白头翁质量评价与五环三萜皂苷类成分的药物代谢动力学研究

摘要

白头翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)是毛茛科植物白头翁的干燥根[3]，主要分布于亚洲、欧洲和北美洲等地区。白头翁具有清热解毒、凉血止痢的功效，临床上被广泛用于阿米巴性痢疾、疟疾、阴道滴虫、细菌感染和恶性肿瘤等疾病的治疗。近年来，由于白头翁药材具有明显的抗肿瘤[6-11]作用而越来越被广泛关注。故本课题对白头翁药材进行了系统地分离、质量评价和药物代谢动力学研究。
　　本实验采用大孔吸附树脂法，硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶和反相柱色谱法对白头翁药材进行系统分离，并建立了一个简单、快速的HPLC-ESI-MS法同时定量测定白头翁药材中9种化学成分。在对其进行定性研究中，利用HPLC-ESI-MS/MS联用技术分析研究了8个五环三萜皂苷类化合物的特征碎片离子，推测其电喷雾质谱裂解规律，最终在白头翁提取物中推导出了37个五环三萜皂苷化合物的结构。在药代动力学研究中，首次建立了一种灵敏的、可靠的多次切换监测模式HPLC-MS方法同时测定大鼠灌胃给予白头翁提取物后大鼠血浆中4种三萜皂苷的含量，并应用于药代动力学研究。首次对大鼠口服白头翁提取物后胆汁中6种五环三萜皂苷类化合物进行分析测定，并对这些三萜皂苷的胆汁排泄轮廓进行研究。综上对白头翁药材的系统研究将为其进一步开发应用提供全面的理论依据。
　　第一部分白头翁化学成分研究
　　目的：研究药材白头翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)中的化学成分。
　　方法：取粉碎后的白头翁约10 kg，用70％乙醇冷浸提取3次，采用AB-8大孔吸附树脂进行分离，收集70％乙醇洗脱液部分，得浸膏(总苷)约500 g。采用大孔吸附树脂法，硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶和反相柱色谱法对白头翁药材进行系统分离，并用波谱和化学方法鉴定化合物的结构。
　　结果：从白头翁的70％乙醇提取物中分离得到9个单体化合物，对其进行了结构鉴定，其中包括5个五环三萜皂苷，2个三萜酸，2个甾酮类化合物。分别鉴定为齐墩果酸、白头翁皂苷A3、白头翁皂苷B4、23-羟基白桦脂酸、刺人参皂苷S、白头翁皂苷B、白头翁皂苷C、筋骨草甾酮C和β-蜕皮甾酮。
　　结论：从白头翁中分离鉴定了9个化合物，其中3个化合物为首次从该植物中发现，分别为刺人参皂苷S，筋骨草甾酮C和β-蜕皮甾酮。
　　第二部分液质联用技术同时测定白头翁中9种化学成分及其质量表征
　　目的：建立HPLC-MS法测定白头翁中白头翁皂苷B4(1)，白头翁皂苷A3(2)，23-羟基白桦脂酸(3)，刺人参苷S(4)，白头翁皂苷C(5)，白头翁皂苷B(6)，齐墩果酸(7)，β-蜕皮甾酮(8)和筋骨草甾酮C(9)含量的方法。
　　方法：采用Sapphire C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A(甲醇含0.1％甲酸)-B(0.1％甲酸水溶液)，梯度洗脱程序为0-6 min(75％-95％A)，6-14 min(95％A)，随后回到最初75％A并持续到21 min；流速为0.8 mL·min-1。采用电喷雾离子源进行正离子和负离子模式检测，多反应监测模式(MRM)用于定量测定。正离子监测模式下源喷射电压设置为5500 V；负离子监测模式下源喷射电压设置为-4500 V；离子源温度为650℃。雾化气(Gasl)：40 psi，加热气(Gas2)：50 psi，接口持续加热，帘气25 psi，全程氮气通入状态。扫描方式采用多重反应监测(MRM)；碰撞气(CAD，N2)压力为medium；Q1和Q3分辨率均为UNIT。
　　结果：峰面积与浓度呈良好的线性关系(r2>0.9948)；日内和日间精密度分别小于2.78％和2.68％，并应用于20批次不同来源白头翁药材的含量测定。
　　结论：本研究中建立的分析方法灵敏度高、专属性好，可为白头翁药材质量控制提供一个强有力的工具。有助于规范白头翁药材的质量，并能够在一定程度上指导中医临床用药的合理性。
　　第三部分液质联用技术定性鉴定白头翁中五环三萜皂苷类成分
　　目的：对白头翁进行超声提取后即进行HPLC-MS分析，研究8个五环三萜皂苷类化合物的特征碎片离子，推测其电喷雾质谱裂解规律，再将此规律应用于白头翁中未知羽扇豆烷型和齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的结构推测，根据已知裂解规律尽可能多的推测出白头翁中五环三萜皂苷的化学结构。
