法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-06-08
授权
授权
2014-10-08
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/704 申请日:20140616
实质审查的生效
2014-09-03
公开
公开
技术领域
本发明涉及瓦草五环三萜皂苷类化合物的新用途，具体涉及该类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于医药领域。
背景技术
恶性肿瘤一直是医学界亟待攻克重大疾病，目前抗肿瘤药物的药物毒性及不良反应也越来越受到重视。寻求毒副作用小、抗肿瘤作用强的药物是将一直肿瘤研究热点和重点。植物源性药物目前仍然是理想的抗肿瘤药物筛选的一大宝库，如紫杉醇、喜树碱、人参皂苷等一批具有较强抗肿瘤活性的天然化合物被筛选出来，有着良好的应用前景。我国是植物源性药物的使用大国，有着悠久的应用历史，在与疾病作斗争的过程中，逐步形成了独特的中医药理论体系。在中医药理论的指导下，众多植物药被应用，在治疗包括肿瘤等的疑难杂症过程中发挥了重要作用。此外，我国自然草药资源丰富，民族、民间草药用药广泛，为抗肿瘤药物的筛选提供线索，上述有利条件为从民族民间用药中筛选出毒副作用小、抗肿瘤作用强的药物奠定了很好的基础。本研究团队在抗肿瘤药物筛选过程中，首次发现了苗族药物瓦草中所含的五环三萜皂苷类化合物具有很强的抗肿瘤活性，特别对离体培养的人源肿瘤细胞和实体瘤(裸鼠)均具有强抑制和杀灭作用。
瓦草为石竹科(Caryophyllaceae)蝇子草属植物滇白前(Silene viscidula Franch.)的干燥根。具有镇痛、止血、清热、利尿之功，主要用于治疗跌打损伤、风湿骨痛、支气管炎、尿路感染等症。目前瓦草的研究主要集中化学成分研究方面，药理方面的研究报道较少。瓦草的主要的化学成分有皂苷类、蛋白质类、有机酸类、多糖类、环肽类、蜕皮甾酮类等，申请者从瓦草中分离、纯化并确定了多个五环三萜皂苷类化合物，为抗肿瘤活性成分筛选和评价奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供式Ⅰ化合物或其盐或包含式I化合物或其盐的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗肿瘤的药物组合物及其在制备治疗肿瘤药物中的用途。
本发明的另一个目的在于提供瓦草提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
式Ⅰ化合物或其盐或包含式I化合物或其盐的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，
式Ⅰ，
其中，R1为H、Ac、Glc(glucose，葡萄糖基)中的一种；
R2为(E)-MC、(Z)-MC、Ac中的一种；
R3为H、Xyl(Xylose，木糖基)中的一种；
R4为H、CH3、CH2CH2CH2CH3中的一种；
所述Ac的结构式如下：
所述(E)-MC的结构式如下：
所述(Z)-MC的结构式如下：
进一步，所述的盐是指式Ⅰ化合物与碱或碱土金属所形成的盐；更进一步，所述碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、氯化铵或氨水；所述碱土金属包括钠、钾、钙、铝、铜、锌或镁。
进一步，所述化合物结构式为：
化合物1
进一步，所述化合物结构式为：
化合物2
进一步，所述化合物结构式为：
化合物3
进一步，所述化合物结构式为：
化合物4
进一步，所述化合物结构式为：
化合物5
进一步，所述化合物结构式为：
化合物6
进一步，所述化合物结构式为：
化合物7
进一步，所述化合物结构式为：
化合物8。
本发明进一步提供上述式Ⅰ及化合物1-8在制备治疗肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌或黑色素瘤药物中的应用。
进一步，所述式Ⅰ及化合物1-8的用量范围为0.1～10mg/kg动物体重，可以根据常识，换算人用剂量。
进一步，所述式Ⅰ及化合物1-8可与其他辅料制成临床上使用的注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、食品或饮料；
更进一步，所述注射剂包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径。
本发明还提供一种治疗肿瘤的药物组合物，该组合物中的活性成分由式Ⅰ化合物或其盐及常规抗癌药中的任意一种组成。
所述常规抗癌药为环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、奥沙利铂、顺铂或健择等临床常用一线、二线抗肿瘤药物。
本发明还提供瓦草提取物在制备治疗肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌或黑色素瘤药物中的应用；所述瓦草提取物为瓦草经甲醇、乙醇或其他常规可以提取包含式Ⅰ化合物的有机溶剂提取得到的提取物。
