一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法

摘要

一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体进行消毒；将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导得到丛生芽；将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株；将所述健壮植株置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；取完整的带根苗进行炼苗后移植于石灰岩土壤生长一个半月，再移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量贵州半蒴苣苔的优质种苗，对贵州半蒴苣苔资源保护和可持续利用具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种贵州半蒴苣苔组织培养快速繁殖方法。

背景技术

贵州半蒴苣苔,为苦苣苔科植物贵州半蒴苣苔（Hemiboea cavaleriei var. paucinervis W. T. Wang & Z. Y. Li）。多年生草本。茎上升，无毛，不分枝或分枝，花期8—10月，果期10-12月。分布于我国广西、广东、福建、湖南等省。生于山谷林下石上，海拔250-1500m。全草入药，微酸、涩，凉。清热解毒。用于治疗痈、烫伤、跌打损伤、刀伤出血，腹水。

贵州半蒴苣苔花色褐紫色或淡绿色，具有较高的园林观赏和一定的药用价值，一般生于山谷林下石上或阴处，林缘沟旁或岩石上、沟边石缝中，石灰岩山地阴湿处，对环境要求比较苛刻，加之近年来环境资源遭到严重破坏，使贵州半蒴苣苔植株数量大大减少。

发明内容

本发明的目的是采用生物技术组织培养方法，有效快速地提高贵州半蒴苣苔种苗的繁殖速度和质量，在短期内就能提供大量贵州半蒴苣苔的优质种苗。

本发明采取的技术方案是：

1、一种组织培养快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-15min、添加了2-3滴吐温-20的100 ml0.1%升汞消毒7-9min、无菌水冲洗3-5次，最后用灭菌滤纸吸去表面水分，剪成长约1cm长的外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水，

（2）顶芽分化获得丛生芽培养：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天，顶芽分化后获得丛生芽，其中MS培养基中含0.5-1.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA（萘乙酸） 、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，

（3）丛生芽继代培养：将步骤（2）中得到的试管苗不定芽置于MS增殖培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20-25天得到完整的健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0-2.0mg/L的6-BA（苄氨基腺嘌呤）、0.5-1.0mg/L的NAA、0.5-1.0mg/L KT（激动素）,25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，

（4）丛生芽生根培养：将步骤（3）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基中含1.0-1.5mg/L的IAA（吲哚乙酸）、0.5 mg/L的ABT（生根粉）、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，

（5）炼苗与移栽：步骤（4）获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内散射光照射2-4天，打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到通风良好且弱光石灰岩土壤中，在石灰岩土壤中生长一个半月后移栽大田。

采用生物技术组织培养技术，不仅可以有效快速地提高贵州半蒴苣苔种苗的繁殖速度和质量，且采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，对贵州半蒴苣苔资源保护和可持续利用具有重要价值。

具体实施方式

    下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

一种贵州半蒴苣苔组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤： 

（1）外植体的选择与消毒：取贵州半蒴苣苔顶芽作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸泡5-10min、线状自来水冲洗10-20min、添加了2-3滴吐温-20的100 ml0.1%升汞消毒7-9min、无菌水冲洗3-5次，最后用灭菌滤纸吸去表面水分，剪成长约1cm长的外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水，

（2）顶芽分化获得丛生芽快速繁殖：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12h/d的条件下培养25-30天，顶芽分化后获得大量丛生芽，其中MS培养基中含0.5-1.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA、25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，数据分析发现6-BA,NAA对贵州半蒴苣苔丛生芽增殖倍率具有显著影响，根据生长率指标确定的最适培养基激素浓度为1.5 mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，此时贵州半蒴苣苔顶芽分化倍率为5.72。

表1 不同激素对顶芽分化效果的影响

注：芽增殖倍数=（30 天后芽数－接种时芽数）/接种时芽数

（3）丛生芽壮苗培养：将步骤（2）中得到的试管苗不定芽置于MS增殖培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养20-25天得到完整的健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0-2.0mg/L的6-BA、0.5-1.5mg/L的NAA、0.1-0.4mg/L KT,25-30g/L蔗糖和4.0-4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，观察发现，壮苗培养基中6-BA浓度增加，贵州半蒴苣苔植株的高度增加长势趋好，培养基中添加0.2mg/L的KT、2.0mg/L的6-BA和1.5mg/L的NAA壮苗效果最好，壮苗指数达到5.75,而且经过壮苗后得到的植株叶片舒展，适合进行生根培养；

表2 不同激素水平对贵州半蒴苣苔丛生芽壮苗效果的影响

注：壮苗指数=[茎粗（cm）/株高（cm）+培养基上质量（g）/培养基下质量（g）]*全株质量

（4）丛生芽生根培养：将步骤（3）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培养温度23-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养25-30天得到带根的完整植株，其中MS生根培养基中含1.0-1.5mg/L的IAA、0.5 mg/L的ABT、25-30g/L蔗糖和4.0-4.4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；观察发现，培养基中IAA浓度增加，组培苗的生根率也增加；培养基中添加1.0mg/L的IBA和1.5mg/L的IAA生根效果最好，生根率达100%，平均根长达到4.68cm；

表3 不同激素水平对贵州半蒴苣苔组培苗生根效果的影响

（6）炼苗与移栽：获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内散射光照射2-4天，打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到通风良好且弱光的石灰岩及沙土壤（1:1）基质中，在石灰岩及沙土壤中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时温度条件为18-28℃，相对湿度75-80%，遮阳率60%。