用于鉴定黄胸蓟马的微卫星标记及引物

摘要

本发明提供了一组用于鉴定黄胸蓟马的微卫星分子标记。该标记为THaw1、THaw2、THaw5、THaw9、THaw10和THaw11。本发明还提供一种用于鉴定黄胸蓟马的试剂盒，由6对引物对组成，该引物对为THaw1-F/R、THaw2-F/R、THaw5-F/R、THaw9-F/R、THaw10-F/R和THaw11-F/R。本发明的6个黄胸蓟马微卫星分子标记能够快速鉴定黄胸蓟马。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及用于鉴定黄胸蓟马 的微卫星标记及引物。

背景技术

黄胸蓟马Thrips hawaiiensis(Morgan)，又名香蕉花蓟马，属缨翅目(Thysanoptera) 蓟马科(Thripidae)，是危害香蕉、芒果、花卉及部分蔬菜的重要害虫，在热带和亚热 带地区普遍发生，对热带地区经济支撑作物香蕉和芒果已造成不可估计的损失。在香 蕉上，黄胸蓟马主要危害花蕾和幼果，通常在花蕾苞叶未张开时已侵入花蕾吸食幼果 汁液，并在幼果上产卵，引起果皮组织增生、木栓化，到果实后期呈突起黑斑；在芒 果上，黄胸蓟马以若虫、成虫锉吸为害芒果花、叶、芽、幼果，严重影响香蕉和芒果 果实外观品质。近年来我国大力发展热带特色经济作物产业，香蕉、芒果、花卉及冬 种蔬菜种植面积的进一步扩大，以及扩大对外开放后国际间或地区间果蔬贸易和人员 往来日愈频繁，这些因素为黄胸蓟马的传播、扩散、生存与繁衍提供了十分有利的条 件。准确掌握黄胸蓟马的遗传变异水平有利于了解其进化过程，阐明其种群扩张与暴 发机制，对预防与控制黄胸蓟马的入侵具有重要理论与实践意义。

微卫星DNA(Microsatellites DNA)是核心序列为1-6个的寡核苷酸经多次重复形 成的串联重复DNA序列，由核心序列和侧翼序列组成，核心序列呈串联状重复排列， 侧翼序列位于核心序列两侧，是保守的特异单拷贝序列，具有物种特异性。微卫星 DNA重复次数及重复程度的差异是造成每个基因座位多态性的原因，微卫星技术的关 键是位点筛选和引物设计，根据微卫星DNA两端的保守序列设计特异性引物，才能 扩增这个位点的微卫星DNA序列。微卫星标记具有分布广泛、多态性丰富、遗传共 显性、容易检测以及重复性好等优点，是构建高密度分子遗传图谱、分析物种分类与 演化、遗传多样性、种群遗传结构以及基因定位等方面的有效工具，被认为是当前种 内遗传变异研究中分辨率最高、揭示能力最强的分子标记。