进一步，所述瓦草提取物还可以是瓦草经有机溶剂提取后进一步经过精制、纯化工艺制备得到的有效部位瓦草总皂苷，所述精制、纯化工艺包括萃取、过硅胶柱、大孔树脂柱、凝胶柱、反相柱等常规柱色谱分离工艺。
进一步，所述瓦草提取物中瓦草总皂苷含量不低于50％；更进一步，所述瓦草提取物中瓦草总皂苷含量不低于60％。
进一步，所述瓦草提取物按如下方法制备：瓦草用50-95％的乙醇溶液提取，提取液浓缩后过大孔树脂柱，以70％-90乙醇洗脱，即得。
本发明进一步提供一种组合物在制备治疗肿瘤中的应用，该组合物由式Ⅰ化合物及其他抗癌药或辅助抗癌药组成。
本发明所述式Ⅰ结构的化合物主要从植物瓦草中提取，但是从其他植物中提取、化学合成、半合成或生物转化的方式获得的具有该结构的化合物及其类似物也在本发明的保护范围之内。
本发明研究表明，瓦草五环三萜皂苷类化合物对人肝癌细胞株、人胃癌细胞、人结肠癌细胞、人乳腺癌细胞及黑色素瘤细胞株的增殖均具有较强的抑制作用，其中对肝癌细胞最敏感，在相同给药浓度下，对肝癌细胞的抑制效果优于阳性对照药顺铂和环磷酰胺；且本发明研究表明，瓦草五环三萜皂苷类化合物能有效改善肿瘤对裸鼠生长状态、体重的影响，相对于西药化疗药物副作用小。
实验例1 不同瓦草皂苷化合物对体外培养的肿瘤细胞的抑制作用
1实验方法
1.1肿瘤细胞株及其培养
人肝癌细胞株(HepG2)、人胃癌细胞(BGC823)、人结肠癌细胞(HT29)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、黑色素瘤细胞株(A875)均由中国医学科学院肿瘤医院提供。在含10％(V/V)胎牛血清(FBS)与1％(V/V)双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的RPMI-1640培养基，于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验研究。
1.2实验设计
HepG2、BGC823、MCF-7、HT29、A875细胞株于37℃、5％CO2培养箱中培养，2～3天换液、传代一次。收集生长状态良好的细胞，调细胞浓度为2×104个/mL，96孔板每孔加入细胞悬液100μL(每孔2000个细胞左右)，CO2培养箱中培养24h，空白组加入100μL不含细胞的培养基。
分别将瓦草皂苷化合物1、2、3、4、7、8(按实施例2方法制备)用DMSO溶解，1640完全培养基稀释，使各化合物浓度为400μg/mL的溶液，DMSO的浓度为0.5％；将阳性药顺铂也配置成浓度为400μg/mL溶液。实验分为空白组、模型对照组、化合物1、2、3、4、7、8组和阳性药顺铂组，每组6个复孔。
给药前，弃去细胞培养板上清液，加新鲜的完全1640培养基180μL/孔，药物加样如下：瓦草皂苷化合物组加入瓦草皂苷各化合物，每孔20μL(终浓度为40μg/mL)；阳性对照组加入顺铂溶液20μL(终浓度40μg/mL)；空白组、模型对照组每孔加入含DMSO浓度为0.5％的培养基200μL。加药后，CO2培养箱中培养48h。，培养结束后，每孔加入MTT溶液20μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，震荡10min，490nm波长测定各孔光吸收值，并计算抑制率。
1.3抑制率计算
抑制率＝[(模型组OD-空白组OD)-(实验组OD-空白组OD)]/(模型组OD-空白组OD)×100％。
上述MTT试验共重复3个批次实验。
2数据统计
采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差()表示，组间比较采用方差分析。
3结果
MTT试验结果显示，不同瓦草皂苷化合物1、2、3、4、7、8分别在40μg/mL的给药浓度下，均对肿瘤细胞HepG2、MCF-7、BGC823、HT29、A875表现出较好的抑制作用。形态学观察发现，与正常肿瘤细胞相比，给药组出现明显细胞缩小、破碎、不贴壁现象。其中瓦草皂苷化合物1、化合物2对人肝癌HepG2、人胃癌BGC823、人结肠癌HT29细胞的抑制率均超过90％，其中对肝癌细胞最敏感，抑制率达99％；化合物3、4对5种肿瘤细胞也具有较强的抑制作用；而化合物7、8对肿瘤细胞抑制作用较弱。结果如表1所示。
表1 不同瓦草皂苷化合物对体外培养的不同肿瘤细胞的抑制率分析(n＝3， )
注：上述数据是三次重复实验统计结果，n＝3表示三次MTT实验重复
本实验结果表明，瓦草皂苷化合物1、2对肿瘤细胞增殖均具有强抑制作用，其中化合物2抑制作用最强，药效最好；在5种受试肿瘤细胞株中，对肝癌细胞最敏感，在相同给药浓度下，对肝癌细胞的抑制效果优于阳性对照药顺铂，本试验为后续整体动物实验提供实验依据和参考。
实验例2 不同干预时间瓦草皂苷化合物2对人肝癌细胞HepG2的抑制率及IC50的影响
1实验方法
1.1人肝癌细胞HepG2的培养
HepG2由中国医学科学院肿瘤医院提供。在含10％(V/V)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验研究。
1.2实验设计
