猪肉质性状相关GLP2R基因片段的分子克隆及应用

摘要

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种猪肉质性状相关GLP2R基因片段的分子克隆及应用，是以人的GLP2R基因序列为种子序列，在GenBank中利用BLASTN，参照其同源性在80％以上的猪EST设计特异引物，利用RACE克隆出猪GLP2R基因cDNA全长，该猪GLP2R基因片段的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。GLP2R基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的GLP2R基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型，发现第244bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BstEⅡ多态性，为猪标记辅助选择提供了新的分子标记，可利用该标记检测中外猪种的情况。

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种包含如SEQ ID NO：1 所示猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQ ID NO：1所示的GLP2R基 因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核 苷酸多态性位点的方法。

背景技术

猪肉是动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉需要量的增加，对肉质的要 求也相应提高。影响猪肉质的因素有遗传和非遗传的，猪肌内脂肪含量对肉质 性状有很大的影响，一般来说，肌内脂肪含量越高，猪肉质越嫩，从而肉质越 好。肉质性状大多属于数量性状，由微效多基因控制。许多肉质性状只能在动 物屠宰后才能测定，所以常规选育只能进行同胞或半同胞测定，这样必加大选 育成本，且遗传进展缓慢。猪基因组草图的构建，使得寻找影响肉质性状的主 基因或与其紧连锁的分子标记成为可能，这些分子标记一经确认，就可进行标 记辅助选择育种。利用分子标记进行辅助选择(MAS)进行肉质性状改良是一种 有效的途径。

胰高血糖素样肽2(Glucagon-like peptide-2，GLP2)是近年来发现的一 种肠上皮特异生长因子，有助于肠道生长发育，能促进修复肠道粘膜的病理损 伤，提高肠屏障功能，抑制肠细胞凋亡，加快肠腔营养物质的转运，增强肠道 对营养物质的吸收。此外，有报道指出，血清中GLP-2含量与2型糖尿相关。

胰高血糖素样肽2受体(Glucagon-like peptide-2recepter，GLP2R)属 于G蛋白偶联受体家族，与胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1， GLP1)、胰高血糖素(Glucagon，GCG)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(Glucose -dependent insulinotropic polypeptide，GIP)的受体高度同源。GLP2R作为 GLP2的特异性受体，GLP2与其结合调节肠粘膜细胞增殖、分化和修复等。此外， Luo等(2012)以大白猪和东北民猪构建F₂代资源家系，F₂代有455头猪，所用 基因芯片为PorcineSNP60K，测定了背最长肌的肌内脂肪含量、大理石纹、肉色 等，全基因组关联分析(Genome-Wide>

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种猪肉 质性状相关的GLP2R基因片段的分子克隆及应用，通过克隆猪GLP2R基因cDNA 分子，寻找GLP2R基因的突变位点，并检测GLP2R基因的多态性，为猪肉质性 状标记辅助选择提供有用的分子标记。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种与猪肉质性状 相关的GLP2R基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，该SEQ ID NO：1 序列的243bp处有1个G/A的碱基突变，导致PCR-RFLP-BstEⅡ多态性。

本发明以人的GLP2R基因序列(GenBank收录号为NM_004246.1)为种子序 列，在GenBank中利用BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide)，参照其同源性在80％以上的猪EST(Expression Sequence Tags) 设计特异引物，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End)，克隆出猪GLP2R 基因cDNA全长，该猪GLP2R基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，见图3。GLP2R 基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的GLP2R基因序列设计引物，正 向引物为5′-CGGGAACTCCTGTTGTGC-3′，反向引物为5′- TGAAGCGGTGAGAATGGTA-3′；再以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序 筛选SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型技术，发现第244bp处有一个A/G的 碱基突变，导致PCR-RFLP-BstEⅡ多态性，经分析A/G位点存在3种基因型，AA 基因型(746bp)、AG型(746bp、506bp、240bp)和GG型(506bp、240bp)。

可利用上述制备的猪分子标记检测外来猪种和中国地方品种，为标记辅助 选择(MAS)奠定坚实的基础，提高了养猪生产经济效益，为指导猪的育种实践 提供理论依据。

附图说明

图1是本发明的GLP2R基因片段的PCR扩增产物的电泳结果图。

图中：M：100bp DNA Ladder Marker，1-6表示第1至第6泳道，分别代 表大白猪第1至6号样品。

图2是本发明的GLP2R基因A/G位点的BstEⅡ酶切电泳结果。

图中：泳道1-3：GG基因型；泳道4、5、8、10：AA基因型；泳道6、7、9： AG基因型；M:100bp DNA Ladder Marker。

图3是本发明猪GLP2R基因的DNA序列，其中显示了突变位置。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做 任何限定。

GLP2R基因的克隆：

以人的GLP2R基因序列(GenBank收录号为NM_004246.1)为种子序列，在 GenBank中利用BLASTN，参照其同源性在80％以上的猪EST(Expressed Sequence Tags)设计特异引物，利用RACE技术克隆出猪GLP2R基因cDNA全长。