　　方法：采用了MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI两种模式分析未知五环三萜皂苷类化合物。取白头翁药材粉末(40目)5 g，加70％甲醇25 mL，称重，冰浴超声提取1 h，称重，用70％甲醇补足减失的重量，0.45μm微孔滤膜滤过，滤液减压蒸干，残渣用2 mL的70％甲醇溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，进行HPLC-MS分析。色谱柱为Sapphire C18(250 mm×4.6mm，5μm)，采用0.1％甲酸甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)为流动相，梯度洗脱75-75％A(0-15 min)；75-80％A(15-30 min)；80-95％A(30-40min)；95-95％A(40-50 min)，流速为700μL·min-1。质谱：ESI源；负离子检测源电压-4500 V；正离子检测源电压5500 V；源温度(TEM)：650℃；雾化气(gas1)：40 psi，加热气(gas2)：50 psi，帘气(CUR)：25 psi。
　　结果：通过与对照品的保留时间、分子量和质谱数据比较，分别对8个已知五环三萜化合物色谱峰进行归属。化合物6，10，14，18，20，21，35和36分别鉴定为白头翁皂苷B4，白头翁皂苷C，23-羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[吡喃鼠李糖基-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]，白头翁皂苷B，23-羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[吡喃阿拉伯糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]，常春藤皂苷元28-O-[吡喃葡萄糖基.吡喃葡萄糖酯苷]，白头翁皂苷A3和常春藤皂苷。同时，通过由对照品裂解行为总结得出的规律推断出了29个五环三萜皂苷类化合物的结构。
　　结论：本实验首次建立了利用HPLC-ESI-MS联用技术分析白头翁中五环三萜皂苷类成分的方法。本法灵敏度高、专属性强，成功用于白头翁中五环三萜皂苷类化合物的结构鉴定。通过联合MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI扫描模式对化合物结构分析方面具有明显优越性，对控制中药材质量具有重要意义。
　　第四部分 HPLC-MS法同时测定大鼠血浆中4种五环三萜皂苷类成分及其药物代谢动力学研究
　　目的：建立HPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中白头翁提取物4个五环三萜皂苷类化合物(白头翁皂苷B4，白头翁皂苷B，白头翁皂苷A3和23-羟基白桦脂酸)的分析方法，并计算其在大鼠体内的药动学参数。
　　方法：血浆样品采用了Strata-X固相萃取柱预处理，采用Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱；以A(甲醇含0.1％甲酸)-B(0.1％甲酸水溶液)为流动相，梯度洗脱程序为：0-6 min，75-95% A；6-15 min，保持95%A不变，预平衡时间为6 min，流速为800μL·min-1。色谱柱后溶液全部进入离子源，无分流，分析时间为15 min。质谱以电喷雾离子源进行正离子模式和负离子模式检测，采用多反应监测模式，并首次应用了多次切换检测模式。白头翁皂苷B4，白头翁皂苷B，白头翁皂苷A3，23-羟基白桦脂酸和内标的监测离子对分别为m/z1219.7/749.4，m/z819.4/347.2，m/z749.6/471.2，m/z471.4/471.4和m/z461.1/285.0。本研究将4种五环三萜皂苷类成分和内标化合物的检测过程划分为5个阶段：0.0-6.998 min，内标和白头翁皂苷B4在负离子模式下监测；6.998-7.028min，负离子扫描模式被切换至正离子扫描模式；7.028-10.027 min，正离子模式下监测白头翁皂苷B；10.027-10.057 min，正离子扫描模式被切换至负离子扫描模式；10.057-15.059min，负离子模式下监测白头翁皂苷A3和23-羟基白桦脂酸。
　　结果：4种五环三萜皂苷类成分在大鼠血浆中专属性、线性、准确度、精密度、提取回收率和基质回收率均被验证。4种待测化合物的线性关系良好(r2>0.99)；日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于9%；在室温储存24 h，5次冻融和-20℃储存30天的条件下各待测化合物的稳定性良好，准确度在-6.82%-6.18%之间；高、中、低三个浓度水平的平均提取回收率分别为82.16%-104.5%；基质效应均值在77.69%-108.2%之间。