收集生长状态良好的HepG2细胞，调细胞浓度为2×104个/mL，96孔板每孔加入细胞悬液100μL(每孔2000个细胞左右)，CO2培养箱中培养24h，空白组加入100μL不含细胞的培养基。
瓦草皂苷化合物2(按实施例2方法制备)用DMSO溶解，1640完全培养基稀释不同浓度梯度的化合物2溶液，DMSO的浓度为0.5％；实验分为空白组、模型对照组、化合物2不同浓度(终浓度为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL)组和阳性药顺铂组，每组6个复孔，分别做3个平行板，用于不同时间的培养。
给药前，弃去细胞培养板上清液，加新鲜的完全1640培养基180μL/孔，药物加样如下：瓦草皂苷化合物2组加入不同浓度梯度的化合物2溶液，每孔20μL，使其终浓度分别为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL和5μg/mL；阳性对照组加入顺铂溶液20μL(终浓度40μg/mL)；空白组、模型对照组每孔加入含DMSO浓度为0.5％的培养基200μL。加药后，CO2培养箱中分别培养24h、48h。
培养结束后，每孔加入MTT溶液20μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，震荡10min，490nm波长测定各孔光吸收值，并计算抑制率及IC50。
抑制率＝[(模型组OD-空白组OD)-(实验组OD-空白组OD)]/(模型组OD-空白组OD)×100％。
IC50采用Bliss法计算。
本实验重复3次。
2数据统计
采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差()表示，组间比较采用方差分析。
3结果
表2数据显示，瓦草皂苷化合物2在浓度20～80μg/mL之间对人肝癌细胞HepG2有明显的抑制作用，抑制率最高达99％以上，形态上发现，给药细胞和正常肿瘤细胞相比，出现明显细胞缩小、破碎、不贴壁现象。在药物浓度10μg/mL时，对人肝癌细胞HepG2处理后24h、48h其肿瘤细胞抑制率均超过80％。
经计算，瓦草皂苷化合物2对人肝癌细胞HepG2在24h、48h的IC50分别为5.25nmol/mL、4.56nmol/mL呈现一定的时间相关性。
表2 不同时间瓦草皂苷化合物2对人肝癌细胞HepG2的抑制率及IC50测定(n＝6，)
注：上述数据是三次重复实验统计结果，n＝3表示三次MTT实验重复，数值表示抑制率(×100％)
实验例3 瓦草皂苷对人肝癌细胞凋亡的诱导作用及其作用机制研究
1实验方法
1.1人肝癌细胞HepG2培养
HepG2由中国医学科学院肿瘤医院提供。在含10％(V/V)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验研究。
1.2实验设计
1.2.1细胞凋亡实验
对数生长期细胞培养于培养瓶中，贴壁生长24h后，将细胞分为3组，分别为模型对照组、瓦草皂苷化合物2组(终浓度为80μg/mL)和阳性对照药顺铂组(终浓度为40μg/mL)，每组3瓶，药物作用24h后，收集并调整待测细胞浓度为5×105-1×106个/mL，取1mL细胞，1000rpm4℃离心10min，弃上清，加入1mL冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm离心10min，弃上清，重悬细胞于200μl Binding Buffer中，加10μlAnnexin V-FITC和5μlPI，轻轻混匀，避光室温反应15min，加入300μl Binding Buffer，流式细胞仪立即检测。
1.2.2细胞周期检测
对数生长期细胞培养于培养瓶中，细胞分为4组，分别为模型对照组和瓦草皂苷化合物2不同浓度(终浓度20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL)组，每组3瓶，药物作用24h后，将待测细胞制成单细胞悬液，PBS洗2次，胰酶消化；加培养基终止消化，打匀，1000rpm，5min离心，弃上液，4℃PBS(1-2mL)洗细胞2次，1000rpm，5min离心，弃上液，加入-20℃70％酒精(1-2mL)打匀，固定30min以上；1000rpm，5min离心，弃酒精，4℃PBS(1-2mL)洗，1000rpm，5min离心，弃上液；4℃PBS(1-2mL)洗，打匀细胞，100目纱布过滤至流式检测管中，1000rpm，5min离心，弃上液，加PI染液染色(浓度为50μg/mL)，振荡器振匀，避光染色至少30min，流式细胞仪检测。
2数据统计
采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差()表示，组间比较采用方差分析。
3结果
3.1细胞凋亡早期信号检测结果
检测结果显示，与对照组比较，瓦草皂苷作用后，早期凋亡信号细胞数量明显上升，从1.5％上升至8.5％，差异有显著性(p<0.01)；坏死细胞数量较对照组也明显增加，从2.0％上升至6.6％。说明药物对肿瘤细胞的作用存在不同的途径，一方面可以促进细胞凋亡，另一方面存在其他的途径导致细胞坏死。
3.2细胞周期检测结果
