包含胰液的生物试样中的目标粒子的检测方法

摘要

本发明提供在目标粒子的浓度或数密度低于现有的光分析技术的溶液中检测包含胰液的生物试样中的目标粒子的方法。具有：调制含有包含胰液的生物试样、和与目标粒子结合的荧光探针的试样溶液，使生物试样中的目标粒子与荧光探针结合的探针结合工序；和，通过扫描分子计数法计算结合有荧光探针的目标粒子的分子数的计算工序。荧光探针在与目标粒子结合的状态下以及单独存在的状态下发出的光的发光特性不同。荧光探针在与目标粒子结合的状态下，发出波长为600nm以上的荧光。

说明书

技术领域

本发明涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光学系统等能够检测到 来自溶液中的微小区域的光的光学系统来检测包含胰液的生物试样中的目 标粒子的方法。

本申请基于2011年8月30日在日本提交的日本特愿2011-187601号主张优 先权，本文援引其内容。

背景技术

随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够 进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测以及测定 单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测 技术，进行生物分子等分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的 各种装置或方法。

例如，对于荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy： FCS。例如，参见专利文献1、2、非专利文献1～3)中，使用激光共聚焦显微 镜的光学系统和光子计数技术，对于来自进出试样溶液中的微小区域内的荧 光分子或被荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度进行测定。确定由该测 定的荧光强度的自相关函数的值确定的微小区域内的荧光分子等的平均滞 留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子个数的平均值。基于该微小区域内的 荧光分子等的平均滞留时间以及滞留的分子个数的平均值，能够获得荧光分 子等的运动速度或大小、浓度这类信息。进而，也能够检测到分子的结构或 大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。需要说明的是， 前述微小区域是指显微镜的激光束被聚光的焦点区域，被称为共焦体积。

此外，提出有利用荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution  Analysis：FIDA。例如，专利文献3)或光子计数直方图(Photon Counting  Histogram：PCH。例如，专利文献4)，与FCS同样地，生成检测到的出入共 焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图。接着，通过对该直方图的分布 拟合统计学模型式，计算荧光分子等固有的明亮度的平均值和共焦体积内滞 留的分子个数的平均值。接着，根据这些信息，能够推定分子结构或大小的 变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。

进而，专利文献5、6中提出了：基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定 出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献7中提 出了一种信号运算处理技术，其用于：使用光子计数技术，测量在流式细胞 仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流 中或基板上存在的荧光粒子。

特别是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光 子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度比 以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十μL左右),测定时间也 大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。因此， 特别在对于医学和生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样 进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多 的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待能够成为低 廉或迅速地进行实验或检测的强有力的工具。

在医疗诊断中，体液为用于了解脏器状态的重要的生物试样。作为该体 液的一种的胰液也是用于了解胰脏状态的重要的生物试样，应用于细胞诊断 以及各种生物分子的测定等检査、研究中。例如，期待能够通过检测胰液中 的肿瘤标记物诊断胰脏癌的发病。

在以胰液为代表的生物试样中，通常包含有多种多样的物质，包含具 有自身荧光的物质的情况也很多。也有利用生物试样中的自身荧光的检测方 法。例如，正在研究一种诊断装置，其利用的是：通过激发光的照射使病变 组织和正常组织产生的自身荧光的强度分布产生差别，检测由生物试样产生 的自身荧光，分析该自身荧光而识别伴随着各种疾病的组织性状的变化。在 通过激发光的照射由生物组织产生的自身荧光的波长区域的长波长侧，存在 有根据生物的组织性状的差异而显示出极大强度差异的波长区域。但是，由 生物组织产生的自身荧光的最大强度存在于480nm附近的短波长侧的波长区 域，长波长区域的自身荧光的强度是微弱的。为了更加正确地检测出该微弱 的长波长区域的自身荧光的强度，提出有例如专利文献8所述的装置。在该 装置中，同时地对生物组织照射：使生物组织产生自身荧光的第1激发光、 和具有通过该激发光的照射由生物组织产生的自身荧光的波长区域的中间 波长带的波长的第2激发光。由此，长波长侧的波长区域的自身荧光的发光 强度被提高。其结果，能够使该长波长侧的波长区域的自身荧光中所混入的 干扰成分的比例相对地减少。

然而，用发光探针人为地进行标记之后，想要通过光分析技术检测生物 试样中的目标粒子时，由于以自身荧光物质为代表的来源于生物试样的各种 杂质而产生非特异信号。此处，例如，专利文献9中公开有：在通过光分析 技术检测包含血液的生物试样中的目标粒子时，将目标粒子用发出550～ 1300nm的红外以及近红外光谱的波长的生色团进行标记并检测的方法。在目 标粒子的检测中通过使用550～1300nm的波长区域的光，能够抑制由以血红 蛋白为代表的内源性的自身荧光物质导致的非特异信号的产生。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2005-098876号公报

专利文献2:日本特开2008-292371号公报

专利文献3：日本专利第4023523号公报

专利文献4：国际公开2008-080417号公报

专利文献5:日本特开2007-20565号公报

专利文献6:日本特开2008-116440号公报

专利文献7:日本特开平4-337446号公报

专利文献8:日本特开2001-198079号公报

专利文献9:美国专利申请公开第2005／0171434号说明书

非专利文献

非专利文献1：金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、 第1431～1438页。

非专利文献2：Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy、 R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、第204～224页。

非专利文献3：加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6巻、第2号、 第271～277页。

发明内容

发明要解决的问题

上述FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理计算所 测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在试样溶液中的 微小区域内出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述的光分析技术 中得到有意义的结果，作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数 密度优选调制成在平衡状态下在秒数量级长度的一次检测时间内有能够统 计学处理的个数的荧光分子等出入微小区域内。上述浓度或数密度优选调制 成在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等。典型地，共焦体积的 体积为1fL左右，所以，荧光分子等的浓度优选为1nM左右或其以上。

换言之，试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度大幅地低于能够统 计学处理的程度时，例如，大幅地低于1nM时，产生测量时间内只有稀少的 观测对象物进入微小区域内的状态。该情况下，在荧光强度的测量结果中包 括：观测对象物在微小区域内完全不存在的状态长时间地存在，并且显著的 荧光强度的观测量变少。结果，通过如上述的基于荧光强度的统计学波动的 光分析技术难以获得有意义的或精度良好的分析结果。

专利文献5、6中所述的、使用共聚焦显微镜的光学系统的荧光性物质的 检测方法中公开有：不进行如上述的涉及荧光强度波动的统计学处理，根据 数秒的测量时间内有无显著强度的荧光信号的产生，能够判断试样中的观测 对象的荧光分子等的有无。结果，能够得到显著强度的荧光信号的频率与试 样中的荧光分子等的粒子数的相关性。特别是在专利文献6中，提出了产生 搅拌试样溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。

然而，即便是这些方法，也只停留在检测通过扩散或随机的流动概率地 进入微小区域内的荧光分子等的存在，从这一点出发，现有的方法没有变化。 所以，不能把握微小区域内的荧光分子等的粒子行为。另外，例如，也不能 进行粒子的计数、定量地计算粒子的浓度或数密度。

专利文献7中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或 固定在基板上的荧光微粒的存在的技术。该专利文献7中记载的技术不是用 于检测试样溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等粒子，即，不 是用于对于在试样溶液中随机运动的粒子进行检测的技术。因此，该专利文 献7记载的技术中，不能定量地计算在试样溶液中溶解或分散的粒子的浓度 或数密度。

