重组人血管内皮抑素的诱导表达方法

摘要

本发明的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，将工程菌发酵至发酵液OD600值为10-15，向其中加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下，培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1-0.3mmol/L，继续培养3-5h，即可。本发明的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，可满足重组人血管内皮抑素的大规模生产的需要，在较高菌体浓度下实现高效诱导表达。

说明书

技术领域

本发明属于重组人血管内皮抑素的提取纯化领域，具体涉及一种重组 人血管内皮抑素的诱导表达方法。

背景技术

人血管内皮抑素，是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑 制剂。实验表明，内皮抑素对血管内皮细胞、生长的血管可产生抑制作用， 可对肿瘤的生长和转移起到较好的抑制作用。从其作用机理来讲，人血管 内皮抑素是通过抑制人体内肿瘤组织的血液供应使肿瘤缺乏营养物质和氧 气而停止生长、进而逐步萎缩直至死亡的，相较于目前临床普遍使用的化 疗药物，具有无明显毒副作用的优点，因而受到了医学界的广泛关注。

目前，人血管内皮抑素主要是先通过基因重组技术获得携带人血管内 皮抑素基因的工程菌，再将工程菌表达目标蛋白经提取纯化而制备得到的。 在重组人血管内皮抑素的提取纯化过程中，工程菌的发酵及诱导工程菌表 达人血管内皮抑素，对能否获得较高的产品收率及较好的产品纯度的起到 关键作用。

中国专利文献CN154667A公开了一种重组人内皮抑素在大肠杆菌中的 高效表达技术，将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coli BL21(DE3)中， 筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2ml、含60-90μg/mL Kan的 LB培养液中，36-38℃，200-250rpm振荡培养2-3h，使菌液OD_600nm在0.4-0.6， 向菌液中加入浓度为0.8-1.0mol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在36-38℃ 下，180-200rpm继续振荡培养3-5h诱导内皮抑素的表达，表达量达到菌体 总蛋白的38％。

在工业的大规模生产中若采用上述方法，则需要耗费大量的培养基、 培养液，以保持菌发酵液的菌体浓度处于较低水平，而提高菌体浓度，并 同步提高诱导剂用量，则不仅会由于重组人血管内皮抑素的工程菌对诱导 剂的耐受性迅速上升、敏感性显著下降，进而不可避免的出现诱导重组人 血管内皮抑素蛋白的表达量下降的现象，无法获得较高的诱导表达量，同 时，高浓度的菌体浓度下，也需要浓度较高的培养基、培养液，而菌体在 这种环境下必然生长较快，养分易过早耗尽，进而造成菌体过早衰老而自 溶，无法获得理想的表达量。无论哪一种情况，均意味着大规模生产中重 组人血管内皮抑素的生产效率极低，会造成大量的原料耗费。因此，上述 方法虽然表达量可以达到38％，但是，该表达量仅能在少量的培养液中、 发酵液的OD_600nm值在0.4-0.6之间的条件下实现，换而言之，上述方法仅 能实现在小型实验中，低工程菌浓度下的高效诱导表达，进而获得极微量 的产品，无法适用于工业化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中的重组人血管内皮抑素诱导 表达方法不适用于工业大规模生产、生产效率较低，进而提供一种可满足 重组人血管内皮抑素的大规模生产需要、在较高菌体浓度下实现高效诱导 表达、发酵表达量高的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法。

本发明的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，包括以下步骤：将工程 菌发酵至发酵液OD₆₀₀值为10-15，向其中加入诱导剂IPTG、碳源物质以 及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下， 培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为 0.1-0.3mmol/L，继续培养3-5h，即可。

需要说明的是，所述碳源与氮源物质，其选择并不唯一，可提供菌体 发酵过程中所需的碳、氮的物质均可。本发明中，所述碳源物质为葡萄糖； 所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种。

优选的，所述葡萄糖的浓度为12-15g/L；所述酵母提取物的浓度为 4-6g/L；所述胰蛋白胨的浓度为10-20g/L；所述水解酪蛋白的浓度为10-20 g/L。最优选的，所述碳源物质为13g/L的葡萄糖；所述氮源物质为5g/L的 酵母提取物。