空白对照组和药物组的细胞绝大多数处于G0/G1期。瓦草皂苷化合物2(40μg/mL)作用48h，G0/G期细胞百分比由对照组的(56.39±0.69)％降低到(55.08±5.75)％；瓦草皂苷化合物2(80μg/mL)作用48h后，G0/G期细胞百分比由对照组的(56.39±0.69)％降低到(47.28±13.07)％，并有超过50％的细胞进入S期和G2/M期。其中随着瓦草皂苷化合物2的浓度升高，作用时间的延长，处于G0/G1期的细胞逐渐减少，特别是处于S期期细胞则逐渐增多，例如瓦草皂苷化合物2(80μg/mL)作用后24h、48h、72h， S期细胞百分比由同时期对照组的(16.63±1.32)％、(23.68±1.6)％、(26.09±0.26)％分别增加到(20.39±2.56)％、(30.95±5.84)％、(40.34±12.32)％。说明瓦草皂苷化合物2主要将肿瘤细胞阻滞在S期，抑制细胞进入G0/G1期从而抑制肿瘤细胞的增殖，并表现出明显的量效关系，结果见表3。
表3 瓦草皂苷化合物2对HepG2细胞周期的影响
实验例4瓦草五环三萜皂苷类化合物抗人HepG2肝癌药效学研究
以抗癌作用最强的化合物1、化合物2为代表，考察瓦草五环三萜皂苷类化合物抗肝癌作用。
1实验方法
1.1动物与饲养管理
清洁级裸鼠，70只，雄性，体重18-20g，由中国食品药品检定研究所提供，合格证号：SCXK(京)2009-0017。适应性喂养1周后进行药效学实验。
实验动物饲养条件如下：
表4 实验动物饲养条件
动物饲养于有垫料的IVC塑料饲养盒中，清洁级裸鼠专用维持饲料(北京科澳协力饲料有限公司)喂养，自由饮水。
1.2HepG2肝癌细胞的培养
HepG2细胞采用常规培养，在含10％(V/V)胎牛血清(FBS)与1％ (V/V)双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的RPMI-1640培养基，于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长期细胞为实验对象。
1.3实验设计
70只裸鼠适应性喂养1周后，将体外培养生长良好的HepG2细胞悬液接种至裸鼠背部皮下，1×107个细胞/只。接种结束后，按体重随机分为7组，分别为模型对照组、瓦草总皂苷组(按实施例1方法制备)、化合物1组、化合物2组、化合物1+环磷酰胺(CY)组、化合物2+CY组和阳性药CY组，每组10只。接种3天后开始给药，连续3周。
每周测定一次体重和肿瘤大小，并计算肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积：V＝π/6×a×b2(a、b为肿瘤的横轴、纵轴长度)
末次给药结束后，裸鼠禁食8小时，测定空腹体重，摘眼球取血，离心，分离血清备用，分离肿瘤组织，称重，并计算肿瘤指数及抑瘤率，计算公式如下：
肿瘤指数＝肿瘤重量(mg)/动物体重(g)
抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％
1.3.1分组情况如下：
表5 动物给药与剂量
1.3.2给药方法
瓦草总皂苷、化合物1、化合物2、CY分别溶于无菌注射用水中，过滤除菌；化合物1+CY、化合物2+CY分别以1∶39的比例制备混合液，过滤除菌。各给药组分别皮下注射(10ml/kg BW)相应药物，模型对照组只皮下注射 等体积(10ml/kg BW)的注射用水。每天上午9点给药，共计3周。
1.3.3实验方案
体重的测定：每周测定一次裸鼠体重。
肿瘤的测定：每周测定一次裸鼠肿瘤大小，包括横径和纵径。
实验终止：给药3周(21天)后结束该实验研究。
2数据统计：采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差()表示，组间比较采用方差分析。
3结果
3.1不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HepG2荷瘤裸鼠体重的影响
给药前，各组动物体重较为均衡，组间无统计学差异。接种肿瘤后，模型组、化合物1、2组体重每周均有增加，其中化合物2组增加较快，模型组增加较慢；阳性药组动物体重从给药开始不但未增加，反而呈下降趋势(与模型组比较，均有p<0.01)。
该结果表明瓦草总皂苷、瓦草五环三萜皂苷化合物1、2能有效改善肿瘤对裸鼠生长状态—体重的影响，避免了化疗药物如CY等在抗癌过程中导致体重急剧下降的副作用；化合物1、2与CY合用可明显减弱CY对动物体重的影响，从数据来看，各联合用药组小鼠体重均表现为缓慢增加，表明化合物1、2可明显减轻CY的毒副作用。如表6所示。
表6 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HepG2荷瘤裸鼠体重的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
3.2瓦草五环三萜皂苷类化合物对HepG2荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
实验期间，各组动物肿瘤随着时间的延长，肿瘤体积均有所增长，其中， 模型组肿瘤体积增长迅速，受试药及CY组肿瘤体积增长较慢。