另外,专利文献7的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上 的固定化处理的过程。因此，可以认为,检测所需要的试样量远大于FCS、 FIDA、PCH等的光分析技术的情况,并且对实施者要求复杂的高难度的操作 技术。

本发明目的在于提供不需要FCS、FIDA、PCH等光分析技术中进行的统 计学处理的、包含胰液的生物试样中的目标粒子的检测方法。即便在观测对 象粒子的浓度或数密度低于FCS、FIDA、PCH等光分析技术中处理水准的情 况下，该方法也能够通过新型的光分析技术检测观测对象粒子的状态或特 性。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题进行深入了研究，结果得到以下的见解。 对于在试样溶液中分散并随机运动的粒子，以由与前述粒子结合后的荧光探 针发出的光作为指标间接地进行检测的情况下，通过使用扫描分子计数法进 行结合有荧光探针的粒子的检测，即便试样溶液中的观测对象的粒子的浓度 非常低时，也能够灵敏度良好地检测结合有发光探针的粒子。在检测包含胰 液的生物试样中的目标粒子的情况下，通过将由与目标粒子结合后的荧光探 针检测的荧光的波长设为600nm以上，即便在试样溶液中包含来源于胰液的 自身荧光物质的情况下，也能够有效地抑制非特异信号的产生并且检测目标 粒子。本发明人等发现上述的见解而完成本发明。

此处，扫描分子计数法是在日本提出的特愿2010-044714号中提出的新 型的光分析技术。

以下，示出本发明的方式。

(1)一种目标粒子的检测方法，其特征在于，其为检测包含胰液的生物试 样中的目标粒子的方法，具有：(a)调制含有包含胰液的生物试样、和与目标 粒子结合的荧光探针的试样溶液，在前述试样溶液中，使前述生物试样中包 含的目标粒子与前述荧光探针结合的探针结合工序；和(b)计算前述工序(a) 中调制的试样溶液中存在的、结合有荧光探针的目标粒子的分子数的计算工 序；前述荧光探针发出的光的发生特性在与前述目标粒子结合的状态下以及 单独存在的状态下不同；并且，在与前述目标粒子结合的状态下发出的光的 波长为600nm以上；前述工序(b)中的结合有荧光探针的目标粒子的分子数的 计算通过如下工序进行：使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在 前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的移动工序；一边在 前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由前述光 检测区域中的与前述目标粒子结合状态的前述荧光探针发出的光信号，逐个 检测结合有荧光探针的目标粒子的检测工序；和对前述逐个检测到的结合有 荧光探针的目标粒子的个数进行计数而计数前述光检测区域的位置的移动 中检测到的前述目标粒子的分子数的计数工序。

(2)根据前述(1)所述的目标粒子的检测方法，在前述移动光检测区域的 位置的移动工序中，前述光检测区域的位置以规定的速度移动。

(3)根据前述(1)或(2)所述的目标粒子的检测方法，在前述移动光检测区 域的位置的移动工序中，前述光检测区域的位置以比前述结合有荧光探针的 目标粒子的扩散移动速度更快的速度移动。

(4)根据前述(1)～(3)的任一项所述的目标粒子的检测方法，在由前述检 测到的光检测来自每个结合有荧光探针的目标粒子的光信号而逐个检测前 述结合有荧光探针的目标粒子的检测工序中，根据检测到的按照时间顺序的 光信号的形状，检测到一个结合有荧光探针的目标粒子进入了前述光检测区 域。

(5)根据前述(1)～(4)的任一项所述的目标粒子的检测方法，由前述荧光 探针在与前述目标粒子结合的状态下发出的荧光的波长为630nm～1300nm。

(6)根据前述(1)～(5)的任一项所述的目标粒子的检测方法，前述荧光探 针具有相互接近时产生荧光共振能量转移现象的能量供体部位和能量受体 部位，并且，在与前述目标粒子结合的状态以及不与前述目标粒子结合的状 态之间，前述能量供体部位与前述能量受体部位之间的距离不同；在与前述 目标粒子结合的状态、和单独存在的状态下，由前述荧光探针发出的光的发 光特性不同。

(7)根据前述(1)～(6)的任一项所述的目标粒子的检测方法，前述目标粒 子为核酸，前述荧光探针为单链核酸分子，该单链核酸分子与前述目标粒子 特异地杂交并且结合有荧光共振能量转移现象中的成为能量供体的荧光物 质以及成为能量受体的物质的至少一者。

发明的效果

本发明的方式的目标粒子的检测方法(以下，称为本发明的目标粒子的 检测方法)中应用的扫描分子计数法不进行计算荧光强度的波动这样的统计 学处理。因此，通过本发明的目标粒子的检测方法，即便试样中仅极微量地 存在作为解析对象的目标粒子时，也能够检测试样中的前述目标粒子。进而， 本发明的目标粒子的检测方法中，在扫描分子计数法中通过将波长为600nm 以上的荧光作为光信号来检测与目标粒子结合后的荧光探针，能够排除作为 杂质包含的自身荧光物质导致的影响。并且，其结果，能够高精度地检测包 含胰液的生物试样中的目标粒子。

附图说明

图1A是用于扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。

图1B是共焦体积(共聚焦显微镜的观察区域)的示意图。

图1C是改变镜7的方向，在试样溶液内部移动光检测区域的位置的机构 的示意图。

图2A是说明基于用于扫描分子计数法的光分析技术的光检测原理的示 意图。

图2B是测量的光强度的时间变化的示意图。

图3A是观测对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的示意 图。

图3B是表示图3A所示状况下的光子计数(光强度)的时间变化的例子的 图。

图4A是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的 光检测区域的位置，从而观测对象粒子横穿光检测区域时的示意图。

图4B是表示图4A所示状况下的光子计数(光强度)的时间变化的例子的 图。

图5是以流程图的形式显示根据通过扫描分子计数法测量的光子计数 (光强度)的时间变化进行粒子的计数的处理次序的图。

图6A是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时 间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的 图。

图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时 间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的 图。

图7表示通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例(柱状图)、和 将数据平滑化后获得的曲线(虚线)、和峰存在区域中拟合的高斯函数(实线)。 图中，带有“噪音”的信号作为由噪音或杂质带来的信号被无视。

具体实施方式

首先，对扫描分子计数法进行说明。扫描分子计数法为如下技术：一边 通过微小区域扫描试样溶液内，一边当在试样溶液中分散并随机运动的发出 光的粒子(以下，称为“发光粒子”。)横穿微小区域内时，检测由微小区域中 的发光粒子发出的光。由此，能够一个一个逐个检测试样溶液中的发光粒子， 获得发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的相关信息。 扫描分子计数法与FIDA等光分析技术同样地，检测所需的试样可以是微量 (例如，数十μL左右)。另外，扫描分子计数法中的测定时间短。并且，与FIDA 等光分析技术的情况相比，对于更低浓度或数密度的发光粒子，扫描分子计 数法可以定量检测其浓度或数密度等特性。

“在试样溶液中分散并随机运动的粒子”是指在试样溶液中分散或溶解 的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的或不发光的任一者。)， 是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。

发光粒子是指通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光 的粒子。本实施方式的目标粒子的检测方法中，目标粒子与荧光探针结合而 成的物质为发光粒子。

本实施方式中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区 域”是指在共聚焦显微镜或多光子显微镜中检测光的微小区域。当由物镜照 射照明光时，相当于该照明光聚光的区域。在共聚焦显微镜中，该光检测区 域尤其根据物镜与小孔之间的位置关系确定。

