宿主细胞，其特征在于包含第1项的基因的多核苷酸序列或第2项的重组构建体，或它的基因组中整合有第1项的基因的多核苷酸序列，其中所述细胞为微生物细胞。 

4.第3项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。 

5.第3项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为农杆菌细胞。 

6.一种培育产量提高的作物的方法，所述方法包括：利用第3项的重组宿主细胞获得转基因作物，或将第1项所述的基因转染到作物细胞中获得转基因作物植株，或将含有第1项所述的控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加分蘖数和产量的基因的作物植株与另一作物植物杂交得到杂交作物植株，使得所述转基因作物或杂交作物中第1项所述的控制水稻株高、抗倒伏能力、分蘖数和产量的基因的表达量增加，从而获得株高降低、抗倒伏能力增强、分蘖数和产量增加的作物。 

7.第6项所述的方法，其中所述作物选自水稻或小麦。 

8.一种调控目标基因表达水平的方法，所述方法包括：将包含SEQ ID NO：6的构建体转入植物细胞中，使SEQ ID NO：6插入到所述目标基因的3’-UTR，使得所述目标基因的3’-UTR长度变短，影响所述目标基因的mRNA表达水平，从而实现所述目标基因表达的调控。 

9.一种培育产量提高的作物的方法，所述方法包括：将包含SEQ ID  NO：6的构建体转入作物中，使SEQ ID NO：6插入到OsmiR156h基因的3’-UTR，从而使得所述作物中OsmiR156h基因的mRNA表达水平增加，由此获得株高降低、抗倒伏能力增强、分蘖数和产量增加的作物，其中所述作物选自水稻或小麦。 

10.一种培育产量提高的水稻的方法，所述方法包括：在包含OsSPL14^WFP基因的背景下，导入SEQ ID NO：2或4所示的控制水稻株高、抗倒伏能力、分蘖数和产量的基因。 

11.一种培育产量提高的水稻的方法，所述方法包括：在包含sd1基因的背景下，导入SEQ ID NO：2或4所示的控制水稻株高、抗倒伏能力、分蘖数和产量的基因。 

12.第1项所述的控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加水稻有效分蘖数和产量的基因的启动子序列，其为SEQ ID NO：7或8。 

13.第1项所述的控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加水稻有效分蘖数和产量的基因的3’-UTR序列，其为SEQ ID NO：9或10。 

以下是对本发明中所用的一些术语的定义。除非另外指明，本发明所用的术语具有本领域普通技术人员已知的意思。 

“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子、3’-非编码区或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子、3’-非编码区或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。 

“嵌合基因”是重组核酸序列，其中启动子、3’-非编码区或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列，或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关，使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。 

“编码序列”是转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，随后在生物体中翻译RNA 以产生蛋白质。 

在本发明上下文中，“对应于”意指当不同SDT基因的核酸编码和非编码序列互相比对时，“对应于”一些计数位置的核酸是与这些位置比对，但不必是在相对于特定SDT各自核酸编码和非编码序列的这些精确数字位置中的核酸。同样，当特定SDT的编码和非编码序列与参照SDT的编码和非编码序列比对时，“对应于”参照SDT序列一些计数位置的该特定SDT序列中核酸是与参照SDT序列的这些位置比对，但不必是在该特定SDT各自核酸编码和非编码序列的这些精确数字位置中的核酸。 

这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列非天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶段特异的。 

“基因”是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。 

“异源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞非天然相关的核酸序列，包含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。 

“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关的核酸序列。 

“同源重组”是同源核酸分子间核酸片段的相互交换。 

当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有相同氨基酸序列的 多肽时，该核酸序列与参照核酸序列是“同类编码”。 

“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在，因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境如，例如重组宿主细胞或转基因植物中。 

“天然基因”指在未转化细胞的基因组中存在的基因。 

术语“天然存在”用于描述可以在自然界中发现的客体，其与人工产生的客体不同。例如，可以从自然来源分离，并没有在实验室有意进行人工修饰的、生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列是“天然存在”的。 