给药不同时间，各药物干预组动物肿瘤均较模型组肿瘤明显减小(均有p<0.01)，各药单独使用时，化合物2组肿瘤最小，其次是化合物1，两组肿瘤体积均明显小于阳性药CY组，说明瓦草类皂苷化合物1、2在抑制肿瘤增殖方面优于阳性对照药CY。瓦草总皂苷的抑瘤作用亦较明显，但较CY作用稍弱。
化合物1、2与CY联用，肿瘤生长受到更加明显的抑制，与各单独给药组比较，联合用药组肿瘤体积有明显减小，表明化合物1、2与CY合用，有较好的协同增效作用。如表7所示。
表7 瓦草五环三萜皂苷类化合物对HepG2荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
3.3不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HepG2荷瘤裸鼠瘤重、肿瘤指数及抑瘤率的影响
瓦草总皂苷、化合物1、2组动物肿瘤重量、肿瘤指数较模型组明显减小(与模型组比较，均有p<0.01)，单独用药时，化合物2抑制肿瘤生长作用最明显，化合物1、2组瘤重、肿瘤指数均较阳性药CY组低；瓦草总皂苷对以上指标的改善作用亦较明显，但作用较CY弱。从肿瘤抑制率来看，化合物1、2皮下注射给药的肿瘤抑制率分别为80.05％和87.42％，较阳性药CY抑制率(70.46％)高，表现为较好的抗肿瘤作用，且其抗肿瘤作用强度优于CY。
化合物1、2分别与CY联用时，肿瘤重量较各药物单独使用明显减轻、肿瘤指数明显减小，肿瘤抑制率均有所增加，表明化合物1、2与CY联合 用于抗肿瘤治疗，有较好的协同增效作用。如表8所示。
表8 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HepG2荷瘤裸鼠瘤重、肿瘤指数的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
4结论
瓦草总皂苷、化合物1和化合物2可明显增加人肝癌HepG2荷瘤裸鼠动物体重、减小肿瘤体积、降低瘤重及肿瘤指数，其中化合物1、化合物2具有高于阳性药CY的肿瘤抑制率，表明瓦草五环三萜皂苷类化合物具有较强的抗肿瘤活性；同时化合物1和化合物2可明显增加荷瘤裸鼠体重(与模型组、CY组比较，p<0.01或p<0.01)，证明其毒副作用较CY低，是一种高效、低毒的抗肿瘤活性成分。当化合物1、2分别与CY联用时，小鼠体重有所增加，肿瘤抑制率有所提高，表明化合物1、2与阳性药CY合用有较好的减毒、增效作用。
实验例5 瓦草五环三萜皂苷类化合物抗人BGC823胃腺癌药效学研究
1实验方法
1.1动物与饲养管理
清洁级裸鼠，70只，雄性，体重19-22g，由中国食品药品检定研究所提供，合格证号：SCXK(京)2009-0017。适应性喂养1周后进行药效学实验。
实验动物饲养条件同实验例4。
1.2BGC823胃癌细胞的培养
BGC823细胞体外培养方法同实验例4。
1.3实验设计
70只裸鼠适应性喂养1周后，将体外培养生长良好的BGC823细胞悬液接种至裸鼠背部皮下，1.2×107个细胞/只。接种结束后，按体重随机分为7组，分别为模型对照组、瓦草总皂苷组(按实施例1方法制备)、化合物1组、化合物2组、化合物1+5-FU、化合物2+5-FU组和阳性药5-氟尿嘧啶(5-FU)组，每组10只。接种3天后开始给药，连续3周。
每周测定一次体重和肿瘤大小，并计算肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积：V＝π/6×a×b2(a、b为肿瘤的横轴、纵轴长度)
末次给药结束后，裸鼠禁食8小时，测定空腹体重，摘眼球取血，离心，分离血清备用，分离肿瘤组织，称重，并计算肿瘤指数及抑瘤率，计算公式如下：
肿瘤指数＝肿瘤重量(mg)/动物体重(g)
抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％
1.3.1分组情况如下：
表9 动物给药与剂量
1.3.2给药方法
瓦草总皂苷、化合物1、化合物2、5-FU分别溶于无菌注射用水中，过滤除菌；化合物1+5-FU、化合物2+5-FU分别以1∶19的比例制备混合液，过滤除菌。各给药组分别皮下注射(10ml/kg BW)相应药物，模型对照组只皮下注射等体积(10ml/kg BW)的注射用水。每天上午9点给药，共计3周。
1.3.3实验方案
体重的测定：每周测定一次裸鼠体重。
肿瘤的测定：每周测定一次裸鼠肿瘤大小，包括横径和纵径。
实验终止：给药3周(21天)后结束该实验研究。
数据统计：采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。
2结果
2.1不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对BGC823荷瘤裸鼠体重的影响
给药前，各组动物体重较为均衡，组间无统计学差异。接种肿瘤后，模型组动物体重增长缓慢，接种第3周体重下降明显；瓦草总皂苷、化合物1、2组动物体重每周均有增加，三者之间体重增长无明显差异；阳性药组动物体重从给药开始不但未增加，反而明显下降(与模型组比较，均有p<0.01)；化合物1、2与5-FU合用可明显减弱5-FU对动物体重的影响，从数据来看，各联合用药组小鼠体重每周均有所增加，表明化合物1、2可明显减轻5-FU的毒副作用。如表10所示。