扫描分子计数法中，边在试样溶液内移动光检测区域的位置即通过光检 测区域扫描试样溶液内，边逐次地进行光的检测。于是，当移动的光检测区 域包含了与随机运动的粒子结合或缔合后的发光探针时，检测到来自发光探 针的光。由此，检测到一个粒子的存在(根据实验的方式，也包含如下情况： 发光探针与希望检测的粒子(目标粒子)暂时结合后，在进行光的检测时与粒 子解离。)。接着，在逐次检测到的光中逐个检测来自发光探针的光信号。 由此，一个一个地逐个逐次地检测(与发光探针结合的)粒子的存在，能够得 到关于粒子在溶液内的状态的各种信息。具体而言，例如，在上述构成中， 可以计数逐个检测到的粒子，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的 粒子的个数(粒子的计数)。根据上述的构成，通过组合粒子的个数与光检测 区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中的粒子的数密度或浓度相关的 信息。特别是通过任意手法例如以规定速度移动光检测区域的位置等来确定 光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算粒子的数密度或浓 度。当然，并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，也可以计算相对于多个 试样溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准试样溶液的相对的数密 度或浓度之比。另外，扫描分子计数法中，采用改变光学系统的光路而移动 光检测区域的位置的构成。由此，光检测区域移动迅速并且在试样溶液中实 质上不产生机械振动、流体力学的作用。因此，扫描分子计数法中，作为检 测对象的粒子能够不受力学的作用的影响，在稳定的状态下进行光的测量 (试样溶液中，振动或流动起作用时，粒子的物理性质存在变化的可能性。)。 并且，扫描分子计数法中，由于不需要流通试样溶液，因此能够用与FCS、 FIDA等情况下同样微量(1μL～数十μL左右)的试样溶液进行测量和分析。

在上述的逐个检测粒子的工序中，由逐次检测到的光信号判定与一个粒 子结合的发光探针是否进入光检测区域时，可以根据按照时间顺序检测到的 光信号的形状而进行。实施方式中，典型地，当检测到具有比规定阈值大的 强度的光信号时，能够检测到与一个粒子结合的发光探针进入了光检测区 域。需要说明的是，本实施方式中，与一个粒子结合后的发光探针包括：一 个发光探针与一个粒子结合的情况；多个发光探针与一个粒子结合的情况； 以及根据实验方式的、与一个粒子结合之后从粒子解离的发光探针的情况。

此外，在上述移动光检测区域的位置的工序中，可以根据与粒子结合后 的发光探针的特性或试样溶液中的数密度或浓度，适当改变试样溶液内部的 光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解，由与粒子结合的 发光探针所检测到的光的形态，可能会根据其特性或试样溶液中的数密度或 浓度而改变。特别是，如果光检测区域的移动速度过快，则由与1个粒子结 合后的发光探针得到的光量减少，所以为了精度良好且灵敏度良好地检测到 由与1个粒子结合后的发光探针发出的光，优选适宜变更光检测区域的移动 速度。

进一步，在上述移动光检测区域的位置的工序中，适当的是将试样溶液 内的光检测区域的位置的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合 后的发光探针(即，本发明的目标粒子的检测方法中，与目标粒子结合的状 态的发光探针)的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)。如 上述说明，通过扫描分子计数法，当光检测区域通过存在有与一个粒子结合 后的发光探针的位置时，检测由该发光探针发出的光而逐个检测发光探针。 然而，当与粒子结合后的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光 检测区域中出入多次时，多次检测到来自一个发光探针的(表示希望检测的 粒子存在的)光信号，难以将检测到的光信号与一个希望检测的粒子的存在 对应起来。因此，如上述，将光检测区域的移动速度设定为高于与粒子结合 后的发光探针的扩散移动速度，由此，能够使与一个粒子结合后的发光探针 对应于一个(表示粒子的存在的)光信号。需要说明的是，扩散移动速度随着 与粒子结合后的发光探针而改变，所以如上述，优选根据与粒子结合后的发 光探针的特性(特别是扩散常数)，适当改变光检测区域的移动速度。本实施 方式中，具体而言，设定为以快于与目标粒子结合的状态的发光探针的扩散 移动速度的速度进行移动。

可以以任意方式，进行用于移动光检测区域的位置的光学系统的光路改 变。

例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中采用的检流计镜改变光路，使 光检测区域的位置发生变化。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设 定，可以选自例如圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。

扫描分子计数法中，其光检测机理自身与FIDA等光分析技术的情况相 同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的 构成，所以试样溶液的量同样地可以是微量的。然而，扫描分子计数法中， 不进行计算荧光强度的波动这样的统计学处理，所以扫描分子计数法的光分 析技术能够适用于粒子的数密度或浓度大幅地低于FIDA等光分析技术所需 要的水平的试样溶液。

另外，扫描分子计数法中，在溶液中分散或溶解的每个粒子被逐个检测 出。因此，使用该信息，可以定量地进行粒子的计数、试样溶液中的粒子的 浓度或数密度的计算、或者取得与浓度或数密度相关的信息。即，通过扫描 分子计数法，使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应，一个一 个地检测出粒子，所以能够进行溶液中分散并随机运动的粒子的计数。因此， 通过扫描分子计数法，与以前相比，能够精度良好地确定试样溶液中的粒子 的浓度或数密度。实际上，根据逐个检测与目标粒子结合的状态的荧光探针 等并计数其数目、确定粒子浓度的本实施方式的目标粒子的检测方法，即使 试样溶液中的与目标粒子结合后的荧光探针的浓度是比通过荧光分光光度 计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也能够检测目标粒 子。

进一步，利用改变光学系统的光路、通过光检测区域扫描试样溶液中的 方式，不对试样溶液产生机械振动或流体力学作用，使试样溶液内部在均匀 的状态或试样溶液机械上稳定的状态下进行观察。由此，与例如使试样产生 流动的情况(赋予流动的情况下难以恒常地赋予同样的流速，并且装置构成 变得复杂，还有需要的试样量大幅地增大，并且由于流动导致的流体力学的 作用，溶液中的粒子、发光探针或结合体或者其他的物质存在变质或变性的 可能性。)相比较，定量的检测结果的可靠性提高。另外，对于试样溶液中 的成为检测对象的粒子，能够在没有力学作用的影响下或没有人为影响的状 态下进行测量。

