一种利用实时荧光定量PCR进行谷子锈病早期诊断的技术

摘要

本发明涉及一种通过实时荧光定量PCR检测谷子叶片中锈菌（Uromycessetariae-italicae）含量的方法，是在谷子接种锈菌0h，6h，18h，30h，36h，42h，72h后采集谷子叶片样本；将各时间点采集的叶片样本提取总DNA，根据锈菌核糖体ITS序列设计特异性引物，通过实时荧光定量PCR，利用特异性引物，对锈菌进行定量分析，测定锈菌在谷子叶片接种后组织内的DNA随时间的变化规律。本发明建立了精确度高、特异性强、灵敏度高的谷子锈菌荧光定量PCR检测方法，进而为锈菌的致病机制、分子生物学研究等奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）技术对谷子锈菌进行定量检测，属于植物真菌分子生物学检测技术领域。

背景技术

谷子（Setaria italica）属禾本科（Cramineae）黍亚科（Panicoideae）、黍系（Panicatae）、黍族（Paniceae）、狗尾草亚族（Setaviineae）狗尾草属（Setaria），是我国起源较早的一种作物，在中国北方地区广泛种植。谷子抗旱耐瘠、营养丰富，是我国重要的食品和饲用谷物。但是由于谷子病害的发生，导致谷子产量和质量下降。谷子锈病是世界谷子产区经常发生的一种病害，严重影响谷子生产。锈病流行年份，无论是夏谷区、春谷区还是夏谷与春谷混种区的感病品种产量损失严重，一般减产30%以上，严重地块甚至颗粒不收。

谷子锈病病原菌Uromyces setariae-italicae，属担子菌亚门（Basidiomycotina），单胞锈属（Uromyces）。谷子锈病在谷子的叶片和叶鞘上都可发生，但在叶片上发生更加严重。发病初期，在叶片表面与叶背面，特别是背面产生红褐色斑点，稍隆起，即锈菌的夏孢子堆。叶片上一般可产生许多夏孢子堆，成熟后突破寄主表皮而外露，增强了植株的蒸腾作用，使植株丧失大量水分，减少光合作用面积，严重时夏孢子堆布满叶片，造成叶片枯死。发病后期，在病株的叶背和叶鞘上，尤其叶鞘上散生大量灰黑色小点，即锈菌的冬孢子堆。冬孢子堆大都生长在叶片的腹面或叶鞘上，长期埋生在寄主的表皮下，故症状不明显。谷子锈菌为专性寄生菌，有高度的致病性分化，各地存在不同的生理小种。谷子锈病除为害谷子外，还能侵染青狗尾草、莠狗尾草、倒刺狗尾草、谷莠子、中型狗尾草、轮生狗尾草及印度高野黍等。

由于在病害发生的早期阶段，症状并不明显，用传统的方法很难发现，延误了控制病害的最佳时机。近年来，分子生物学技术的发展为植物体内病原菌的快速、准确诊断提供了有效的工具。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的将PCR技术与荧光检测相结合的技术，实现了PCR从定性分析到定量检测的飞跃，通过对荧光信号的采集，达到实时监测PCR过程的目的，从而实现对体系中模板DNA的定量分析。潘娟娟等利用实时荧光定量PCR检测到小麦条锈菌侵入小麦叶片12小时后小麦叶片内的条锈菌含量。M.S. Hamada 等利用实时荧光定量PCR检测并定量小麦茎上的禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）。Ronald J. Sayler 等利用real-time PCR 检测了水稻中立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-1 IA ，灵敏度达到1pg。Bohm等、Gachon等、Mercado-Blanco等也都利用实时荧光定量PCR检测了病原菌在植物体内的变化规律。因此，实时荧光定量PCR技术为快速、准确的检测谷子锈菌提供了技术支持，能够更早、更及时的发现病原菌，对谷子锈病的早期检测和防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种通过实时荧光定量PCR技术检测并准确定量谷子中锈菌的方法，通过该方法可快速诊断出谷子植株中是否携带锈菌并得到锈菌的具体含量。该方法能大大缩短检测周期，为锈病的预防和病情的控制提供保障。

本发明的具体步骤是：

1、提取谷子锈菌基因组DNA，以ITS通用引物扩增锈菌基因组DNA，其上游引物和下游引物碱基序列如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。PCR扩增获得727bp的特异性片段，片段回收纯化后与PMD19-T载体连接过夜，通过热激法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，挑取转化菌落进行PCR检测，把插入目的片段的克隆送上海生工进行测序，测序分析后获得该特异片段核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No.3所示。把测定的序列的阳性克隆提取质粒，利用NanoDrop 1000测定质粒浓度，方便后续系列稀释；