表10 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对BGC823荷瘤裸鼠体重的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
2.2瓦草五环三萜皂苷类化合物对BGC823荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
给药1周时，各药物干预组动物肿瘤明显小于模型组肿瘤(均有p<0.01)；给药2周、3周时，化合物1、2组肿瘤较模型组肿瘤减小更为明显(均有p<0.01)，且较阳性药5-FU组肿瘤体积明显缩小；瓦草总皂苷亦有较明显的抗BGC823肿瘤作用，但作用较5-FU偏弱。
化合物1、2与5-FU联用，肿瘤生长受到更加明显的抑制，与各单独给药组比较，联合用药组肿瘤体积有明显减小，表现为较好的协同增效作用。如表11所示。
表11 瓦草五环三萜皂苷类化合物对BGC823荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
2.3不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对BGC823荷瘤裸鼠瘤重、肿瘤指数及抑瘤率的影响
瓦草总皂苷、化合物1、2组动物肿瘤重量、肿瘤指数明显小于模型组(与模型组比较，均有p<0.01)，其中，化合物2抑制肿瘤生长作用较化合物1、瓦草总皂苷强，化合物1、2皮下注射给药的肿瘤抑制率分别为64.54％和79.63％，较阳性药5-FU抑制肿瘤生长作用强，三种药物均表现出为较好的抗胃癌活性。
化合物1、2分别与5-FU联用时，肿瘤重量较上述三种药物单独使用组明显减轻、肿瘤指数明显减小，肿瘤抑制率有所增加，表明化合物1、2与5-FU联合用于抗肿瘤治疗，有较好的协同增效作用。如表12所示。
表12 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对BGC823荷瘤裸鼠瘤重、肿瘤指数的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
3结论
瓦草总皂苷、化合物1、化合物2可明显增加人胃癌BGC823荷瘤裸鼠动物体重、减小肿瘤体积、降低瘤重及肿瘤指数，表明瓦草五环三萜皂苷类化合物具有较强的抗胃癌活性；同时化合物1和化合物2可明显增加荷瘤裸鼠体重(与模型组、5-FU组比较，p<0.01或p<0.01)，证明其药效优于5-FU，而毒副作用较5-FU低，是一种高效、低毒的抗肿瘤活性成分。当化合物1、2分别与5-FU联合使用时，小鼠体重有所增加，肿瘤指数明显下降，肿瘤抑制率有所提高，表明化合物1、2与5-FU合用有较好的减毒、增效作用。
实验例6 瓦草五环三萜皂苷类化合物抗人HT29结肠癌药效学研究
1实验方法
1.1动物与饲养管理
清洁级裸鼠，70只，雄性，体重19-22g，由中国食品药品检定研究所提供，合格证号：SCXK(京)2009-0017。适应性喂养1周后进行药效学实验。
实验动物饲养条件同实验例4。
1.2HT29结肠癌细胞的培养
HT29细胞体外培养方法同实验例4。
1.3实验设计
70只裸鼠适应性喂养1周后，将体外培养生长良好的HepG2细胞悬液接种至裸鼠背部皮下，1×107个细胞/只。接种结束后，按体重随机分为7组，分别为模型对照组、瓦草总皂苷组(按实施例1方法制备)、化合物1组、化合物2组、化合物1+紫杉醇组(PTX)、化合物2+PTX组和阳性药PTX组，每组10只。接种3天后开始给药，连续3周。
每周测定一次体重和肿瘤大小，并计算肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积：V＝π/6×a×b2(a、b为肿瘤的横轴、纵轴长度)
末次给药结束后，裸鼠禁食8小时，测定空腹体重，摘眼球取血，离心，分离血清备用，分离肿瘤组织，称重，并计算肿瘤指数及抑瘤率，计算公式 如下：
肿瘤指数＝肿瘤重量(mg)/动物体重(g)
抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％
1.3.1分组情况如下：
表13 动物给药与剂量
1.3.2给药方法
瓦草总皂苷、化合物1、化合物2、PTX分别溶于无菌注射用水中，过滤除菌；化合物1+PTX、化合物2+PTX分别以1∶19的比例制备混合液，过滤除菌。各给药组分别皮下注射(10ml/kg BW)相应药物，模型对照组只皮下注射等体积(10ml/kg BW)的注射用水。每天上午9点给药，共计3周。
1.3.3实验方案
体重的测定：每周测定一次裸鼠体重。
肿瘤的测定：每周测定一次裸鼠肿瘤大小，包括横径和纵径。
实验终止：给药3周(21天)后结束该实验研究。
数据统计：采用SPSS10.0软件进行数据处理分析，所有指标均以均数±标准差()表示，组间比较采用方差分析。
2结果
2.1不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HT29荷瘤裸鼠体重的影响