发明内容

本发明的一个目的是提供一组用于鉴定黄胸蓟马的微卫星分子标记。

微卫星分子标记为THaw1、THaw2、THaw5、THaw9、THaw10和THaw11；

THaw1为如下(1)或(2)所示的DNA分子，其特征在于：微卫星重复序列为： (CAG)₇AAG(CAG)₁₀；

(1)SEQ ID No.1所示DNA分子；

(2)SEQ ID No.1第146位至第365位所示DNA分子；

THaw2为如下(3)或(4)所示的DNA分子，其特征在于：微卫星重复序列为： (CTT)₁₅(CA)₁₄；

(3)SEQ ID No.2所示DNA分子；

(4)SEQ ID No.2第1位至第437位所示DNA分子；

THaw5为如下(5)或(6)所示的DNA分子，其特征在于：微卫星重复序列为： (CA)₂₇；

(5)SEQ ID No.3所示DNA分子；

(6)SEQ ID No.3第147位至第288位所示DNA分子；

THaw9为如下(7)或(8)所示的DNA分子，其特征在于：微卫星重复序列为： (CA)₁₄；

(7)SEQ ID No.4所示DNA分子；

(8)SEQ ID No.4第143位至第261位所示DNA分子；

THaw10为如下(9)或(10)所示的DNA分子，其特征在于：微卫星重复序列为： (GT)₅(GT)₁₂；

(9)SEQ ID No.5所示DNA分子；

(10)SEQ ID No.5第260位至第398位所示DNA分子；

THaw11为如下(11)或(12)所示的DNA分子，其特征在于：微卫星重复序列 为：(TG)₁₃；

(11)SEQ ID No.6所示DNA分子；

(12)SEQ ID No.6第118位至第289位所示DNA分子。

本发明的另一目的是提供一种用于鉴定黄胸蓟马的试剂盒，由如下引物对组成：

(1)THaw1F：序列为SEQ ID No.7；

THaw1R：序列为SEQ ID No.8；

(2)THaw2F：序列为SEQ ID No.9；

THaw2R：序列为SEQ ID No.10；

(3)THaw5F：序列为SEQ ID No.11；

THaw5R：序列为SEQ ID No.12；

(4)THaw9F：序列为SEQ ID No.13；

THaw9R：序列为SEQ ID No.14；

(5)THaw10F：序列为SEQ ID No.15；

THaw10R：序列为SEQ ID No.16；

(6)THaw11F：序列为SEQ ID No.17；

THaw11R：序列为SEQ ID No.18。

上述微卫星分子标记或试剂盒辅助鉴定黄胸蓟马的应用也属于本发明的保护范 围。

本发明的再一目的是提供上述微卫星分子标记或试剂盒辅助鉴定黄胸蓟马的方 法。

为了实现这一目的采用如下方案：

一种辅助鉴定黄胸蓟马的方法，包括如下步骤：检测待测蓟马科动物的基因组中 是否含有上述的微卫星分子标记，若含有上述微卫星分子标记中的至少一种，则判定 所述待测蓟马科动物候选为黄胸蓟马，若不含有权利上述微卫星分子标记中的任一种， 则判定所述待测蓟马科动物候选为非黄胸蓟马。

一种辅助鉴定黄胸蓟马的方法，包括如下步骤：用上述试剂盒中的引物对分别扩 增待测蓟马科动物，若上述试剂盒的6对引物中至少一对扩增得到PCR产物，则判定 所述待测蓟马科动物候选为黄胸蓟马，若所述试剂盒的6对引物均没有扩增得到PCR 产物，则判定所述待测蓟马科动物候选为非黄胸蓟马。

其中上述待测蓟马科动物选自杜鹃蓟马(Thrips andrewsi)、黄胸蓟马(Thrips  hawaiiensis)、花蓟马(Frankliniella intonsa)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)、 腹小头蓟马(Microcephalothrips abdominalis)和Thrips parvispinus。

本发明具有以下优点：

本发明提供了6个黄胸蓟马微卫星分子标记及扩增6个微卫星标记的引物序列和 扩增方法，建立了微卫星快速分子鉴定黄胸蓟马的技术体系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施案例1、微卫星分子标记的开发

按照以下方法开发黄胸蓟马微卫星分子标记：

1.基因组DNA的提取、酶切和回收

采用常规的酚-氯抽提法，提取10头黄胸蓟马群体基因组DNA，取约800μg基因组 DNA，用限制性内切酶Sau3AI进行消化，采用琼脂糖凝胶片断回收试剂盒回收 300bp-1000bp的片段，将回收片段与由A:5′-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3′；和 B5′-PO4-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3′形成的接头连接。

2.利用接头连接片段构建基因组PCR文库

用连有接头的DNA片段作为模板，寡核苷酸链A作为引物，进行PCR扩增，创建 基因组PCR文库。反应总体积为20μl，其中：2μl模板DNA，2μl10×buffer，2μlMgCl2， 0.5μl dNTP，20μM寡核苷酸链A，1UTaqDNA聚合酶；反应程序为94℃预变性3min； 94℃40S，55℃40S，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。反应完毕后，琼脂 糖凝胶电泳检测扩增产物，回收纯化片段大小在300bp～1000bp之间的带谱。

3.磁珠富集黄胸蓟马微卫星片段

将上述2中回收的DNA片段和生物素标记的(CA)₁₅探针进行杂交，45μl杂交体系 中包括10μl回收的DNA片段，1.5μl探针(10μmol/L)，15μl20×SSC，0.5μl10％SDS， 18μl ddH2O，上述体系混合均匀，95℃处理10min后，68℃杂交1h。期间将100μl磁珠 清洗后重悬浮于200μl杂交液中(6×SSC，0.1％SDS)，杂交结束后，将杂交反应液同 磁珠混合，37℃温浴1小时。然后在室温条件下用200μl洗液(6×SSC，0.1％SDS)漂 洗2次，每次5min；再用200ul TE在室温快速洗2次，加入50ul TE，95℃变性10min， 释放出含有微卫星序列的单链DNA，迅速用磁力架吸出备用。