2、实时荧光定量PCR引物设计

根据锈菌核糖体ITS序列测序结果，应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5：

SEQ ID No.4   rustf   GGTGCACTTAATTGTGGCTCAA

SEQ ID No.5   rustr   CTCCTTTTCTTTTTCCCTCTCAAA

3、谷子上其它常见真菌DNA的提取；

4、引物特异性检测

应用引物rustf与rustr对谷子锈菌以及谷子上其它常见真菌谷子白发（Sclerospora graminicola）、谷瘟（Pyricularia setariae）、谷子纹枯（Rhizoctonia solani）、粟粒黑穗（Ustilago crameri）、粟胡麻斑（Bipolaris setariae）、粟弯孢霉（Curvularia lunata）、粟灰斑病（Cercospora setariae）提取的DNA进行普通PCR和Real-Time Q PCR扩增，测定引物的特异性；

5、在谷子接种锈菌0h，6h，18h，30h，36h，42h，72h后分别采集谷子叶片样本；

6、将各时间点采集的叶片样本提取总DNA；

7、实时荧光定量PCR标准曲线绘制

以上述提取阳性质粒为荧光定量标准品，10倍系列稀释（10ng/μL ~ 10fg /μL）用于荧光定量标准曲线绘制，扩增反应体系为：20.0μL，其中Mix 10.0μL，上下游引物各0.8μL，ROX 0.4μL，模板2.0μL，dH₂O（灭菌蒸馏水）6.0μL；反应程序为：孵育50℃ 2min，预变性95℃ 10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共进行40个循环；然后95℃ 15s，60℃ 1min，再从60℃每秒上升0.3℃至95℃ 15s，收集荧光，用于绘制熔解曲线； 

8、在本发明中所述的标准曲线为Y₁=—3.381X₁+28.248，R²=0.995，其中Y₁为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X₁为锈菌DNA的标准质粒含量对数值；

9、根据标准曲线分析待测谷子叶片中的锈菌。

本发明的优点在于：应用分子生物学手段研究植物体内病原菌，建立了快速、简便的鉴定方法，在谷子感染锈菌6h就能够检测到锈菌。此方法不仅鉴定了锈菌，并且可对其进行准确的定量，得到谷子在被锈菌侵染后各时间点的锈菌含量，从而在病害发生初期还未显现出明显症状时就对病害进行准确的监控，在病害发生早期做出相应的防治措施，将病害的危害程度降到最低。

本发明的有益效果主要体现在：

 (1) 灵敏度高：通过倍比稀释DNA标准品进行灵敏度检测，可检测到最低浓度为10fg /μL；

 (2) 特异性强：结果显示，谷子上常见的7种病菌均未见扩增，只有锈菌产生扩增；

 (3) 重复性好：本发明所建立的标准曲线为Y₁=—3.381X₁+28.248，R²=0.995，接近于1。这说明PCR模板与Ct值之间具有良好的线性函数关系，定量结果有较高的准确性和重复性。

附图说明

图1：使用通用引物对锈菌DNA的ITS序列扩增结果；

图2：锈菌系列稀释标准品Real-time Q PCR扩增曲线；

图3：锈菌系列稀释标准品Real-time Q PCR标准曲线；

图4：锈菌系列稀释标准品荧光定量PCR熔解曲线；

图5: 电泳检测引物特异性，其中1为锈菌DNA，2-8依次为谷子白发（Sclerospora graminicola）、谷瘟（Pyricularia setariae）、谷子纹枯（Rhizoctonia solani）、粟粒黑穗（Ustilago crameri）、粟胡麻斑（Bipolaris setariae）、粟弯孢霉（Curvularia lunata）、粟灰斑病（Cercospora setariae）的DNA， 9为阴性对照；

图6：Real-time Q PCR检测引物特异性熔解曲线；

图7：谷子植株中锈菌含量随接种时间变化图。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，但以下描述对本发明的保护范围不构成任何意义上的限定，仅仅做示例说明。

实施例1：锈菌ITS序列的扩增。

（1）锈菌DNA的提取

a) 将25mg锈菌孢子加入到1.5 mL离心管中，加入500 μL提取缓冲液（50 mM Tris–HCl,， pH 8.0，150 mM NaCl， 100 mM EDTA），充分混匀；

b) 向混合液中加入5μL 蛋白酶 K (1 mg/mL)，再加入提取缓冲液至1 mL，65°C水浴30 min；

c）将混合液分装到两个1.5 mL离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，vol/vol/vol， pH=8.0)，离心；

d）取上清，移到一个干净的1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿，离心；

e）取上清，移到一个干净的1.5 mL离心管中，加入等体积的冰冻异丙醇，?20°C冷冻1小时；

f）12,000 rpm ，4°C离心20 min，使DNA沉淀；

g) 弃上清，用70%的冰冻乙醇漂洗两次，自然风干后加入0.1 mL TE 缓冲液 (10 mM Tris–HCl，1 mM EDTA,，pH 8.0)使其溶解；