“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。 

“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。 

“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。 

“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。 

“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。 

“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。 

这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组 织。 

“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶11的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。 

“原生质体”是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。 

“调节元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的非编码序列。 

“改组的”核酸是通过改组方法，如这里所述的任何改组方法产生的核酸。通过人工的和可选地循环的方式(物理地或实际上)重组两个或多个核酸(或字符串)产生改组核酸。一般地，在改组方法中利用一步或多步筛选步骤以鉴定目的核酸；可以在任何重组步骤前或后进行该筛选步骤。在一些(但不是所有)改组实施方式中，期望在筛选前进行多轮重组以增加待筛选库的多样性。可选地，可以循环重复重组和筛选的全部过程。根据上下文，改组可以指重组和筛选的全部过程，或可替代地，可以仅指全部过程的重组部分。 

在两个核酸或蛋白质序列比对中的短语“基本相同”指当比较和比对以获得最大对应时，如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的，具有至少60％，优选80％，更优选90％，甚至更优选95％和最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。优选地，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域，更优选至少约100个残基的区域上，最优选地，在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式中，在编码区整个长度中序列基本相同。而且，基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的功能。 

为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列比较算法时，将检测和参照序列输入到计算机中，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序的参数。然后，根据选定的程序参数，序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序列的百分序列同一性。 

例如，通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局 部同源性算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或通过目测(通常参见，Ausubel等，下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。 

适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法，在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括：通过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对(HSPs)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值(Altschul等，1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长的HSPs。然后，这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸，直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列，用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是大于零)和N(错配残基的罚分值；总是小于零)计算积累分值。对于氨基酸序列，用记分矩阵计算积累分值。当积累比对分值从获得的最大值回落数量X，由于一个或更多负分值残基比对积累，积累分值达到或低于零，或两个序列的任一个到达终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长值(W)11，期望值(E)10，截断值100，M＝5，N＝-4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长值(W)3，期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵为缺省值(参见，Henikoff & Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))。 

除了计算百分序列同一性外，BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹 配的概率的指示。例如，如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少于约0.1，更优选少于约0.01，最优选少于约0.001，那么认为检测核酸序列与参照序列相似。 

两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，在严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现靶核酸序列的期望检测。 

在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分第2章″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier，New York中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点(T_m)约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。 

T_m是(在限定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于T_m。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃，具有1mg肝素的50％甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃，0.15MNaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃，0.2x SSC漂洗15分钟(参见，Sambrook，下文，SSC缓冲液的描述)。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45℃，1x SSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40℃，4-6x SSC漂洗15分钟。对于短探针(例如，约10到 50个核苷酸)，严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0M Na离子的盐浓度，通常约0.01到1.0Na离子浓度(或其它盐)，通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2×(或更高)表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。 

下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，2X SSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，1X SSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.5X SSC，0.1％SDS中漂洗，优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5MNaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗，更优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO₄，1mMEDTA中杂交，在65℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗。 

两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标是第一核酸编码的蛋白质与第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或特异结合。因此，蛋白质通常与第二蛋白质基本相同，例如，其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而不同。 

“合成的”指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，称更密切地类似双子叶和/或单子叶植物基因G+C含量和正常密码子分布的人工序列是合成的。 

“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。 

“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核 酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”，或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。 

本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。 

生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989， 分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，Greene Publishing Associates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。 

附图简述 

下述有白色标尺的图片不加以说明的是20em。 

图1显示皖稻44背景下的一对近等基因系(WD44-SDT和WD44-sdt)的株型及产量性状比较。(a)株型比较；(b)茎秆各节的长度比较；(c)倒一节细胞纵向切片比较，白色标尺：0.1mm；(d)～(m)近等基因系间倒伏指数、开花时间、分蘖数、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗粒数、千粒重、单株产量和收获指数比较。 