PCR反应体系25ul：2μl磁珠富集DNA片段，20μM寡核苷酸链A，0.5μl dNTP(2.5mM)，1UTaqDNA聚合酶，2.5μl10×buffer；PCR反应程序为：94℃预变性2min； 之后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30_s，60℃退火30S，72℃延伸1min，末 次循环72℃延伸10min，4℃保存。琼脂搪凝胶检测PCR产物，产物集中在300-1000bp， 并用试剂盒对PCR产物300-1000bp的带谱进行回收。

4.DNA片段阳性克隆的筛选与测序

将上述3中回收的DNA片段进行常规的克隆，运用PCR法筛选阳性克隆，取单克隆 菌液2ul进行PCR检测，25ul体系，引物为T载体克隆位点两端的M13引物对和探针的寡 核昔酸链(没有加生物素标记)，其它反应体系如3.中所述。反应程序为：95℃预变性 2min；之后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30S，72℃延伸1min。 末次循环72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物检测中如有2条或2条以上的条带，即表 示该阳性克隆内含有微卫星的插入片段。将含有微卫星位点的阳性克隆委托生物技术 公司进行双向测序。

5.引物设计及检测

运用软件SSRHunter1.3从获得的序列中寻找SSR位点，将获得的含有微卫星重复 序列进行整理和编辑，选取重复数较为理想的微卫星序列，根据重复序列两侧的保守 侧翼序列，用引物设计软件Primer Premier5.0，设计微卫星位点引物。

设计好的引物委托生物工程技术服务有限公司合成，初步PCR反应体系和条件为： 反应体系为：2.5mM MgCl2，25μM dNTP，0.2U Taq酶，载体M13通用引物2μM， 微卫星位点正反引物各2μM，50-100ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积20μl。扩增 程序为：95℃预变性5分钟；94℃30秒，56℃45秒，72℃45秒，35个循环，最后72 ℃延伸12分钟。

通过上述PCR法开发出来的微卫星标记引物扩增80个黄胸蓟马样本DNA，经电泳 检测、3730xl基因分析仪扫描分型，确定11对引物能在黄胸蓟马样本中扩增出条带清 晰、多态性高的微卫星条带。根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型， 运用POPGENE1.31和CERVUS3.0分析观测杂合度(H_O)、期望杂合度(H_E)、哈温平 衡(HWE)、连锁平衡和多态信息含量(PIC)等遗传参数。

最终获得11个微卫星分子标记分别，为THaw1、THaw2、THaw3、THaw4、THaw5、 THaw6、THaw7、THaw8、THaw9、THaw10、THaw11。且其中6个微卫星分子(THaw1、 THaw2、THaw5、THaw9、THaw10、THaw11)标记对黄胸蓟马具有特异性。

实施案例2、微卫星分子标记的应用

一、微卫星分子标记的序列

THaw1：序列为SEQ ID No.1；

THaw2：序列为SEQ ID No.2；

THaw5：序列为SEQ ID No.3；

THaw9：序列为SEQ ID No.4；

THaw10：序列为SEQ ID No.5；

THaw11：序列为SEQ ID No.6。

二、扩增微卫星分子标记的引物

(1)THaw1F：5'CATTCCGCTGGACACTACGACT3'(SEQ ID No.7)

THaw1R：5'GCGGCCACGATAAAATACCTAA3'(SEQ ID No.8)

(2)THaw2F：5'GAAACAAACTGCTTCTCTCACCT3'(SEQ ID No.9)

THaw2R：5'AAAATCTGAACAGGCTGACCCT3'(SEQ ID No.10)

(3)THaw5F：5'CGTCATGGGCTCACGCAGT3'(SEQ ID No.11)

THaw5R：5'AGCCGCCGCCTGACGTG3'(SEQ ID No.12)

(4)THaw9F：5'TCAATGATGCGTCTCAACCAAC3'(SEQ ID No.13)

THaw9R：5'CCAATGTCCACAAAGATTGCAT3'(SEQ ID No.14)

(5)THaw10F：5'GACAATAAGCCGACTGCATCTG3'(SEQ ID No.15)

THaw10R：5'CGCCTGTAGTACGTGGAAACTG3'(SEQ ID No.16)