所述诱导剂IPTG第一次加入使发酵液中IPTG的浓度为0.3mmol/L 的量，第二次加入使发酵液中IPTG的浓度为0.2mmol/L的量。

优选的，将所述工程菌发酵至发酵液OD₆₀₀值为12.5后，向其中加入诱 导剂IPTG。

所述的工程菌发酵具体包括以下步骤：取工程菌在LB培养基中扩增 后，按发酵体积的5-8％的接种量，接种至发酵培养基中，再发酵至OD₆₀₀值为10-15。其中，所述LB培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、 氯化钠5g/L。

所述发酵培养基包括：5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、 7.5-17.5g/L水解酶蛋白、1-9g/LKH₂PO₄、10-20g/L葡萄糖。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，在工程菌 发酵至OD₆₀₀值为12.5后，向其中加入诱导剂IPTG，在30-37℃下，培养 2.5-3.5h后，再向其中加入诱导剂IPTG。将现有技术中的诱导剂一次性添 加改为了分两次添加，可有效的避免由于菌体对诱导剂耐受性上升、敏感 性下降而造成的重组人血管内皮抑素的表达量下降。尤其是，IPTG诱导 剂在上述两个时机分别以0.2-0.4mmol/L发酵液以及0.1-0.3mmol/L发酵 液的用量加入，其诱导效果较为理想，同时，结合在第一次加入诱导剂后 加入碳源物质及氮源物质，可避免在发酵初期采用高浓度培养基、培养液 而造成的菌体过早衰老，也及时补充了菌体所需的养分，保证了两次的诱 导剂加入均能实现良好的诱导效果。经实验表明，采用上述方法，可在 OD₆₀₀值为10-15的高菌体密度下，实现诱导重组人血管内皮抑素的总表 达量达30％以上，满足了重组人血管内皮抑素的大规模生产要求。

(2)本发明所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，采用的所 述发酵的培养基包括：5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、7.5-17.5g/L 水解酶蛋白、1-9g/LKH₂PO₄、10-20g/L葡萄糖。上述发酵培养基可较好的 保证菌体在发酵时所需的物质，尤其是，与发酵过程中第一次加入诱导剂 时加入的碳源物质及氮源物质相互配合，实现了更好的发酵及诱导表达效 果。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为12.5， 然后，向其中加入3.75g的诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及 5g/L的氮源物质酵母提取物，在30℃下，培养2.5h，再向其中加入2.4g 的诱导剂IPTG，继续培养4h，即可。

其中，所述发酵培养基由10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L 水解酶蛋白、1g/LKH₂PO₄、10g/L葡萄糖组成。

实施例2

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的5％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为10， 然后，向其中加入2.49g的诱导剂IPTG、15g/L的碳源物质葡萄糖、以及 6g/L的氮源物质酵母提取物，在34℃下，培养3h，再向其中加入3.75g 的诱导剂IPTG，继续培养3h，即可。

其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L 水解酶蛋白、9g/LKH₂PO₄、20g/L葡萄糖组成。

实施例3

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的8％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为15， 然后，向其中加入4.99g的诱导剂IPTG、12g/L的碳源物质葡萄糖、以及 4g/L的氮源物质酵母提取物，在37℃下，培养3.5h，再向其中加入1.25g 的诱导剂IPTG，继续培养5h，即可。

其中，所述发酵培养基由15g/L胰蛋白胨、15g/L酵母提取物、17.5g/L 水解酶蛋白、5g/LKH₂PO₄、15g/L葡萄糖组成。

实施例4

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵至OD₆₀₀值为12.5，然后，向其中加入 诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及15g/L的氮源物质胰蛋白胨， 使发酵液中IPTG的浓度为0.3mmol/L，在33℃下，培养2.5h，再向其中 加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.2mmol/L，继续培养5h， 即可。

其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L 水解酶蛋白、9g/LKH₂PO₄、18g/L葡萄糖组成。

实施例5

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵至OD₆₀₀值为12.5，然后，向其中加入 诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖、以及20g/L的氮源物质水解酪蛋 白，使发酵液中IPTG的浓度为0.2mm_ol/L，在33℃下，培养2.5h，再向 其中向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1mmol/L，继 续培养5h，即可。