图2显示对sdt基因的图位克隆。(a)用于图位克隆构建遗传群体所用的两个亲本晚三和sdt突变体株型比较；(b)9311与9311背景下含有sdt基因的染色体片段置换系之间株型比较；(c)图位克隆示意图，最终区段卡位在水稻六号染色体长臂介于3554P2和5453P1之间26.3-kb的区域，LOC_Os06g44034基因位点编码OsmiR156h的前体mRNA——该microRNA编码位置位于第一外显子，而第二外显子测序发现131bp的缺 失和来自线粒体的ccmB基因的插入突变；(d)自身启动子驱动从sdt突变体分离得到的OsmiR156h前体cDNA可以抑制皖稻44-SDT高秆的表型；(e)SDT基因产物比sdt基因产物要在3’-UTR端更长；(f)在不同组织部位检测OsmiR156h表达情况；(g)用Northern blot来检测一对近等基因系材料的茎秆和分蘖成熟体OsmiR156h的表达情况；(h)WD44-sdt与携带OsSPL14基因优异等位变异位点OsSPL14^WFP水稻杂交分离出来的含及不含OsSPL14^WFP位点的WD44-sdt背景植株的表型比较。 

图3显示的是分别从WD44-SDT和WD44-sdt分离到的DNA在LOC_Os06g44034这个基因位点的序列比对，可以看到WD44-sdt中的DNA与WD44-SDT相比在第二外显子有131bp的缺失并加上反向插入来自线粒体的ccmB基因片段。 

图4显示的是OsmiR156h的前体mRNA在一对近等基因系材料中的序列比对，可以发现WD44-sdt中在发生缺失及插入的第二外显子之后mRNA序列被一小段来源于线粒体ccmB基因的片段所替代；利用特异引物扩增cDNA片段预测mRNA长度从原来的1552nt缩短到987nt。参见图2的e。 

图5显示的是9311背景下sd1与sdt基因的不同等位变异遗传互作效应以及对杂交稻产量的影响。(a)在9311背景下，四个近等基因系9311-SD1/SDT，9311-SD1/sdt，9311-sd1/SDT和9311-sd1/sdt株型对比；(b)(a)中描述材料的分蘖数比较结果；(c)(a)中材料的倒伏指数比较结果；(d)近等基因系安选6(Anxuan6)和安选6-sdt(Anxuan6-sdt)作为父本分别跟新安S(XinanS)作为母本不育系杂交F1代的株型比较；(e)～(k)各农艺性状比较：开花时间(e)、株高(f)、分蘖数(g)、千粒重(h)、每穗粒数(i)、倒伏指数(j)、单株产量(k)。 

图6显示将优异等位变异OsSPL14^WFP与sdt进行聚合选育的近等基因系材料NIL-OsSPL14^WFP/SDT和OsSPL14^WFP/sdt性状对比。(a)株型比较；(b)～(f)产量相关性状对比：倒伏指数(b)、分蘖数(c)、千粒重(d)、每穗粒数(e)、单株产量(f)。 

图7显示将含有35S启动子驱动的水稻sdt基因的载体转入小麦科农199后得到的转基因阳性小麦植株与非转基因科农199对照比矮化明显， 且分蘖数明显增多。 

序列表描述 

在序列表中，为描述方便，不论DNA或mRNA序列其中的碱基t或相对应的u都使用t表示，这里t可以视为与u等效。 

SEQ ID NO：1：SDTcDNA序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO：2：sdt cDNA序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：3：SDTgDNA序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO：4：sdt gDNA序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：5：OsmiR156h茎环结构序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：6：sdt gDNA插入序列(部分，来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：7：SDT启动子序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO：8：sdt启动子序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO.9：SDT cDNA3’-UTR序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO.10：sdt cDNA3’-UTR序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：11：sdt基因位点特异引物F； 

SEQ ID NO：12：sdt基因位点特异引物R； 

SEQ ID NO：13：OsSPL14^WFP基因启动子序列(5kb)。 

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明确定了一个可以改变水稻株高、倒伏指数、有效分蘖数和产量的基因SDT，该基因位于水稻第六号染色体长臂，该基因表达量适当上升可导致植株半矮化、倒伏指数降低、有效分蘖数增加、单株产量提高。本发明人将该控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加分蘖数和产量的基因命名为SDT。 