＜用于扫描分子计数法的光分析装置的构成＞

可以通过在基本的构成中如图1A中示意性的示例那样组合能够实施 FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器而构成的光分析装置实 施扫描分子计数法。参照图1A，光分析装置1是由光学系统2～17、和用于控 制光学系统的各部分的行为并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装 置1的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统同样，此处，自光源2 放射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的 NA(Numerical Aperture)规定的角度放射为发散的光，通过准直仪4成为平行 光，在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方， 典型地配置有分注了1μL～数十μL的试样溶液的试样容器或排列有孔10的微 孔板9。自物镜8射出的激光在试样容器或孔10内的试样溶液中聚集为焦点， 形成光强度强的区域(激发区域)。试样溶液中，分散或溶解有作为观测对象 物的粒子、与前述粒子结合的发光探针、带有发光标记（典型地为荧光色素 等）的分子。与发光探针结合或缔合后的粒子(根据实验的方式，与粒子暂 时结合后与粒子解离的发光探针)进入激发区域时，发光探针就在其间被激 发而发出光。发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜11处反射，在聚光镜 12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14(此处，只选择特定的波长范围的 光成分。)被导入至多模光纤15而到达光检测器16，转换成按照时间顺序的 电信号之后，输入至计算机18，按照后面说明的方式实施用于光分析的处理。 需要说明的是，如本领域技术人员所知，在上述的构成中，小孔13配置于与 物镜8的焦点位置共轭的位置上。由此，仅自图1B中示意地所示的激光的焦 点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被挡 住。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的实际体积的、 位于本光分析装置中的光检测区域(典型地，光强度呈现以区域的中心为顶 点的高斯型分布或洛伦兹型分布。实际体积是以光强度为1/e2的面为界面的 略椭球体的体积。)被称为共焦体积。另外，扫描分子计数法中，检测到来 自一个粒子与发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数 个荧光色素分子的微弱光，所以光检测器16优选使用能够用于光子计数的超 高灵敏度的光检测器。此外，为了改变欲进行观察的孔10，在显微镜的平台 (没有图示)上可以设有用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装 置17a。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过上述的构 成，即使被检体为多个，也能够实现快速的测量。

进而，在上述的光分析装置的光学系统中，改变光学系统的光路而通过 光检测区域扫描试样溶液内。即，在试样溶液内设置用于移动焦点区域(即， 光检测区域)的位置的机构。该用于移动光检测区域的位置的机构，例如如 图1C示意性示例的，也可以采用改变反射镜7的方向的镜转向器17。该镜转 向器17也可以与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同。另 外，为了实现预期的光检测区域的位置移动模式，镜转向器17是在计算机18 的控制下，与通过光检测器16的光检测协调而被驱动的。光检测区域的位置 的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合(可 以从计算机18的程序中的各种移动模式中选择。)。需要说明的是，图中没 有显示但也可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置沿上下方向移 动。如上所述，不移动试样溶液而通过改变光学系统的光路，从而使光检测 区域的位置移动，则试样溶液内实质上不发生机械的振动、流体力学的作用。 结果，能够排除对于观测对象物的力学作用的影响，能够实现稳定的测量。

当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述 光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光 检测区域)中发出光，所以可以去除小孔13。此外，当粒子与发光探针的结 合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以 省略用于产生激发光的光学系统2～5。当粒子与发光探针的结合体或发光探 针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。另外， 在光分析装置1中，如图1A所示，可以为如下构成：可以设置有多个激发光 源2，根据用于将粒子与发光探针的结合体或发光探针激发的光的波长，选 择适当的激发光的波长。同样地，可以具备多个光检测器16，当试样中包含 波长不同的多种粒子与发光探针的结合体或发光探针时，可以根据波长分别 检测来自它们的光。

＜扫描分子计数法的光分析技术的原理＞

FIDA等分光分析技术与以前的生物化学分析技术相比，其优点是必需 的试样量非常少，并且可以快速实施检查。然而，在FIDA等分光分析技术 中，原理上根据荧光强度波动计算观测对象粒子的浓度或特性。为了获得精 度良好的检测结果，要求试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度是如下 水平：在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的观测对 象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度(光子计数)。如果当观测对 象粒子的浓度或数密度低于上述时，例如，当观测对象粒子只是偶尔进入光 检测区域CV内的水平时，仅在一部分测量时间内出现显著的光强度(光子计 数)，因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在观测对象粒子的 浓度大幅地低于测量中通常在光检测区域内存在一个左右的观测对象粒子 的水平时，光强度波动的运算易受背景的影响，为了获得对运算而言为充分 量的显著的光强度数据，测量时间延长。与此相对，即使当观测对象粒子的 浓度低于FIDA等分光分析技术要求的水平时，用扫描分子计数法也能够检 测观测对象粒子的数密度或浓度等特性。

扫描分子计数法的光分析技术中，作为实行的处理，直接了当地说，驱 动用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)而改变光路，如图2A中示 意地描述，一边在试样溶液内移动光检测区域CV的位置即利用光检测区域 CV扫描试样溶液内，一边实施光检测。

如此一来，例如，如图2A所示，在光检测区域CV移动期间(图中，时间 t0～t2)，当通过存在有1个粒子(图中，发光探针结合有荧光色素)的区域时 (t1)，检测到如图2B所述的显著的光强度(Em)。如此，实行上述的光检测区 域CV的位置的移动和光检测，通过一个一个地检测在此期间出现的如图2B 所例示的显著的光强度。由此，通过逐个检测出与发光探针结合的粒子，计 数其个数，能够得到与存在于所测量的区域内的粒子的个数或者浓度或数密 度相关的信息。该扫描分子计数法的光分析技术的原理中，粒子一个一个地 被检测出且不进行如荧光强度波动的计算这类统计学运算处理。由此，可以 认为即便是欲观测粒子浓度低至无法用FIDA等以充分精度分析程度的试样 溶液中，也能够得到关于粒子的浓度或数密度的信息。

另外，通过扫描分子计数法这类逐个检测、计数试样溶液中的粒子的方 法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的 粒子的浓度时相比，能够以更低的浓度进行测定。当通过荧光分光光度计或 酶标仪来检测某被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标 记的粒子的浓度成比例。然而，该情况下，被荧光标记的粒子的浓度充分地 降低时，噪音信号的量相对于由被荧光标记的粒子发出的光的信号量变大 (S/N比恶化)，被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解。结 果，确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由被检测的光 信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，从检测结果中排除了噪音信号， 只将对应于各个粒子的信号进行计数而计算浓度。由此，与通过假设荧光强 度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更低 的浓度。

进而还有，当一个观测对象粒子结合有多个发光探针时，与传统的假定 荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而确定浓度的方法相比，通过扫 描分子计数法这类对试样溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，粒子浓度高 一侧的粒子浓度的测量精度提高。在一个观测对象粒子结合有多个发光探针 的情况下，向试样溶液添加某一量的发光探针时，观测对象粒子的浓度升高 时，相对而言与粒子结合的发光探针的个数降低。在此情况下，由于每一个 观测对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间 的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法 在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，每个粒子的荧光 强度降低的影响变少，由粒子数计算浓度，所以，与假设荧光强度与被荧光 标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更高的浓度。

＜通过扫描分子计数法的试样溶液的光强度的测定＞

就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动 镜转向器17，在试样溶液内移动光检测区域的位置(试样溶液内部的扫描)以 外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测工序相同的方式实施光强度检测。 在操作处理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入试样溶液而载置于显微镜 的平台上之后，使用者对计算机18输入测定开始的指示。接着，计算机18根 据存储装置(没有图示)存储的程序(将用于在试样溶液内移动光检测区域的 位置的光路进行改变的次序、和在光检测区域的位置的移动中检测来自光检 测区域的光的次序)，开始试样溶液内光检测区域中的激发光的照射以及光 强度的测量。该测量中，在根据计算机18程序的处理操作的控制下，镜偏向 器17驱动镜7(检电镜)，在孔10内进行光检测区域的位置的移动。与此同时， 光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18。计算机18以 任意方式由送达的光信号生成按照时间顺序的光强度数据并保存。需要说明 的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器。 由此，光的检测是以如下方式进行的光子计数：在规定时间内，间隔规定的 单位时间(BINTIME)如每10μ秒逐次地测量到达光检测器的光子的个数，按 照时间顺序的光强度的数据可以为按照时间顺序的光子计数数据。