给药前，各组动物体重较为均衡，组间无统计学差异。接种肿瘤1周时，除PTX组动物体重稍有下降外，其它各组动物体重均有所增加；接种2周时，瓦草总皂苷、化合物1、2组动物体重仍有增加，而模型组、PTX组体重开始下降；接种3周时，除化合物1组动物体重仍有增加外，其它各组体重均有所下降，其中，模型组、PTX组体重下降较为明显。
化合物1、2与PTX合用可明显减弱PTX对动物体重的影响，从数据来看，各联合用药组小鼠体重每周均有所增加，表明化合物1、2可明显减轻PTX的毒副作用。如表14所示。
表14 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HT29荷瘤裸鼠体重的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
2.2瓦草五环三萜皂苷类化合物对HT29荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
给药1周时，各药物干预组动物肿瘤小于模型组肿瘤，但瓦草总皂苷、化合物1组肿瘤只表现为增长缓慢的趋势，与模型组比较，未出现统计学差异；给药2周、3周时，化合物2、PTX组肿瘤体积先升后降，而化合物1组肿瘤一直呈下降趋势，但增长速度明显低于模型组(p<0.05或p<0.01)。
化合物1、2与PTX联用，肿瘤生长受到更加明显的抑制，与各单独给药组比较，联合用药组肿瘤体积有明显减小，表现为较好的协同增效作用。如表15所示。
表15 瓦草五环三萜皂苷类化合物对HT29荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
2.3不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HT29荷瘤裸鼠瘤重、肿瘤指数及抑瘤率的影响
瓦草总皂苷、化合物1、2组动物肿瘤重量、肿瘤指数明显小于模型组(与模型组比较，均有p<0.01)，其中，化合物1、2抑制HT29肿瘤生长作用强度与PTX相近，肿瘤抑制率分别为50.44％和54.87％；瓦草总皂苷抑瘤率较化合物1、2低，为46.76％，三种药物均表现出为较好的抗结肠癌作用。
化合物1、2分别与PTX联用时，肿瘤重量较上述三种药物单独使用组明显减轻、肿瘤指数明显减小，肿瘤抑制率有所增加，表明化合物1、2与PTX联合用于抗肿瘤治疗，有较好的协同增效作用。如表16所示。
表16 不同瓦草五环三萜皂苷类化合物对HT29荷瘤裸鼠瘤重、肿瘤指数的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01.
3结论
瓦草总皂苷、化合物1和化合物2可明显增加人结肠癌HT29荷瘤裸鼠动物体重、减小肿瘤体积、降低瘤重及肿瘤指数，表现为较好的抗结肠癌药效学活性；同时，化合物1、2分别与PTX合用时，可明显增加小鼠体重、减小肿瘤指数，并增加肿瘤抑制率，与PTX联合用药，表现较好的增效、减毒作用。
具体实施例如下：
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1 瓦草总皂苷的制备
取瓦草21kg，粉碎后用170L的95％的乙醇和70％的乙醇分别提取三次，浓缩得浸膏7kg，浸膏用水稀释后，过D101大孔树脂，分别用水、10％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脱，其中90％洗脱部分即制得瓦草总皂苷，该总皂苷含量经分光光度法测定，总皂苷含量达61.2％。
实施例2 瓦草五环三萜类化合物的制备
取瓦草21kg，粉碎后用170L的95％的乙醇和70％的乙醇分别提取三次，浓缩得浸膏7kg，浸膏用大量水稀释后，过D101大孔树脂，分别用水、10％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脱，其中90％洗脱部分得到浸膏总重5kg。90％部分过Sephadex LH-20柱分离，然后过MCI柱，依次用水、30％、50％、60％、70％、90％、95％、100％甲醇洗脱，然后反复过sephadex LH-20，分别得到大分子化合物化合物1(sinocrassulosideⅥ)、化合物2(sinocrassulosideⅦ)、化合物3(sinocrassulosideⅧ)、化合物4(sinocrassulosideⅨ)、化合物7(sinocrassulosideⅫ)、化合物8(sinocrassulosideⅩⅢ)，其中，化合物1和化合物2、化合物3和化合物4、化合物7和化合物8为3对顺反异构体。。
化学结构鉴定数据如下：
化合物1和化合物2(sinocrassulosideⅥ和sinocrassulosideⅦ)：白色粉末，分子式为：C71H102O31。ESI-MS(m/z)：1473.2[M+Na]+，1449.7[M-H]-。 1H-NMR和13C-NMR的具体数据见表17。
化合物3和化合物4(sinocrassulosideⅧ和sinocrassulosideⅨ)：白色粉末，分子式为：C72H104O31。ESI-MS(m/z)：1487.2[M+Na]+，1499.7[M+Cl]-，1463.8[M-H]-。1H-NMR和13C-NMR的具体数据见表17。