h) 加入1μL 10 mg/ mL RNA酶（终浓度为20μg/ mL），4°C过夜，彻底酶解RNA；

i) 将DNA再次沉淀，用70%冰冻乙醇漂洗，自然风干，溶解在50 μL TE中。

（2）以ITS通用引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2扩增锈菌DNA

PCR反应的体系为：25.0μL，其中2×Taq MasterMix 12.5μL，上下游引物10μM各1.0μL，DNA模板1.0μL，dH₂O（灭菌蒸馏水）9.5μL；PCR反应程序为： 95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min共进行35个循环；72℃延伸10min。扩增后的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，经EB染色后用BioRad凝胶成像系统成像。结果显示，可以扩增出单一的条带，片段大小在750bp左右（见附图1）。 

（3）将特异性片段切胶后用胶回收试剂盒回收DNA，然后连接到pMD-19T载体上并转化JM109感受态细胞中，在添加了氨苄抗性的LB培养基中37℃过夜培养，挑选长出的阳性克隆进行测序分析，测得序列为SEQ ID No.3，序列在 NCBI 经 Blast 分析，与锈菌序列同源性最高为 97%，由此确定扩增片段的正确性。利用质粒小提试剂盒提取阳性克隆质粒，并把其作为荧光定量阳性质粒标准品，利用NanoDrop 1000测定质粒浓度。

实施例2：引物的特异性检测。

选择其它7种谷子上常见的真菌谷子白发（Sclerospora graminicola）、谷瘟（Pyricularia setariae）、谷子纹枯（Rhizoctonia solani）、粟粒黑穗（Ustilago crameri）、粟胡麻斑（Bipolaris setariae）、粟弯孢霉（Curvularia lunata）、粟灰斑病（Cercospora setariae）进行引物特异性的验证，具体步骤为：

 (1) 提取这几种菌的总DNA为模板，提取方法与锈菌DNA的提取方法相同；

 (2) 根据锈菌核糖体ITS序列测序结果，应用Primer Premier 5.0软件设计了荧光定量特异性引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5：

SEQ ID No.4   rustf   GGTGCACTTAATTGTGGCTCAA

SEQ ID No.5   rustr   CTCCTTTTCTTTTTCCCTCTCAAA

（3）应用引物rustf/rustr对锈菌DNA及其它7种真菌DNA进行普通PCR和 Real-Time Q PCR扩增，结果显示，只有锈菌DNA有扩增产物，其它7种真菌没有相应的扩增产物。结果说明引物的特异性很好，可以用于锈菌的特异性分析。

通过普通PCR扩增对引物特异性进行检测表明，引物只对锈菌DNA可以稳定地扩增出145bp的目标条带，其它7种真菌DNA以及阴性对照均未扩增出目标条带（见附图5）。通过Real-Time Q PCR对引物的特异性检测同样表明，该对引物对锈菌出现了单一产物吸收峰，其它7种真菌则无此产物吸收峰（见附图6），表明了该Real-Time Q PCR检测为特异性扩增。

实施例3：实时荧光定量PCR体系的建立及检测分析

特异性引物对与实施例2相同。

（1）制作标准曲线所需模板的制备

将阳性质粒DNA标准品梯度稀释为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100 fg /μL、10 fg /μL 7个浓度梯度。

（2）实时荧光定量PCR

以稀释好的DNA为模板进行荧光定量PCR分析，同时设置阴性对照。20μL反应体系：Mix 10.0μL，上下游引物各0.8μL，ROX 0.4μL，模板2.0μL，dH₂O（灭菌蒸馏水）6.0μL；反应程序为：UDG孵育50℃ 2min，预变性95℃ 10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共进行40个循环；然后95℃ 15s，60℃ 1min，再从60℃每秒上升0.3℃至95℃ 15s，收集荧光，用于绘制熔解曲线。反应在Applied Biosystems StepOne^TM荧光PCR仪上进行，扩增曲线、标准曲线以及熔解曲线由仪器自动生成。

Applied Biosystems StepOne^TMReal-Time PCR Software绘制出反应的扩增曲线（见附图2）。扩增曲线显示，从左至右7条曲线依次代表标准品的10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100 fg /μL、10 fg /μL的梯度稀释的扩增曲线，7个DNA标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型曲线，且各循环阈值（Ct值）间隔较均匀。

根据扩增曲线提供的标准品各梯度浓度及反应的循环阈值（Ct值）Applied Biosystems StepOne^TMReal-Time PCR Software自行绘制出反应的标准曲线（见附图3）。该标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数R²=0.995，斜率为-3.381，扩增效率E=97.58%，符合荧光定量分析对标准曲线的要求。