光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意的，可以设定为 适合例如实验或分析目的的规定速度。当根据所检测到的观测对象粒子的个 数获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或 体积是必需的,所以以移动距离受掌握的方式进行光检测区域的位置移动。需 要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系 的方式，能够容易地解释测定结果。因此，移动速度基本上优选为恒定速度， 但并非仅限于此。

此外，为了由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测观测对象粒 子，或以良好的精度定量实施观测对象粒子数的计数，优选将光检测区域的 位置的移动速度设定为比观测对象粒子(更严密地，粒子与发光探针的结合 体或者与粒子结合后分解而游离的发光探针、本实施方式中，结合有荧光探 针的目标粒子)的随机运动即布朗运动导致的移动速度更快的值。扫描分子 计数法的光分析技术的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机 运动的粒子，由于布朗运动，位置随时间而移动。因此，光检测区域的位置 的移动速度比粒子的布朗运动导致的移动慢时，如图3A示意地描述，粒子在 区域内随机地移动。由此，光强度如图3B所示随机地变化(如已知，光检测 区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。)，难以确定对应于各 个观测对象粒子的显著的光强度的变化。

此处，将光检测区域的位置的移动速度优选设定为快于粒子的布朗运动 导致的平均的移动速度(扩散移动速度)从而如图4A所示使粒子略直线地横 穿光检测区域。因此，按照时间顺序的光强度数据中，如图4B例示，对应于 各个粒子的光强度变化的分布图大致一致，能够容易地确定各个观测对象粒 子与光强度的对应。粒子略直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的 曲线与激发光强度分布几乎相同。

具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的观测对象粒子(更严密的是， 粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解、游离的发光探针)通过 半径Wo的光检测区域(共焦体积)时所需的时间Δt根据均方位移的关系式示 出如下。

(2Wo)²＝6D·Δt   (1)

Δt＝(2Wo)²／6D   (2)

因此，观测对象粒子通过布朗运动移动的速度(扩散移动速度)Vdif大约 如下所示。

Vdif＝2Wo／Δt＝3D／Wo   (3)

此处，光检测区域的位置的移动速度可以参考前述Vdif而设定为比之更 快的值。例如，假定观测对象粒子的扩散系数为D＝2.0×10^-10m²/s左右的情 况下，Wo为0.62μm左右时，则Vdif为1.0×10^-3m/s。因此，光检测区域的位 置的移动速度设定为其大约10倍的15mm/s即可。此外，当观测对象粒子的扩 散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光 强度变化曲线成为预期曲线(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件， 可以重复进行预备实验，确定适当的光检测区域的位置的移动速度。

＜通过扫描分子计数法的光强度的分析＞

经上述处理获得试样溶液的按照时间顺序的光强度数据时，可以在计算 机18中，根据存储在存储装置中的程序进行处理(由检测到的光逐个检测来 自各个发光粒子的光信号的次序)，由此实施如下所述的光强度的分析。

(i)一个观测对象粒子的检测

在按照时间顺序的光强度数据中，当一个观测对象粒子通过光检测区域 时的轨迹是如图4A所示几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图 6A示意性地描述，具有反映(由光学系统确定的)光检测区域的光强度分布的 曲线(通常略呈钟形)。因此，观测对象粒子的检测的手法之一中，对于光强 度设定阈值Io，超过该阈值的光强度持续时间宽度Δτ在规定的范围时，判定 为该光强度的分布图与一个粒子通过光检测区域相对应，检测到一个观测对 象粒子。光强度的阈值Io以及时间宽度Δτ的规定的范围是根据观测对象粒子 与发光探针的结合体(或者与粒子结合后再分解而游离的发光探针)所发出的 光的强度而预想的曲线确定的；所述观测对象粒子相对于光检测区域以规定 的速度相对地移动。其具体的值可以根据实验任意地设定，也可以根据观测 对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后分解而游离的发光探针)的 特性而选择确定。

此外，作为观测对象粒子的检测的其他方法，光检测区域的光强度分布 假定为高斯分布：

I＝A·exp(-2t²／a²)   (4)

此时，对显著的光强度曲线(可以明确判断为非背景的曲线)，根据式(4) 拟合计算的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度曲线可判断为对应一 个观测对象粒子通过了光检测区域，可以视为检测到一个观测对象粒子。当 强度A和宽度a落在规定范围之外时，可以在分析中作为噪音或异物而无视。

(ii)观测对象粒子的计数

观测对象粒子的计数可以如下进行：通过任意方法计数通过上述观测对 象粒子的检测方法检测到的粒子的个数。然而，当粒子的个数较多时，也可 以通过例如图5和图6B所示例的处理来进行。

参照图5和图6B，根据按照时间顺序的光强度(光子计数)数据计数粒子 数的方法的一个例子为如上述说明的光强度的测定。即，利用光检测区域扫 描试样溶液内和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据(光子计数 数据)后(步骤100)。对该按照时间顺序的光信号数据(图6B最上部分“检测结 果(未处理)”)，进行SMOOTHING(平滑化)处理(步骤110，图6B中上部分 “SMOOTHING”)。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率 地发出的，所以在微小的时间内数据值可能产生欠缺。因此，通过该平滑化 处理，可以无视如前述的数据值的欠缺。平滑化处理可以例如通过移动平均 法而进行。需要说明的是，可以根据获得光信号数据时的光检测区域的位置 移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当设定实施平滑化处理时的参数，例如， 在移动平均法中一次取平均的数据点数或移动平均的次数等。

接着，为了检测在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中存在显 著信号的时间区域(峰存在区域)，对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号 数据对时间进行一阶微分值运算(步骤120)。按照时间顺序的光信号数据的时 间微分值如图6B中下段“时间微分”所例示，在信号值的变化时刻，值的变 化变大。因此，通过参照该时间微分值，能够有利地确定显著的信号(峰信 号)的起点和终点。

之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号(峰信号)， 判断检测到的峰信号是否是与观测对象粒子相对应的信号。

具体而言，首先，在按照时间顺序的光信号数据的按照时间顺序的时间 微分值数据基础上，逐次地参照时间微分值，搜索一个峰信号的始点和终点 进行确定，从而确定峰存在区域(步骤130)。一旦确定了一个峰存在区域，就 对该峰存在区域中的平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟 合(图6B下部分的“钟形函数拟合”)。由此，计算钟形函数的峰强度Imax、 峰宽度(半高全宽(full width half maximum))w、拟合中的(最小二乘法的)相关 系数等参数(步骤140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数， 也可以是洛伦兹型函数。由此，判断计算的钟形函数的参数是否落在一个粒 子与发光探针的结合体或发光探针通过光检测区域时检测到的光信号所描 述的钟形曲线参数的规定范围内，即，峰强度、峰宽度、相关系数是否分别 落在规定范围内等(步骤150)。这样，如图7左侧所示，计算的钟形函数的参 数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或者与发光探针对应的光 信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个观测对象粒子对应的信号。由 此，判断为检测到一个观测对象粒子，计数为一个粒子(粒子数的计数增加。 步骤160)。另一方面，如图7右侧所示，将计算的钟形函数的参数没有在预 定范围内的峰信号作为噪音而无视。

上述的步骤130～160的处理中的峰信号的搜索和判定可以在按照时间 顺序的光信号数据的整个领域内重复地进行，每检测到一个观测对象粒子则 作为粒子而计数。因此，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰 信号搜索后(步骤170)，将所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号 数据中检测到的观测对象粒子的个数。