试验材料：25日龄沙子岭猪由湖南省湘潭市沙子岭猪资源场提供，取背最 长肌-80℃保存，3′-RACE SMARTer^TMRACE>

总RNA提取与cDNA第1链的合成：用SUPERSCRIPT II RT酶和特异性引物 3'445-1对总RNA进行基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的cDNA 进行去RNA处理，最后对cDNA进行纯化。

引物设计：据GenBank人的GLP2R基因(登录号：NM_004246.1)序列保守 区设计引物，引物设计的软件为Primer Premier5.0，引物设计的原则是特异 性引物长度在23-28个核苷酸，GC含量在50％-70％，退火温度在65-70℃，使用 巢式PCR进行扩增。

编码序列PCR扩增：以合成的猪cDNA为模板，在保守区设计引物经过克隆 测序，获得该基因部分CDS(coding domain sequence)序列。

3′-RACE扩增：用3′445-1引物和UPM(Universal Primer A Mix)(见表1)， 及上述合成的cDNA为模板进行PCR第一轮扩增；将PCR第一轮扩增产物稀释50 倍后，进行巢式PCR第二轮扩增，将扩增产物进行电泳并对目的条带切胶回收 纯化；最后将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体进行连接，转化后挑取阳性克 隆测序。

表1引物序列

将中间片段和3′-RACE序列拼接后，得到长为1868bp的cDNA序列，从而 完成本发明的GLP2R基因的克隆。

GLP2R基因分子标记的筛选：

GLP2R基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的GLP2R基因序列设计 引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，发现第244 bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BstEⅡ多态性。

试验材料：以外来猪种大白猪为试验对象，取小块猪耳组织提取DNA。

利用比较基因组学方法根据人的GLP2R基因的第5外显子和第6外显子之 间的内含子，以该基因在GenBank作BLAST，序列比对后筛选出GLP2R基因候选 SNPs位点，选取GLP2R基因候选SNPs位点，参考GenBank序列NC_010454.3序 列设计引物，运用PCR-RFLP技术验证该位点。

设计的检测上述SEQ ID NO：1序列基因片段突变的引物是：正向引物为 5′-CGGGAACTCCTGTTGTGC-3′(见SEQ ID NO：6)，反向引物为 5′-TGAAGCGGTGAGAATGGTA-3′(见SEQ ID NO：7)。

PCR反应条件：PCR反应体系(总体积20μL)，包括10×Buffer2μL、2mmol/L dNTPs1.6μL、20mmol/L MgCl21.6μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL、 DNA模板(100ng/μL)1μL、上下游引物(10pmol/μL)各0.4μL、及dd H2O 12.6μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸 40s，共35个循环；72℃后延伸8min，最后4℃保存。

取10μL PCR扩增产物，加2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于1％的琼 脂糖凝胶(含0.05％溴化乙碇)上，然后点6μL100bp DNA Markers作为参照， 5V/cm电泳0.5-1.0h。电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照，结 果如图1所示。将纯化后的PCR产物送铂尚生物技术公司测序。

PCR产物的BstEⅡ酶切：在10μL PCR产物中加入0.8μL10×限制性内 切酶缓冲液、0.2μL限制性内切酶和1μL双蒸水，总体积为12L，37℃消化 4-10h。用2％琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并 拍照，酶切结果如图2，扩增产物进行测序，序列如SEQ ID NO：1所示，扩增 片断为第5外显子和第6外显子之间的片断，共746bp，为PCR-RFLP-BstEⅡ 分子标记。

通过设计扩增包含该SNP引物，经分析A/G位点的突变采用BstEⅡ进行酶 切检测多态性。在扩增的746bp的片段上，存在1个BstEⅡ的酶切位点，电 泳检测结果显示在GLP2R基因的A/G位点存在3种基因型，GG型(506bp、240 bp)、AG型(746bp、506bp、240bp)和AA基因型(746bp)。

PCR-RFLP技术检测GLP2R基因的BstEⅡ多态性：

以猪GLP2R基因为研究对象，以4个地方猪种(大围子猪、沙子岭猪、宁 乡猪、桃源黑猪)及外来猪种(大白猪)作为实验对象，取小块猪耳组织提取DNA， 其中，大白猪293头，桃源黑猪74头、沙子岭猪25头、宁乡猪62头和大 围子猪45头。对GLP2R基因A/G位点的基因频率、基因型频率进行检测，并 分析其遗传结构。

PCR-RFLP-BstEⅡ多态性在各品种中的分布情况如表2所示，由表2可知， 在宁乡猪、大围子猪和桃源黑猪这3个地方品种中，G基因为优势等位基因，桃 源黑猪的该基因频率高达0.987，宁乡猪和大围子猪的频率达1；而在外来品种 (大白猪)中，A基因频率为优势等位基因，该基因频率为0.6433。从基因型 分布频率看，GG型在分布占优势，AA型个体较少，只在沙子岭猪中发现1个， 在桃源黑猪中检出15个，但大白猪中GG型较少(41个)而AA型和AG型分别 有125个和127个。

表2不同品种GLP2R基因A/G位点的基因频率和基因型频率分布