植物转化 

在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的控制株高和分蘖数的mRNA/cDNA/microRNA。可将本发明的控制株高和分蘖数的基因的核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，将所述控 制株高和分蘖数的基因的核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。 

一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。 

优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应株高和分蘖数改变的microRNA的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。其真正活性序列存在于一个相对较小的区域，可参看SEQ ID NO：5。此外，可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP0385962(Monsanto)，EP0359472(Lubrizol)和WO93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法，用本领域熟知的位点定向诱变技术，PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行的所有改变，如上述那些改变。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，下列实施例仅用于进一步说明本发明，而不用来限制本发明的精神和范围。 

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。 

实施例1：SDT近等基因系的构建 

本发明人以常规粳稻品种皖稻44(1997年安徽审定，编号：皖品审97010204)为轮回亲本，以自然突变的半矮化多分蘖突变体sdt为供体亲 本进行连续多代的回交。在BC_sF₂群体中，根据株高降低、分蘖数增加的表型以及卡位目标区段的PCR跟踪选择单株。除了对目标区段进行选择外，还对目标性状以外的其他染色体区段进行背景扫描，最终获得与皖稻44遗传背景十分接近的近等基因系皖稻44-sdt(WD44-sdt)和皖稻44-SDT(WD44-SDT)材料用于后续的研究。近等基因系WD44-sdt和WD44-SDT表型详见图1。根据近等基因系表型比较分析发现，sdt对抽穗期影响不大，但显著降低株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和提高产量。 

研究所用的分子标记是以PCR为基础的标记，主要是SSR标记(SDT基因定位和克隆所用的引物及其序列详见表2)。SSR标记均来自序列比对发现InDel区段再用在线Primer3工具对这些目标序列进行引物设计。 

表2：sdt基因图位克隆引物 

引物名称 5’-3’序列 4008P3F ttaaggccctttcgaacgta 4008P3R ccacagccagggtgtatttc 3517P1F ggcgtgtgtggagaaagaat 3517P1R gaccgtaatgcatgcaagtg 3517P2F aacctcgcatttggattttg 3517P2R ctgacctggtctccgtgatt 3554p2F gattttcgcgtcaacagagg 3554p2R cagccaaacatacgcacagt 5453P1F caagaagccaagaagcaagaa 5453P1R ggggaagactccagtgaagg 5453P2F gaaaacggagagacgcattt 5453P2R gcgagaaggaaaacgaatga 5453P3F ctagctgcagcacggactc 5453P3R cagtcagcgtgtgagagagg 5453P4F tcgatgaagtccctgtaccc 5453P4R tggatcttgttgctgctctg 3565P1F gctttttgtgatcgggtcat 3565P1R ccagcttcgtgttcatagca 3579P1F gacacgagcattgttttgct 3579P1R acactcggcattcctgattt

PCR程序按照Panaud等(1996)的方法稍加修改进行，具体为每管20μl扩增反应体系，包括：0.15μM SSR引物、200μM dNTP、1×PCR反 应缓冲液(50mM KCL，10mM Tris-HCL pH8.3，1.5mM MgCL2，0.01％明胶)、50-100ng模板DNA，1U Taq酶；反应程序为：94℃DNA变性5分钟、循环(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟)35次、72℃再延伸5分钟。扩增出的PCR产物用6％聚丙烯酰胺变性凝胶进行电泳，电压调至300V，室温下电泳约3小时。电泳完毕后，EB染色凝胶成像。 

说明：这些引物以两个亲本的基因组DNA(gDNA)为模板来扩增，PCR产物的大小存在差异，可以根据PCR产物大小差异，判定杂交后代是否携带突变的sdt基因。这些引物可以用来作为多态性分子标记，用于分子标记辅助育种。 