　　结论：该方法特异、快速、灵敏，结合固相萃取的预处理方法和HPLC-MS的新检测手段对白头翁中4种五环三萜皂苷类化合物进行了药物代谢动力学研究。本研究中首次应用了多次切换检测模式，并首次在五环三萜皂苷类化合物体内测定时采用了Strata-X固相小柱进行生物样品预处理。此方法为五环三萜皂苷类化合物的药物代谢动力学研究提供了一个新的思路。
　　第五部分液质联用技术测定大鼠胆汁中6种五环三萜皂苷类成分及其排泄动力学研究
　　目的：建立一种可同时测定大鼠胆汁中6种主要五环三萜皂苷类化合物(白头翁皂苷B4，刺人参苷S，白头翁皂苷C，白头翁皂苷B，白头翁皂苷A3和23-羟基白桦脂酸)含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃给予白头翁提取物后其6种待测化合物的胆汁排泄动力学研究。
　　方法：色谱柱为Sapphire-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱温为25℃：流动相为(0.1%甲酸)甲醇A-0.1%甲酸水溶液B，梯度洗脱，洗脱程序如下：0.0-6.0 min，75-95% A；6.0-15.0 min，保持95% A；进样前预平衡6 min。流速为800μL·min-1。色谱柱后溶液全部进入离子源，无分流，进样量为10μL。电喷雾离子源(ESI源)，Turbo V离子源，源温度为650℃。源喷射电压为5500 V和-4500 V，源内气体1(Gasl，N2)压力：40 psi；气体2(Gas2，N2)压力：50psi；气帘气体(N2)压力：25 psi；正负离子分别检测模式；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(CAD，N2)压力为medium；Q1分辨率为UNIT，Q3分辨率为UNIT。SD大鼠8只，随机分成2组。其中2只为空白对照组，实验组6只大鼠灌胃给予白头翁提取物(10 mL·kg-1)后，收集给药后0-1 h，1-3 h，3-5 h，5-7 h，7-9 h，9-12 h和12-24 h时间段的胆汁并测定体积。测定大鼠灌胃给予白头翁提取物后胆汁中6种五环三萜皂苷类化合物的累积排泄率。
　　结果：大鼠胆汁中内源性物质不干扰6种待测化合物和内标的测定；6种五环三萜皂苷类成分标准曲线的相关系数(r2)均大于0.9973；日内RSD和日间RSD分别小于9.1%和9.0%，RE在-9.5%到9.2%之间；提取回收率的范围为80.03%～115.6%；基质效应的范围为78.43%～109.7%。
　　结论：该方法简便、快速、灵敏度高、专属性强，可满足大鼠胆汁中微量五环三萜类皂苷成分的测定要求。待测6种五环三萜皂苷类化合物在1～3 h内排泄率最高，在3～5 h时间段时略有减少，随着时间的推移，排泄率逐渐降低，并趋于平缓。结果表明，只有不到14%的待测物以原型从胆汁排泄，结果表明其五环三萜皂苷类化合物在体内可能存在某种生物转化和体内代谢。
　　第六部分白桦脂酸血浆蛋白结合率测定
　　目的：建立白桦脂酸在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白中蛋白结合率的测定方法。
　　方法：采用平衡透析法测定白桦脂酸血浆蛋白结合率，利用HPLC法测定血浆中白桦脂酸浓度，测定并比较不同血浆中白桦脂酸的血浆蛋白结合率。
　　结果：在50～100μg/mL，药物浓度对血浆蛋白结合率无显著影响，白桦脂酸与大鼠和人的血浆蛋白结合率存在显著性差异，白桦脂酸与人血浆蛋白结合率高于与大鼠血浆蛋白结合率。
　　结论：白桦脂酸与血浆蛋白具有较强的结合，且在实验设计的浓度范围内蛋白结合率与透析液中药物浓度无关。只有少量游离药物作为活性药物分子参与体内药物处置，从而产生药理效应。
　　第七部分白桦脂酸大鼠在体肠吸收动力学研究
　　目的：建立同时测定肠循环液中白桦脂酸和酚红浓度的HPLC-DAD法，并探讨白桦脂酸在大鼠各肠段的吸收动力学特征及不同药物浓度对吸收的影响。
　　方法：采用大鼠在体肠吸收实验模型，并考察吸收部位、药物浓度和pH值对药物吸收的影响。色谱柱为Diamonsil ODS C18色谱柱(250mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈-0.2%乙酸(75:25)；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测波长203 nm(白桦脂酸)和430 nm(酚红)；进样量20μL。
　　结果：在75～125μg·mL-1内白桦脂酸的吸收速率与质量浓度呈线性关系，Ka值基本保持不变；各肠段的吸收速率无显著性差异，十二指肠、空肠、回肠和结肠的Ka值分别为(0.151±0.0049)，(0.156±0.0056)，(0.149±0.0083)，(0.159±0.0041)h-1。
　　结论：白桦脂酸在小肠中吸收良好，没有特定吸收部位；不同浓度对白桦脂酸在大鼠全肠道的吸收无显著影响，其在肠道的吸收呈一级吸收动力学特征，吸收机制为被动扩散。白桦脂酸是难溶性药物，可以通过增加药物的溶出度，进而提高药物的生物利用度。