一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法

摘要

一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，属于材料化学技术领域。本发明包括金纳米粒子修饰穿膜肽，金纳米粒子与调控序列的偶联，双功能纳米金二聚体组装，纳米金二聚体对细胞内基因的调控，细胞内基因调控的表征。本发明选择金纳米粒子作为激元，将具有能调控survivin基因的反义核苷酸修饰在单一的金纳米粒子上，再将其与连接有穿膜肽的粒子进行组装，使其能够高效快速的发挥细胞内基因调控的作用。本发明提供了具有细胞内基因调控作用的纳米金二聚体组装方法，得到了结构均一，性能优越的纳米金二聚体结构。

说明书

技术领域

本发明涉及一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，属于材料化学技术领域。

背景技术

基因表达普遍存在于细胞的各个生命过程中，是细胞把遗传物质中的信息转化为具有一定功能的蛋白质的过程。基因表达调控主要是在转录、翻译以及mRNA加工水平上利用相关的DNA调节序列、酶以及调节蛋白对生命活动规律进行有序调控。利用人工合成的反义核苷酸，通过碱基互补原则将其结合到特异性的靶基因上，能够有效调控靶基因的表达。另一方面，金纳米材料因其具有良好的生物相容性，被广泛应用于生物载药，疾病治疗等纳米医学领域。通过自组装的方式将两种具有不同功能的粒子组装成二聚体结构，从而使二聚体结构表现出高效的细胞内基因调控的作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法。

本发明的技术方案：一种等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，步骤如下：

（1）金纳米粒子修饰穿膜肽：将柠檬酸还原法合成的金纳米粒子与巯基聚乙二醇PEG 5000、穿膜肽TAT和DNA1混匀，24h后得到表面修饰有穿膜肽的Au-TAT-DNA1复合体；

（2）金纳米粒子与调控序列的偶联：将金纳米粒子与survivin基因的反义核苷酸anti-DNA和DNA2偶联，得到表面修饰有调控序列的Au-anti-DNA-DNA2复合体；

（3）双功能纳米金二聚体组装：将步骤（1）得到的Au-TAT-DNA1复合体和步骤（2）得到的Au-anti-DNA-DNA2复合体混匀，得到双功能纳米金二聚体组装结构；

（4）纳米金二聚体对细胞内基因的调控：将步骤（3）中得到的双功能纳米金二聚体组装结构与细胞共同孵育3h后，用胰蛋白酶消化细胞，得到纳米金二聚体调控后的细胞悬液；

（5）细胞内基因调控的表征：将步骤（4）获得的细胞悬液中的总RNA提取出来，再将其反转录为cDNA，用荧光定量PCR检测survivin基因在体内的表达量，并与内参基因β-actin相比较，计算其相对表达量，相对表达量=survivin基因表达量/β-actin基因表达量。

所述等离子纳米金二聚体用于细胞内基因表达调控的方法，具体步骤为：

（1）金纳米粒子修饰穿膜肽：取100mL、2nmol/L、20nm的金纳米粒子以8000rpm的速度离心10min，并重悬在10mL 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS中得金溶胶；按金纳米粒子︰PEG︰TAT︰DNA1为1︰1000︰100︰5的摩尔浓度比同时向5mL金溶胶中加入PEG、TAT、DNA1；室温震荡24h后，8000rpm离心10min，去除上清液，沉淀重悬于纯水中，反复离心重悬3次，得到Au-TAT-DNA1复合体；

（2）金纳米粒子与调控序列的偶联：另取5mL上述金溶胶，并按金纳米粒子︰anti-DNA︰DNA2为1︰100︰5摩尔浓度比，向5mL金溶胶中加入anti-DNA和DNA2；室温震荡12h后，向溶液中加入NaCl至终浓度为80mM，继续震荡24h后，离心重悬于纯水中，得到Au-anti-DNA-DNA2复合体；

（3）双功能纳米金二聚体组装：将步骤（1）和（2）得到的Au-TAT-DNA1和Au-anti-DNA-DNA2复合体，按体积比1︰1混匀，60℃孵育20min后立即冷却至4℃，静置24h后，即可得到双功能纳米金二聚体；

（4）纳米金二聚体对细胞内基因的调控：将步骤（3）得到的纳米金二聚体8000rpm离心10min，沉淀重悬于细胞培养液中，使纳米金二聚体的终浓度为5nM；将细胞接种于24孔培养板中，使每孔中的细胞数量约为10⁴个，培养24h后去掉培养液，取7个孔分别加入上述含有纳米金二聚体的细胞培养液各300μL；每个孔分别转染0h、1h、2h、3h、4h、5h、10h后，去除培养液，用PBS反复洗涤各个孔中细胞5次，再向细胞中加入不含纳米金二聚体的新鲜培养液，继续培养48h后，收集细胞，得到不同转染时间处理的细胞悬液；