实施例2：SDT近等基因系的农艺性状的比较研究 

本发明人分别在安徽省合肥市科学岛实验基地和海南省陵水县实验基地试验田播种WD44-SDT和WD44-sdt(近等基因系WD44-SDT和WD44-sdt的构建详见实施例1的介绍，连续回交7代获得近等基因系)，待植株成熟后，分别统计株高(plant height)，有效分蘖数(number oftillers per plant)，倒伏指数(lodging index)，一次枝梗数(number of primary branches)，二次枝梗数目(number of secondary branches)，穗长(panicle length)，千粒重(1,000grain weight)和每穗粒数(number of grains per panicle)和单株产量等性状，具体见图1。 

具体的统计方法：在水稻成熟后，分别在田间取120株主分蘖上的穗，分别统计每穗上的穗粒数(number of grain per panicle)，一次枝梗数目(number of primary branches)，二次枝梗数目(number of secondary branches)，穗长(panicle length)等，直接计数并记录。 

粒型、粒重的测量。谷粒自然干燥后，浮水冲去秕粒，37℃恒温干燥后，在室温条件下存放3个月及以上，保证谷粒的充分干燥和各株系间含水量的相对一致。从每个株系中随机选取100粒形态正常的种子，于电子天平上进行称量其总重，随机选取120次的平均值即为粒重。 

差异显著性检测的方法：1.建立虚无假设，即先认为两者没有差异；2.通过统计运算，确定假设成立的概率P；3.根据P的大小，判断假设是否成立。我们的实验中的标准P<0.05。统计表明虽然WD44-sdt和 WD44-SDT相比在穗长、一次枝梗数、二次枝梗数目、千粒重和每穗穗粒数上略有减少(图1)，但在每株有效穗数上显著增加(图1f)，并且抗倒伏能力和单株产量以及收获指数均有显著提高(图1d和图1m)，而开花时间统计学上虽有显著差异，但二者绝对值相差不大(只存在1-2天差异)(图1e)。 

实施例3：控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加分蘖数和产量基因的获得 

本发明利用水稻晚3(株高较高，均值108cm)与半矮化多分蘖sdt突变体(株高较低，均值78cm)构建了BC₁F₂群体及BC₁F₇的重组自交系群体，发展了多态性标记(markers)，利用图位克隆技术克隆了sdt基因，其基因的基因组DNA序列(WD44-sdt gDNA)如SEQ ID NO：4所示。该基因含有4个内含子，转录产生的mRNA序列长度为987nt，如SEQ ID NO：2所示，在皖稻44中转录产生长1552nt的mRNA，如SEQ ID NO：1所示。比较WD44-sdt和WD44-SDT之间的DNA序列差异可知，WD44-sdt中SDT基因的第二外显子中部到第二内含子(1281～1411)发生长为131bp的缺失，而缺失位置被来源于水稻线粒体基因组的ccmB基因的5’端一段序列插入所替换，这段DNA的变化反映到转录产物上，就是sdt基因比SDT的转录产物在3’-UTR长度变短，如图2e、图3和图4所示。 

序列比较分析表明，该SDT基因位点是水稻miR156基因家族的成员之一，直接转录产物是OsmiR156h前体pre-mRNA；根据Xie等(2006)对该成员的描述，归为OsmiR156h基因。但MIRBase数据库(www.mirbase.org)将该位点归为osa-miR156j(accession MI0000662)。预测发现，通过二级结构被剪切才能形成最终成熟体OsmiR156h的茎环结构(stem-loop sequence)位于第一外显子(序列如SEQ ID NO.5所示)，与缺失、插入位点并不重叠，如图1所示。而两种mRNA中都有完整的包含第一外显子的5’端结构，只是mRNA的3’-UTR长度有变化——sdt基因产物比SDT基因产物要短。利用qRT-PCR检测该位点mRNA表达量发现，变短的sdt mRNA在不同的相对应的组织部位都比SDTmRNA表达要更高，如图2f所示。 