(iii)观测对象粒子的数密度或浓度的确定

进行了观测对象粒子的计数后，使用在获得按照时间顺序的光信号数据 的过程中光检测区域所通过的区域的总体积，确定观测对象粒子的数密度或 浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的 开口数、光学系统的调整状态而改变，所以由设计值计算通常是困难的。因 此，计算光检测区域所通过的区域的总体积也不简单。在本文中，典型的是， 可以在与所要检查的试样溶液的测定相同的条件下，对已知粒子浓度的溶液 (参照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数，根据检测到的 粒子的个数和参照溶液的粒子的浓度，确定光检测区域所通过的区域的总体 积，即确定观测对象粒子的检测数和浓度之间的关系。

作为参照溶液的粒子，可以优选为与观测对象粒子所形成的粒子和发光 探针的结合体(或与观测对象粒子结合后再游离的发光探针)具有相同发光特 性的发光标记(荧光色素等)。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶 液，其粒子的检测数为N时，光检测区域所通过的区域总体积Vt则根据以下 的式子求出。

Vt＝N／C   (5)

另外，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将 计算的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt而采用即可。因 此，一旦获得Vt值，粒子的计数结果为n的试样溶液的粒子的数密度c就根据 以下的式子求出。

c＝n／Vt   (6)

需要说明的是，可以不通过上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA 等得到光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积。此外，本实施 方式的光分析装置也可以如下构成，对于规定的光检测区域的移动模式，将 各种标准粒子的浓度C和粒子的个数N之间的关系(式(5))的信息预先存储在 计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施光分析时可以适当利用存储的 关系信息。

＜目标粒子的检测方法＞

本实施方式的目标粒子的检测方法为检测包含胰液的生物试样中的目 标粒子的方法，通过扫描分子计数法检测结合有荧光探针而标记的目标粒 子。

扫描分子计数法为能够在分子离散的状况下逐个粒子地测定发光粒子 的测定方法，所以对于pM级以下的浓度比较低的发光粒子也能够进行测定。 因此，通过本实施方式的目标粒子的检测方法，即使当试样溶液中的解析对 象的目标粒子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数结合有荧光探针的目 标粒子。

进而，本实施方式的目标粒子的检测方法在利用扫描分子计数法的测定 中，由与目标粒子结合后的荧光探针检测的光信号的波长为600nm以上。试 样溶液中，生物试样中含有本来包含的自身荧光物质的情况多，特别是在包 含胰液的生物试样中，含有荧光波长小于600nm的自身荧光物质。本实施方 式中，通过在与目标粒子结合后的荧光探针发出的荧光中检测600nm以上的 光信号，能够抑制来源于包含胰液的生物试样的自身荧光物质导致的非特异 信号的产生，高精度地检测与目标粒子结合后的荧光探针。

具体而言，本实施方式的目标粒子的检测方法具有下述工序(a)～(b)。

(a)调制含有包含胰液的生物试样、和与目标粒子结合的荧光探针的试样 溶液，在前述试样溶液中，使前述生物试样中包含的目标粒子与前述荧光探 针结合的探针结合工序；和

(b)计算前述工序(a)中调制的试样溶液中存在的、结合有荧光探针的目标 粒子的分子数的计算工序。

以下，对于每个工序进行说明。

首先，作为工序(a)，调制含有包含胰液的生物试样、和与目标粒子结合 的荧光探针的试样溶液，在前述试样溶液中，使前述生物试样中包含的目标 粒子与前述荧光探针结合。

胰液是由胰管排出的体液。本发明和本说明书中，包含胰液的生物试样 是指包含含有来源于胰液的成分的体液的试样。含有来源于胰液的成分的体 液，可列举出例如，由胰脏直接引流而采集的胰液、在十二指肠采集的液体 (十二指肠液)等。十二指肠液中，不仅包含胰液，还包含同样地由乳头部排 出的胆汁、本来存在于十二指肠的液体、血液等。需要说明的是，胰液、十 二指肠液可以通过常规方法而采集。作为包含胰液成分的生物试样，可以为 只包含含有来源于胰液的成分的体液的物质，也可以为将前述体液用适当的 缓冲液等稀释的液体，还可以是在前述体液或其稀释液中添加各种添加剂而 成的物质。作为添加剂，可列举出：用于抑制来源于胰液的成分的分解等的 表面活性剂或分解酶抑制剂、pH调节剂、pH指示剂等。

目标粒子为在试样溶液中分散并随机运动的分子，是前述试样溶液中的 检测目标分子。作为目标粒子，可列举出例如：蛋白质、肽、核酸、核酸类 似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒 子状的生物学的对象物或非生物学的粒子(例如：原子、分子、胶束、金属 胶体等)等。核酸可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩 增的核酸。核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然型核苷酸(天然存在的 核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等 标记的物质等。更具体而言，可列举出例如：桥式核酸(BNA,Bridged nucleic  acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置换的核苷酸、天然型核糖核苷 酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA,Hexitol Nucleic  Acid)、肽核酸(PNA)等。

另外，本发明中使用的荧光探针为与目标粒子特异地或非特异地结合或 者吸附的物质，在与目标粒子结合的状态与单独存在的状态下发出的光的发 光特性不同，并且在与目标粒子结合的状态下，发出波长为600nm以上的荧 光。本发明中使用的荧光探针可以为在与目标粒子结合的状态下被600nm以 上波长的光激发而在单独存在的状态下不被600nm以上波长的光激发的物 质；也可以为在与目标粒子结合的状态和单独存在的状态两者的状态下，均 被600nm以上的波长的光激发的物质。作为本发明中使用的荧光探针，优选 为在与目标粒子结合的状态下发出波长为630～1300nm的荧光的探针，更优 选为发出630～820nm的荧光的探针。

在与目标粒子结合的状态以及单独存在的状态下，荧光探针的发光特性 不同是指：在与目标粒子结合的状态以及单独存在的状态下，特定的波长的 光强度不同。使荧光探针单独存在的状态以及与目标粒子结合的状态下特定 波长的光的强度不同(例如，使荧光强度不同)，由此能够在扫描分子计数法 中区别地检测出两者。

荧光探针可以通过例如，使与目标粒子特异地或非特异地结合或吸附的 物质(标记用探针)结合荧光物质而制造。作为荧光物质，可以从FCS、FIDA 等中使用的荧光色素、量子点等中适宜选择而使用。

例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，荧光探针可列举出： 使与目标粒子杂交的寡核苷酸结合荧光物质而成的物质、结合有荧光物质的 核酸结合性蛋白质、与核酸结合的荧光色素分子等。作为前述寡核苷酸,可以 为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质。可以为部分 或全部包含核酸类似物质的物质；所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基 同样地形成核苷酸链或碱基对。

另外，目标粒子为蛋白质的情况下，作为荧光探针，可以使用将目标粒 子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体用荧光物质标记了的物质。需要说 明的是，与核酸、蛋白质等目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质与荧 光物质的结合可以通过常规方法进行。

本实施方式中使用的荧光探针也可以为与目标粒子非特异地结合等的 物质，从目标粒子的检测、定量的精度的观点出发，优选与目标粒子特异地 结合等的物质。需要说明的是，作为与目标粒子特异地结合的荧光探针，只 要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒 子结合的物质即可，不需要与除了目标粒子以外的物质完全地不结合的物 质。例如，目标粒子为核酸的情况下，作为荧光探针使用的被荧光物质标记 的寡核苷酸既可以具有与前述目标粒子的碱基序列完全地互补的碱基序列， 也可以具有与前述目标粒子的碱基序列错配的碱基序列。