化合物7和化合物8(sinocrassulosideⅫ和sinocrassulosideⅩⅢ)：白色粉末，分子式为：C75H110O31。ESI-MS(m/z)：1529.3[M+Na]+，1541.8[M+Cl]-，1505.6[M-H]-。1H-NMR和13C-NMR的具体数据见表17。
化学结构式鉴定结果如下：
化合物1
化合物2
化合物3和化合物4：白色粉末，分子式为：C72H104O31。化学结构式如下：
化合物3
化合物4
化合物7和化合物8：白色粉末，分子式为：C75H110O31。化学结构式如下：
化合物7
化合物8
实施例3 片剂的制备
分别取化合物1、2各33g，分别加药用淀粉217g，混合均匀，用适量的淀粉糊作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，压片，每片250mg，口服，每次1片，每日2次。
实施例3 胶囊剂的制备
分别取化合物1、2各33g，分别加药用淀粉217g混合均匀，用适量的淀粉糊作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，填充胶囊，每粒250mg，口服，每次1粒，每日2次。
实施例4 注射剂的制备
用注射用水3000mL溶解化合物1、2各33g，分别加入活性炭(105℃活化1h)30g，使其达到0.01％，加热煮沸20min，调PH值为5.5-6.5，加入氯化钠调为等渗溶液，趁热滤过，灌封，灭菌即得。每支3mL，肌肉注射，每次3mL，一日2次。
实施例5 粉针剂的制备
化合物1、2各33g冷冻干燥成细粉，或注射液每1000mL加入62.5g甘露醇和62.5g麦芽糖做支持剂，溶解后冷冻干燥，封装，灭菌即得。
实施例6 脂质体的制备
称取处方量化合物1、2各3.3g，大豆卵磷脂40g和胆固醇10g用氯仿和甲醇(2∶1)溶解，40℃恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，加入适量浓度的甘露醇和葡萄糖的水溶液1000mL，轻摇，将类脂膜洗脱并水合成脂质体初悬液，置探头式超声至半透明胶体溶液，微孔滤膜滤过，滤液分装后冷冻干燥。
实施例7 滴丸剂的制备
分别取化合物1、2各16.5g，分别加聚乙二醇400033g，加热熔化均匀后，在80℃状态下，以每分钟20滴的速度滴入液体石蜡冷凝剂(冷凝剂上部的温度控制在5～15℃)中，成形后，取出，去除冷凝剂，干燥，得本品1000丸。控制丸重在0.0495g/丸。
实施例8 缓、控释制剂的制备
①骨架片：分别取化合物1、2各66g，HPMC K100M40g，乳糖120g，淀粉40g。混合均匀，用适量的5％PVP的95％乙醇溶液作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，压片，每片266mg，口服，每次1片，每日1次。
②微孔渗透泵、薄膜包衣：每片273mg，口服，每次1片，每日1次。
片心：取化合物1、2各66g，分别加乳糖140g，淀粉50g，氯化钠3g，滑石粉1g，用适量的5％PVP的95％乙醇溶液作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，压片，每片260mg；
包衣液：醋酸纤维素用丙酮和异丙酮的混合溶液溶解，浓度为2％(g/100mL)，加入邻苯二甲酸二丁酯25％为增塑剂，加入PEG400为致孔剂，将片心包衣，衣膜增重5％。
实施例9 乳剂的制备
分别取化合物1、2各0.5g、二甲基亚砜14mL、三乙醇胺1.6g、甘油4.0g、蒸馏水54mL、羊毛脂2.0g、白凡士林10g、硬脂酸16g，混合均匀。
实施例10 口腔黏附片的制备
取化合物1、2各33g，分别加HPMC K4M50g，HPMC K15M25g，乳糖85g，硬脂酸镁1.5g，阿斯巴甜5.5g。混合均匀，分别粉碎过100目筛，采用粉末直接压片法压片，每片200ｍg，口服，每次1片，每日2次。
实施例11 口崩片的制备
取化合物1、2各33g，低取代羟丙基纤维素146.65g，微晶纤维素75g，阿斯巴甜8.1g，薄荷脑5.4g，乳糖35.5g，硬脂酸镁1.35g。口服，每次1片，每日2次。
实施例12 颗粒剂的制备
取化合物1、2各33g，乳糖1167g，糊精2800g，混合均匀，用适量的95％乙醇作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，包装机包装，每袋4g，口服，每次1袋，每日2次。
以上仅为本发明较佳的实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内所作任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明保护范围之内。
机译： 金红石型五环三萜皂苷的抗肿瘤药物用途
机译： 金红石型五环三萜皂苷化合物的抗肿瘤药学用途
机译： 取代了吲哚3-glioxilamidas的化合物，可用作抗肿瘤药物，用这些衍生物制成的药物组合物这些衍生物在制备抗肿瘤药物和如此制备的药物中的用途。