这种pre-mRNA表达量的差异反映到成熟体OsmiR156h上就是Northern blot结果表明成熟体OsmiR156h在WD44-sdt的组织中(这里以初生二次分蘖及拔节期的茎秆为代表)含量相对于WD44-SDT也有明显提高，见图2g。这样，我们建立了OsmiR156h基因表达及OsmiR156h成熟体microRNA的含量跟矮化表型的关联，进一步功能验证需要通过转基因实验来证明。 

测序结果如下： 

SEQ ID NO：1：SDT cDNA序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO：2：sdt cDNA序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：3：SDT gDNA序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO：4：sdt gDNA序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：5：OsmiR156h茎环结构序列(来自皖稻44-sdt)； 

SEQ ID NO：6：sdt gDNA插入序列(部分，来自皖稻44-sdt)。 

说明：在后续功能验证实验中，利用了以下相关序列： 

SEQ IDNO：1：SDT cDNA序列(来自皖稻44-SDT)； 

SEQ ID NO：2：sdt cDNA序列(来自皖稻44-sdt)。 

实施例4：sdt降低水稻株高和增加分蘖数的转基因验证 

本发明人分别构建了含有SDT基因自身启动子驱动的sdt cDNA片段(其序列是SEQ ID NO：2，sdt cDNA序列来自皖稻44-sdt)及含有水稻Actin启动子驱动的SDT基因(其序列是SEQ ID NO：1，SDT cDNA序列来自皖稻44-SDT)的全长cDNA片段的水稻转基因载体(以双元植物表达载体pCAMBIA2300为基础，进行载体构建；pCAMBIA2300购自CAMBIA公司)，将其用农杆菌侵染WD44-SDT水稻愈伤的方法进行转化，并利用载体(以pCAMBIA2300为骨架)上自有抗性基因进行阳性植株的筛选。 

PCR鉴定阳性转基因植株表型观察结果发现：在WD44-SDT背景下，自身启动子驱动突变sdt基因的阳性转基因植株出现了跟WD44-sdt类似的株高变矮和分蘖数增加的表型；在WD44-SDT背景下，水稻Actin启动子驱动的野生型SDT基因的阳性转基因植株也同样出现了随着SDT基因的表达量逐渐增加而相应程度逐渐株高变矮和分蘖数增加的表型，如图2d 所示。这些转基因实验证明了SDT(OsmiR156h)基因的高水平表达导致类似于sdt突变体的矮化多分蘖表型。 

实施例5：sdt基因位点在提高水稻抗倒伏能力上的作用 

我们用倒伏指数(lodging index，LI)来作为对水稻品种的抗倒伏能力的评估参照，倒伏指数的计算公式如下：水稻主茎倒数第三节间的中心为节点至穗尖的长度(L)，乘以节点上部的所有生物材料的鲜重(M)，再除以该节点的茎秆加叶鞘所能承受的最大折断力(F)，利用公式LI＝L×M/F×0.98来计算，取60次实验的计算结果的均值。经过测量和计算，WD44-sdt的倒伏指数比WD44-SDT显著降低，表明抗倒伏能力进一步的提高。 

因为绿色革命基因sd1的作用其中重要方面就包括提高抗倒伏能力，所以本发明人对9311背景下的sd1和sdt两个基因的倒伏指数进行比较，图5显示：跟预期相符的是9311-SD1/SDT的植株倒伏指数比9311-sd1/SDT要高，相应的9311-SD1/sdt比9311-sd1/sdt倒伏指数要高，也就是说sdt基因位点的引入并不会影响sd1基因的作用发挥。我们的实验结果还发现9311-sd1/SDT比9311-sd1/sdt的倒伏指数要显著更高。这说明在现有的高产品种中广泛存在的sd1基因的背景下，导入新的半矮化sdt基因仍有进一步提高现有高产水稻品种抗倒伏能力的作用。 