目标粒子为蛋白质的情况下，与蛋白质结合且改变周围环境时荧光强 度、荧光波长变化的色素(例如，疏水性探针ANS、MANS、TNS这类的荧光 色素)可以作为荧光探针使用。另外，荧光探针也可以其自身不发光。例如， 目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，使用与前述目标粒子杂交的寡核 苷酸作为荧光探针，即便在试样溶液中与前述荧光探针一起添加与双链结构 特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，也能够使荧光探针在单独存在的状 态以及在与目标粒子结合的状态下发光特性不同。作为与双链结构特异地结 合的荧光性双链核酸结合物质，可列举出荧光性嵌入剂或结合了荧光物质的 沟结合剂等。

其他的，可以使用例如：由至少两个构成要素形成的、通过与目标粒子 结合而使前述的至少两个构成要素的相互位置变化而发出荧光的物质作为 荧光探针。作为这样的物质的例子，可列举出：与某粒子结合时结构变化而 发出强的荧光的荧光性蛋白质、或者与某粒子结合时聚集而形成荧光性金属 络合物的分子(络合物的配体)。通过该构成，在所有情况下，单独的荧光探 针或不与目标粒子结合的荧光探针均几乎不发光，或者即便发光与目标粒子 和荧光探针的结合体的波长也不同，所以能够选择地检测由目标粒子和荧光 探针的结合体发出的光。

另外，通过利用荧光共振能量转移现象(FRET)，能够使试样溶液中单独 存在的荧光探针、和与目标粒子结合的状态的荧光探针的发光特性不同。例 如，作为荧光探针可以使用如下物质：使在FRET中成为能量供体的荧光物 质和成为能量受体的物质(荧光物质、猝灭物质)按照在荧光探针单独存在的 状态下产生FRET、在与目标粒子结合的状态下不产生FRET的方式在与目标 粒子结合的物质上结合而形成的物质。与目标粒子结合后的荧光探针不再产 生FRET，所以由成为能量供体的荧光物质发出荧光。另外，从单独存在的 荧光探针中，检测不到由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，或检测到的 荧光是减弱的。因此，通过检测由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，能 够与单独存在的荧光探针区别地检测到结合有荧光探针的目标粒子。

例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以优选使用分子信 标探针作为荧光探针；该分子信标探针如下形成：使FRET中成为能量供体 的荧光物质和成为能量受体的物质按照单链核酸分子的状态下产生FRET、 与其他单链核酸分子杂交形成缔合体的状态下不产生FRET的方式在当为单 链核酸分子的状态时形成分子内结构体的寡核苷酸上结合。本实施方式中优 选的是：3’末端侧结合有成为能量供体的荧光物质或成为能量受体的物质、 5’末端侧结合有剩余的另一者并且3’末端侧区域和5’末端侧具有彼此互补的 碱基序列，这些碱基序列形成碱基对由此形成分子内结构(所谓的茎-环结构) 的物质。需要说明的是，分子信标探针的形成分子内碱基对的彼此互补的区 域，可以夹着与目标粒子杂交的区域而存在；3’末端侧的区域和5’末端侧的 区域既可以为分别包含3’末端或5’末端的区域，也可以为不包含3’末端或5’ 末端的区域。此外，就形成碱基对的区域的碱基数或碱基序列而言，为所形 成的碱基对的稳定性低于与目标粒子的缔合体、且在检测条件下能够形成碱 基对的程度即可。

另外，使用与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，即便前 述荧光性双链核酸结合物质与标记了荧光探针的荧光物质之间产生FRET， 也能够区别单独存在的荧光探针和与目标粒子结合的荧光探针。即，荧光性 双链核酸结合物质和标记了荧光探针的荧光物质中的任一者成为前述FRET 的能量供体，另一者成为FRET的能量受体。由单独存在的荧光探针，检测 到由标记前述荧光探针的荧光物质发出的荧光。与此相对，与目标粒子结合 的荧光探针和荧光性双链核酸结合物质结合，所以由结合体能够检测到由 FRET发出的荧光，结果能够与单独存在的荧光探针区別而检测。

需要说明的是，当进入荧光探针与目标粒子的缔合体的碱基对之间的荧 光性嵌入剂的量过多时，检测自FRET发出的荧光时的背景变得过高，存在 影响检测精度的担心。因此，优选将荧光探针设计成在荧光探针与目标粒子 的缔合体中形成双链的区域为400bp以下。

其他的，本实施方式中，也可以使用两种荧光探针。例如，在目标粒子 为核酸或核酸类似物质的情况下，将两种荧光探针设计成相对于目标粒子相 互邻接而杂交，将一者的荧光探针用FRET中的成为能量供体的荧光物质标 记，将另一者的荧光探针用前述FRET中的成为能量受体的物质标记。该情 况下，单独存在的荧光探针不产生FRET，而通过与目标粒子结合，前述两 种荧光探针相互接近而产生FRET。因此，通过检测自该FRET发出的荧光， 能够检测出结合有荧光探针的目标粒子。

具体而言，工序(a)中，首先，调制包含胰液的生物试样、和与目标粒子 结合的荧光探针的试样溶液。该溶剂，只要是不阻碍由与目标粒子结合后的 荧光探针发出的光的检测、以及不阻碍利用扫描分子计数法检测与目标粒子 结合后的荧光探针的溶剂，就没有特别的限定；可以从本技术领域中通常使 用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液，有例如：PBS(磷酸缓冲生理 盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。

只是使目标粒子与荧光探针共存于相同的溶液中就能够使两者结合的 情况下，调制试样溶液之后，只需根据需要以规定时间孵育前述试样溶液， 就能使目标粒子与荧光探针在前述试样溶液中结合。

另一方面，目标粒子、荧光探针为双链结构的核酸或者核酸类似物质的 情况下，优选使试样溶液中的核酸等变性之后使两者缔合。需要说明的是， “使核酸或核酸类似物质变性”是指使碱基对解离。例如，使分子信标探针 中彼此互补的碱基序列所形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结 构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。当荧光探针是包含PNA等核酸类 似物质的寡核苷酸时，即使目标粒子是双链核酸分子，有时不进行特别的变 性处理也可以形成包含前述荧光探针和目标粒子的缔合体。

作为变性处理，可列举出：利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓 度处理的变性等。其中，热变性对于荧光物质的影响比较小且操作简便，所 以优选进行热变性。具体而言，热变性通过将前述试样溶液进行高温处理而 使前述试样溶液中的核酸等变性。通常地，DNA在90℃下、RNA在70℃下保 温数秒至2分钟左右，能够通过保温使之变性；但根据目标粒子的碱基的长 度等进行变性的温度千差万别，只要能够变性，就对其温度没有限定。另一 方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释，将前述试样 溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。

根据需要使之变性之后，使前述试样溶液中的目标粒子与荧光探针缔 合。

当进行热变性时，在高温处理后，使前述试样溶液的温度降至目标粒子 能够与荧光探针特异地杂交的温度，由此能够使前述试样溶液中的两者适当 缔合。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使前述 试样溶液的盐浓度升高至目标粒子能够与荧光探针特异地杂交的浓度，能够 使前述试样溶液中的两者适当缔合。