（5）细胞内基因调控的表征：用RNA提取试剂盒提取出步骤（4）各个细胞悬液中的总RNA，然后用反转录试剂盒分别把提取出的总RNA反转录成cDNA；以此作为模板DNA用荧光定量PCR法测定不同转染时间后细胞内survivin基因的表达量，同时与细胞内的内参基因β-actin进行比较，计算出其相对的表达量；相对表达量=survivin基因表达量/β-actin基因表达量。

（6）电镜表征：采用生物透射电镜对步骤（4）得到的细胞悬液进行表征。

所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示，Anti-DNA序列如SEQ ID NO.3所示，TAT多肽序列如SEQ ID NO.4所示。

表1  DNA及多肽的编号、序列及长度

以上材料均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

本发明的有益效果：本发明提供了具有细胞内基因调控的纳米金二聚体的制备方法，充分利用了纳米金二聚体的结构优势，将具有高效进入细胞能力的粒子与偶联有调控序列的粒子组装，得到了结构均一，性质稳定，在细胞内分散性较好，且具有高效的细胞内survivin基因下调作用的纳米金二聚体。

附图说明

图1纳米金二聚体在细胞中的生物透射电镜图。

图2经过不同转染时间后细胞内survivin基因的相对表达量。

具体实施方式

实施例1

所有的玻璃仪器都用王水浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2 MΩ的Milli-Q 超纯水。

（1）金纳米粒子修饰穿膜肽：取100 mL（2nmol/L） 20 nm的金纳米粒子8000 rpm离心10min，并重悬在10mL  0.01M  pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，得金溶胶。取5mL，按纳米粒子︰PEG︰TAT︰DNA1为1︰1000︰100︰5的摩尔浓度比同时向金溶胶中加入PEG、TAT、DNA1。室温震荡24h后，8000 rpm离心10min，去上清，沉淀重悬于纯水中。反复离心重悬3次，得到Au-TAT-DNA1复合体。

（2）金纳米粒子与调控序列的偶联：另取5mL上述金溶胶，并按金纳米粒子︰anti-DNA︰DNA2为1︰100︰5摩尔浓度比，向金溶胶中加入anti-DNA和DNA2。室温震荡12h后，向溶液中加入Nacl至终浓度为80mM，继续震荡24h后，离心重悬于纯水中，得到Au-anti-DNA-DNA2复合体。

（3）双功能纳米金二聚体组装：将上述得到的Au-TAT-DNA1和Au-anti-DNA-DNA2复合体，按体积比1︰1混匀，60℃孵育20min后立即冷却至4℃，静置24h后，即可得到双功能纳米金二聚体。

（4）纳米金二聚体对细胞内基因的调控：将上述得到的纳米金二聚体8000 rpm离心10min，沉淀重悬于含有10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中，使纳米金二聚体的终浓度为5nM。将海拉细胞接种于24孔培养板中，使每孔中的细胞数量约为10⁴个，培养24h后去掉培养液，取7个孔分别加入上述含有纳米金二聚体的细胞培养液各300μL。每个孔分别转染0h、1 h、2h、3 h、4h、5 h、10h后，去除培养液，用PBS反复洗涤各个孔中细胞5次。再向细胞中加入不含纳米金二聚体的新鲜培养液，继续培养48h后，收集细胞，得到不同转染时间处理的细胞悬液。

（5）细胞内基因调控的表征：用RNA提取试剂盒提取出上述各个细胞悬液中的总RNA，然后用反转录试剂盒分别把提取出的总RNA反转录成cDNA。以此作为模板DNA用荧光定量PCR法测定不同转染时间后细胞内survivin基因的表达量，同时与细胞内的内参基因β-actin进行比较，计算出其相对的表达量，相对表达量=survivin基因表达量/β-actin基因表达量。

电镜表征：分别取上述不同培养时间段的细胞悬液用戊二醛固定、锇酸固定、丙酮包埋、烘干并切片、染色。透射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为80 kV。

SEQ ID NO.1

DNA1：

TTAACGTTGA AATGTCCGTA AGAACAGGAC ATCACCAATA GCCCTTGGAT AAAAAAAAAA-SH

 

SEQ ID NO.2

DNA2

ATCCAAGGGC TATTGGTGAT GTCCTGTTCT TACGGACATT TCAACGTTAA AAAAAAAAAA-SH

 

SEQ ID NO.3

Anti-DNA

SH-TTTTTCCCAG CCTTCCAGCT CCTTG

 

SEQ ID NO.4

TAT（RNA多肽序列）

YGRKKRRQRR RC