其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L 水解酶蛋白、9g/LKH₂PO₄、18g/L葡萄糖组成。

实施例6

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵至OD₆₀₀值为12.5，然后，向其中加入 诱导剂IPTG、13g/L的碳源物质葡萄糖，以及10g/L的氮源物质胰蛋白胨、 15g/L的氮源物质水解酪蛋白，使发酵液中IPTG的浓度为0.4mmol/L，在 32℃下，培养2.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓 度为0.3mmol/L，继续培养5h，即可。

其中，所述发酵培养基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L 水解酶蛋白、9g/LKH₂PO₄、18g/L葡萄糖组成。

实施例7

本实施例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先将工程菌 在培养基中发酵至OD₆₀₀值为12.5，然后，向其中加入诱导剂IPTG、13g/L 的碳源物质葡萄糖、以及4g/L的氮源物质酵母提取物、20g/L的氮源物 质胰蛋白胨和10g/L的氮源物质水解酪蛋白，使发酵液中IPTG的浓度为 0.4mmol/L在30℃下，培养2.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液 中IPTG的浓度为0.2mmol/L，继续培养5h，即可。

其中，所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例1相同。

对比例1

本对比例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为12.5， 然后，然后，一次性加入6.15g的诱导剂IPTG，在30℃下，培养5h，即 可。

所述发酵培养基包括：20g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、12.5g/L 水解酶蛋白、9g/LKH₂PO₄、23g/L葡萄糖。

对比例2

本对比例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为12.5， 然后，向其中一次性加入6.15g诱导剂IPTG，13g/L的碳源物质葡萄糖、 以及5g/L的氮源物质酵母提取物，在30℃下，培养5h，即可。

所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例1相同。

对比例3

本对比例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为12.5， 然后，向其中加入3.75g的诱导剂IPTG，在30℃下，培养2.5h，再向其中 加入2.4g的诱导剂IPTG，继续培养5h，即可。

所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例1相同。

对比例4

本对比例所述的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，首先取工程菌 在LB培养基中扩增后，按发酵体积的6％的接种量，接种至规格为50L 的发酵罐内的发酵培养基中，发酵液体积为44L，发酵至OD₆₀₀值为12.5， 然后，向其中加入3.75g的诱导剂IPTG，在30℃下，培养1.5h，向其中加 入13g/L的碳源物质葡萄糖、以及5g/L的氮源物质酵母提取物，培养1h， 再向其中加入2.4g的诱导剂IPTG，继续培养5h，即可。

所述发酵培养基的组分及各组分用量均与实施例1相同。

效果实验例

为说明本发明的技术效果，对实施例1-7及对比例1-4中的重组人血 管内皮抑素的诱导表达方法的最终发酵液进行发酵表达量的测定：

(1)实验方法：

通过观察发酵过程中菌体量随发酵时间变化情况，评价菌体生长情况， 并在发酵表达结束后，采用2010版中国药典中的聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE)测定诱导表达后的发酵液中目标蛋白重组人血管内皮抑素占 总蛋白的量，记为发酵表达量。

(2)实验结果：

表1实施例1-7及对比例1-4的诱导表达测试结果

对比例1一次性向其中加入所有碳源物质、氮源物质，以及诱导剂， 菌体生长过快，在接种后6h即早衰自溶，其表达的目标蛋白仅有17％， 对比例2未分次加入诱导剂，但在后期补充了碳源物质、氮源物质，虽菌 体生长情况良好，但目标蛋白表达量不高。对比例3分次加入诱导剂，但 未补充碳源物质、氮源物质，在接种后8h即因碳源物质、氮源物质不足 而凋亡。对比例4分次加入诱导剂，也补充碳源物质、氮源物质，但其补 充碳源物质及氮源物质的时机为第一次加入诱导剂并发酵一段时间后，菌 体虽生长良好，但目标蛋白表达量仍然较低。经试验表明：采用本发明的 方法诱导菌体表达重组人血管内皮抑素，发酵表达量在30％以上，最高可 达42％。

因此，本发明的重组人血管内皮抑素的诱导表达方法，可适于大规模 生产重组人血管内皮抑素，在发酵液高菌体浓度下，实现较高的诱导表达 量。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。