需要说明的是，可以根据两者的缔合体的熔解曲线，求出两条单链核酸 分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有两者的溶液的温度从高温向 低温变化，测定前述溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得 的熔解曲线，从变性的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度，至几乎全 部成为缔合体的温度这一范围内的温度，都可以作为两者能够特异地杂交的 温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样 地确定熔解曲线，能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。

通常可以用Tm值(熔解温度)，代替两条单链核酸分子能够特异地杂交的 温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据荧光探针的碱基序 列信息，能够计算与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单 链DNA的温度)。

此外，为了抑制非特异杂交，在形成缔合体时，优选使试样溶液的温度 较缓慢地下降。例如，使试样溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可 以按0.05℃/秒以上的降温速度，降低前述试样溶液的液温。

此外，为了抑制非特异地杂交，优选预先在试样溶液中添加表面活性剂、 甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加 2种以上。通过添加这些化合物，在较低温度环境下也能够使非特异的杂交 难以发生。

之后，作为工序(b)，通过扫描分子计数法计数调制的试样溶液中存在的、 结合有荧光探针的目标粒子的分子数。具体而言，将目标粒子与荧光探针结 合后的试样溶液设置于用于前述的扫描分子计数法的光分析装置，通过前述 的手法检测由与目标粒子结合状态的荧光探针发出的光并解析，由此计数结 合有荧光探针的目标粒子的分子数。计数的结合有荧光探针的目标粒子的分 子数为测定试样中所含的目标粒子的个数。

实施例

接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明的方式，但本发明的 方式不限于下列实施例。

[参考例1]

在检测波长下通过扫描分子计数法测定从3名被检者采集的十二指肠液 中存在的自身荧光物质。

使用的3个十二指肠液被检体中，1个为淡红色，1个为比较强的黄色， 剩下的1个为非常淡的黄色。由颜色的差异可知，这些十二指肠液被检体所 包含的自身荧光物质的种类和量极大地不同。

将10μL的各十二指肠液被检体用Tris缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM  EDTA，400mM NaCl，pH8.0)进行10倍稀释而成的液体作为试样溶液，将各 试样溶液使用488nm～670nm的激发光通过扫描分子计数法进行测定。另外， 对于Tris缓冲液，作为对照通过扫描分子计数法同样地进行测定。

具体而言，在检测中，使用具备共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计 数系统的1分子荧光测定装置MF20(Olympus Corporation)作为光分析装置， 对于上述的各试样溶液，获得按照时间顺序的光子计数数据。此时，激发光 使用488nm、543nm、633nm、或670nm的激光，以转动速度6，000rpm、300μW 进行照射。从雪崩光电二极管获得的信号的BIN TIME设为10μ秒，测定时间 为20秒。

用Savinzky-Golay算法将由测定获得的按照时间顺序的数据进行平滑化 以后，通过微分进行峰检测。从被视为峰的区域中，提取可以近似为高斯函 数的区域作为信号。

将测定结果示于表1。表1中,标记“缓冲液”的列中所示的值为测定Tris 缓冲液的结果。表1中，标记“pancrease”的列中所示的值为测定十二指肠 液被检体的10倍稀释液的结果。结果，Tris缓冲液和十二指肠液被检体稀释 液的任一者，与激发光波长为488nm和543nm的情况相比较，在激发光波长 为633nm和670nm的情况下的峰数均显著地减少。由该结果可知，十二指肠 液被检体中所包含的自身荧光物质的大部分为发出波长小于600nm的荧光的 物质。

[表1]

[实施例1]

将向参考例1中使用的3个十二指肠液被检体中添加单链核酸分子作为 目标粒子而成的物质，作为包含胰液的生物试样，实施本发明的目标粒子的 检测方法。

使用由序列号1中所示的碱基序列组成的单链核酸分子作为目标粒子。 以下，本实施例中，将前述核酸称为目标核酸分子。另外，作为与前述目标 核酸结合的发光探针，使用：在由序列号2所示的碱基序列组成的寡核苷酸 的5’末端附加有TAMRA(注册商标)、在3’末端附加有BHQ-2的分子信标探针 1，或者在由序列号2所表示的碱基序列形成的寡核苷酸的5’末端附加有 ATTO(注册商标)647N、在3’末端附加有BHQ-2的分子信标探针2。这些寡核 苷酸委托Sigma Science Corp.合成。将目标核酸分子和分子信标探针的碱基 序列示于表2。表2中，分子信标探针中的带有下划线的碱基为形成分子内结 构体时相互杂交的区域。

[表2]

如下调制试样溶液：向将10μL的各十二指肠液被检体用Tris缓冲液 (10mM Tris-HCl，1mM EDTA，400mM NaCl，pH8．0)稀释10倍的液体中 添加目标核酸以使最终浓度成为100pM、10pM、或0pM，进而添加分子信标 探针1或分子信标探针2以使最终浓度成为100pM。另外，作为对照，也调制 如下的试样溶液：向Tris缓冲液中添加目标核酸以使最终浓度成为100pM、 10pM、或0pM，进而添加分子信标探针1或分子信标探针2以使最终浓度成为 100pM。

将各试样溶液进行95℃下10分钟、80℃下10分钟、70℃下10分钟、60℃ 下10分钟、50℃下10分钟、40℃下10分钟、30℃下10分钟、20℃下10分钟的 退火处理，形成由目标核酸分子A和核酸探针A形成的缔合体。

通过扫描分子计数法计数降温处理后的各试样溶液中的缔合体的分子 数。具体而言，激发光使用633nm或670nm的激光，将测定时间设为5秒钟， 除此以外，与参考例1同样地进行测定。将测定结果示于表3。表3中，标记 为“缓冲液”的列中所示的值为测定不包含十二指肠液被检体的试样溶液的 结果。表3中，标记为“pancrease”的列中所示的值为测定包含十二指肠液 被检体的试样溶液的结果。结果，在激发波长543nm下检测的情况下，无论 是否包含等量的目标核酸，包含十二指肠液被检体(包含胰液的被检体)的试 样溶液，与不包含十二指肠液被检体的试样溶液(对照)相比较，产生大的信 号并且在目标核酸的浓度为100pM、10pM、以及0pM的任一试样溶液中，均 检测到几乎相同程度的个数的峰。另一方面，在激发波长633nm下检测的情 况下，在包含十二指肠液被检体(包含胰液的被检体)的试样溶液中，检测到 与不包含十二指肠液被检体的试样溶液(对照)几乎相同程度的个数的峰。由 这些结果可知，在激发波长543nm下检测的情况下，也许是受到了来源于十 二指肠液被检体的自身荧光物质的影响而大量产生非特异的峰；通过在激发 波长633nm下进行检测，能够抑制非特异的峰的产生，更正确地检测目标粒 子。

[表3]

产业上的可利用性

根据本发明的目标粒子的检测方法，能够通过扫描分子计数法高精度地 检测在混入有来源于生物试样的自荧光物质的试样溶液中仅以非常低浓度 存在的来源于胰液的目标粒子，所以本发明的目标粒子的检测方法能够利用 于尤其将来源于胰液的成分作为解析对象的解析/检查等领域中。

附图标记说明

1  光分析装置(共聚焦显微镜)

2  光源

3  单模光纤

4  准直仪透镜

5  分色镜

6、7、11  反射镜

8  物镜

9  微孔板

10  孔(试样溶液容器)

12  聚光镜

13  小孔

14  二次滤片

15  多模光纤

16  光检测器

17  镜转向器

17a  平台位置变化装置

18  计算机