实施例6：sdt提高杂交水稻组合的抗倒能力和产量 

利用安选6号(Anxuan6，皖品审04010409，恢复系)以及多代回交构建的含有sdt基因位点的近等基因系安选6号-sdt(Anxuan6-sdt)为父本，分别与新安S(XinanS，皖品审05010459，不育系)作为母本的构建F1杂交组合。在合肥进行F1代杂交水稻测产对比实验，并对F1代杂交水稻的一些重要的农艺性状进行测量和比较，如图5e～k所示。结果表明，在两对杂交组合产生的两种杂交F1水稻中，抽穗期、每穗粒数、千粒重差异不大；倒伏指数明显下降，每株分蘖数有极显著差异，导致单株产量上新的杂交组合比原有的新两优6杂交组合产量有显著提升(增产约20％)。表明sdt基因在进一步提高杂交水稻抗倒伏能力和产量上具有应用前景。 

实施例7：sdt与OsSPL14^WFP优异等位变异聚合可培育分蘖数和穗粒数协同改良的高产新品种 

OsSPL14^WFP是水稻OsSPL14基因的一个可以提高穗粒数和产量的优异等位变异；与日本晴相比，OsSPL14^WFP基因在其5kb启动子区存在5个SNP变化(SEQ ID NO.13)，导致该基因表达上调(Miura等，2010)。虽然OsSPL14^WFP能增加穗粒数，但在实际育种中存在分蘖数较少、植株偏高的缺点(Miura等，2010)。大量研究表明，水稻OsSPL14基因是OsmiR156家族的直接作用靶点(如图2e所示)，OsmiR156基因的表达量可以直接决定OsSPL14的mRNA丰度。SDT基因编码OsmiR156h，这就为sdt等位变异与OsSPL14^WFP等位变异组合共同调节株高、分蘖数和穗粒数提供了实验基础。 

在籼稻NP174背景下，我们通过连续回交构建了一对近等基因系NIL-OsSPL14^WFP/SDT和NIL-OsSPL14^WFP/sdt。田间农艺性状比较发现，sdt和OsSPL14^WFP聚合之后植株表现出分蘖数提高、株高适当降低，植株抗倒伏能力提高和水稻产量进一步提高的表型，见图6。 

与NIL-OsSPL14^WFP/SDT比较，导入sdt基因可以导致株高下降20％(株高下降约25em)，倒伏指数明显下降；尽管每穗穗粒数下降约34％，但是有效分蘖数却增加约55％，导致平均单株产量提高18％以上。这些研究表明sdt基因以及OsmiR156h-OsSPL14模块在调控水稻分蘖数和每穗穗粒数具有重要功能，sdt和OsSPL14^WFP两个优异等位变异聚合在进一步提高水稻产量上具有应用前景。 

实施例8：利用特异性引物检测sdt基因位点 

本发明人设计了一对特异性检测sdt突变型等位基因的引物，可利用PCR扩增方法，根据PCR产物大小就可以鉴定是否存在突变sdt基因，序列见SEQ ID NOs：11和12。 

实施例9：将sdt基因转入小麦中可以获得矮化多分蘖的转基因小麦 

本发明人将含有CaMV35S启动子驱动的水稻sdt基因片段的载体导入小麦品种科农199，获得转基因再生植株。转基因小麦植株表现为矮化、多分蘖的表现，见图7。这些实验说明过量表达水稻SDT(OsmiR156h) 基因可用于控制小麦的株高和分蘖数。 

实施例10：SDT基因的启动子的鉴定 

本发明人将含有受SDT基因自身启动子(SEQ ID NO：7)的驱动的sdt基因的载体转化皖稻44-SDT水稻材料，转基因阳性植株产生类似皖稻44-sdt表型：株高降低、分蘖数增多，说明SDT基因启动子对矮化多分蘖表型产生十分重要，见图2d所示。 

另外，利用皖稻44-SDT不同组织提取mRNA，qRT-PCR分析SDT基因表达研究表明SDT基因主要在分蘖(tiller)中高表达(图2f)，说明该启动子具有组织特异性表达特征。 

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