(6)THaw11F：5'ATGGAGTATAGGCGCGACGTAT3'(SEQ ID No.17)

THaw11R：5'GAAAGGTCACTTGCTGGGCTT3'(SEQ ID No.18)

三、利用微卫星分子标记鉴定黄胸蓟马

杜鹃蓟马(Thrips andrewsi)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、花蓟马(Frankliniella  intonsa)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)和腹小头蓟马(Microcephalothrips  abdominalis)：公众可以从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得，提及以上 品种的文献为：张桂玲.中国蓟马科分类研究：[硕士学位论文].陕西：西北农林科技 大学，2003。

Thrips parvispinus：公众可以从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得， 提及该品种的文献为：Mound,L.A.&Collins D.W.,(2000)A south east Asian pest species  newly recorded from Europe:Thrips parvispinus(Thysanoptera:Thripidae),its confused  identity and potential quarantine significance.Journal of European Entomology,97, 197–200.。

1、实验样本

30头蓟马样本均采集自我国海南省不同寄主植物，包括了6种蓟马：Thrips  parvispinus、杜鹃蓟马(Thrips andrewsi)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、花蓟马 (Frankliniella intonsa)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)和腹小头蓟马 (Microcephalothrips abdominalis)。30头蓟马样本的具体信息见表1。

表1本实施例中使用的30头蓟马样本

蓟马种类 虫态 样本量 寄主 采集年月 黄胸蓟马 成虫 1 黄角兰 2011.09 黄胸蓟马 成虫 1 茶花 2011.09 黄胸蓟马 成虫 2 香蕉花 2011.08 黄胸蓟马 幼虫 1 香蕉花 2011.09 Thrips parvispinus 成虫 1 木瓜花 2011.09 Thrips parvispinus 幼虫 1 木瓜花 2011.09 Thrips parvispinus 成虫 2 木瓜花 2012.02 Thrips parvispinus 幼虫 1 木瓜花 2012.02 杜鹃蓟马 成虫 2 黄角兰 2011.09 杜鹃蓟马 幼虫 1 茶花 2011.09 杜鹃蓟马 成虫 1 柑橘花 2011.06 杜鹃蓟马 幼虫 1 黄角兰 2011.09 花蓟马 成虫 1 丝瓜花 2012.01 花蓟马 幼虫 1 南瓜花 2012.01 花蓟马 成虫 2 茄子花 2012.01 花蓟马 幼虫 1 青椒花 2012.01 普通大蓟马 成虫 1 野葛 2011.08

普通大蓟马 幼虫 1 野葛 2011.08 普通大蓟马 成虫 2 豇豆花 2012.01 普通大蓟马 幼虫 1 豇豆花 2012.01 腹小头蓟马 成虫 3 金盏银盘花 2012.02 腹小头蓟马 幼虫 2 金盏银盘花 2012.02

2、基因组DNA的提取

采用常规的酚-氯抽提法，分别提取30头蓟马基因组DNA。

3、PCR扩增及检测

利用上述获得的黄胸蓟马微卫星引物分别对6种蓟马进行PCR扩增，得到PCR扩增 产物。

PCR反应体系为：2.5mM MgCl2，25μM dNTP，0.2U Taq酶，微卫星位点正反 引物各2μM，50-100ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积20μl。扩增程序为：95℃预 变性5分钟；94℃30秒，58℃45秒，72℃45秒，35个循环，最后72℃延伸12分钟。

4、结果和分析

结果如表2所示。

表2黄胸蓟马11对微卫星引物对6种蓟马的鉴定结果

注：“-”，表示在该种蓟马的5头样品中均不产生目标条带；“+“，表示在该种蓟马的5头样品中均产 生目标条带；“±”，表示在该种蓟马的5头样品中个别样品产生目标条带。

结果表明，THaw1、THaw2、THaw5、THaw9、THaw10、THaw11的引物对在黄 胸蓟马中均能得到扩增产物，但是在其余5种蓟马中均得不到扩增产物，这表明这几对 引物能将黄胸蓟马与其它5种蓟马区分开来，是黄胸蓟马的特异微卫星引物。

另外的5对引物(THaw3-F/R、THaw4-F/R、THaw6-F/R、THaw7-F/R、THaw8-F/R) 在两种及两种以上的蓟马中扩增得到PCR产物，为黄胸蓟马非特异性微卫星引物。