测定各浓度梯度稀释的标准品及样品在PCR过程中的熔解温度并绘制熔解曲线（见附图4）。标准品及样品的熔解曲线峰型单一，且标准品及样品熔解温度相同（75.47），表明扩增反应产物熔解温度较均一，特异性好且无引物二聚体影响。

实施例4：谷子被锈菌侵染后叶片中锈菌含量分析

荧光定量PCR仪采用ABI公司生产的Applied Biosystems StepOne^TM荧光PCR仪进行。

（1）叶片样品的采集

无菌栽培15盆谷子感病品种豫谷1号，每盆5株苗，在培养箱中培养至谷子幼苗长到6~7叶期时用于实验。将谷子锈菌强毒性小种93-5单孢菌系新鲜的夏孢子配成5×10⁶个孢子/mL的孢子悬浮液，均匀的喷洒在谷子叶片上，黑暗条件下保湿48h后置于培养箱中继续培养。在谷子接种锈菌0h，6h，18h，30h，36h，42h，72h后分别采集谷子叶片样本，每盆采集1片叶子，共15片，作为1个重复，总共设置3个重复。采集到的叶片迅速放到液氮中，然后保存到-80℃，备用。

（2）将各时间点采集的叶片样本提取总DNA

a）取谷子叶片1-1.5g，加液氮研磨成粉末；

b）将粉末转移到1.5mL离心管中，加入650μL CTAB提取缓冲液，65℃水浴40min；

c）冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（v：v=24:1），颠倒混匀，4℃，12000rpm离心15 min；

d）取上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（v：v=24:1），颠倒混匀，4℃，12000rpm离心15 min；

e）取上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积的冰冻异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃冷冻30min；

f）4℃，12000rpm 离心15 min；

g）弃上清，使用质量浓度75%的乙醇漂洗沉淀1-2次；

h）待沉淀自然风干后，溶解于200μL TE中，利用NanoDrop 1000测定接种后各时间点叶片总DNA浓度，4℃保存备用。

（3）利用实施例2提供的特异性引物对，采用实施例3的扩增体系进行扩增，根据标准曲线计算即可获得各接种时间点谷子叶片中锈菌含量。结果显示，在接种6h后就能够检测到锈菌在叶片中的含量为0.03ng/g叶片，并且随着接种时间的增加谷子叶片中锈菌含量增加（见附图7）。

谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）ITS序列片段扩增通用引物的上游引物：

TCCGTAGGTGAACCTGCGG 

谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）ITS序列片段扩增通用引物的下游引物：

TCCTCCGCTTATTGATATGC

谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）ITS序列通用引物扩增的目标片段：  

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGATAAAAAAAAATGGGTGCACTTAATTGTGGCTCAATTTATATTATCATTTCACATCTCATATACAAAACTTATTAACGTGAAGAAATTCATTGTTAATAGGTATAAGTAAATTTCTTTACTCTTCCCCTTTTTTTTTGAGAGGGAAAAAGAAAAGGAGTTTGCATTATCCCCCCCAACCTTTTTTTTTAACACTATATCAATGAACTTGAATGTAAAAATATGTTATAAATCATATATAACTTTTAACAATGGATCTCTAGGCTCTCACATCGATGAAGAACACAGTGAAATGTGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACCTTTTGGTATTCCAAGAGGTACACCTGTTTGAGTGTCATGAAAACCTTCTCATTATATAAAATTTTAATTAATTTTGTATATGGATTTTGAATGTTGCAAAAAAATAATCATAAATTTATTTGCTCATTTTAAATAAATAAAAGTTATATTCAAATGTATGAGTGGATTAACTTGATGCGTAATAATTTTCCAATCTCACATTAAGGAAGGAGTTTTGATAAACTTGCCACTTTTTATATATTTTGAAAAGGACTACTAAAGTAAAATCATTTTTTTTTTTTTAGACCTCAAATCAGGTGGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA     

谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）ITS序列片段扩增的特异性上游引物rustf：

GGTGCACTTAATTGTGGCTCAA

谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）ITS序列片段扩增的特异性下游引物rustr：

CTCCTTTTCTTTTTCCCTCTCAAA 

谷子锈菌（Uromyces setariae-italicae）ITS序列特异性引物扩增的目标片段：

GGTGCACTTAATTGTGGCTCAATTTATATTATCATTTCACATCTCATATACAAAACTTATTAACGTGAAGAAATTCATTGTTAATAGGTATAAGTAAATTTCTTTACTCTTCCCCTTTTTTTTTGAGAGGGAAAAAGAAAAGGAG