猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用

摘要

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，涉及猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。通过采集猪外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；采用普通PCR扩增PD-L1目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；将PD-L1目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，按拷贝浓度绘制成标准曲线；根据荧光信号变化及标准曲线测出PD-L1的基因丰度。本发明的猪PD-L1基因丰度实时检测方法具有检测通量高、敏感性高、特异性强、操作简便、成本低及定量准确等优点。

说明书

技术领域

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。

背景技术

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。研究表明，CSFV主要感染单核-巨噬细胞系统，引起严重的淋巴细胞减少、血小板凝集和凝血机能障碍，以及胸腺、骨髓等中枢免疫器官的萎缩。CSFV还能通过引起机体抗病毒反应降低、抑制感染细胞的凋亡、促进未感染细胞的凋亡等途径造成机体免疫功能损伤。

程序性死亡配体（PD-L1）及其程序性死亡受体-1(PD-1)是CD28/B7超家族成员，广泛表达于各种组织。PD-1/PD-L共刺激信号视机体的炎症程度、免疫状态和遗传背景不同而激活或抑制，主要参与T细胞的中枢及外周免疫耐受。与其他CD28超家族成员相比，PD-1/PD-L信号通路发挥着更广泛和复杂的免疫调节作用，与自身免疫病、肿瘤、慢性感染及炎症密切相关。在免疫调节方面，PD-L1与其受体PD-1共同介导PD-1:PD-L信号通路的激活，在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，对抗原特异性T、B细胞的功能、T细胞的增殖、细胞因子的分泌和杀伤能力都有抑制作用，阻断该通路后可以恢复T细胞的大部分功能。经相关研究证实，一些病毒的感染可以诱导PD-L1及其受体PD-1的表达，从而影响PD-1:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系统的监视与杀伤，引起机体产生免疫抑制和持续性感染。因此，PD-L1及其受体PD-1近年来逐渐成为人们在慢性持续性病毒感染、免疫耐受性疾病、肿瘤等免疫抑制性疾病研究中所关注的热点，而在动物免疫抑制性疾病或病毒持续性感染方面，T细胞免疫抑制通路PD-1:PD-Ls的研究才刚刚起步，特别是在猪病毒性疾病方面的研究还少见报道。

近年来，实时荧光定量PCR（Real-Time PCR） 技术为基因丰度检测提供了全新的方法，和传统的方法相比，具有敏感性高、特异性强、操作简便、成本低以及定量准确被广泛应用，它可以通过检测目标序列PCR扩增的荧光信号强度达到实时监控的目的。然而对猪外周血单核细胞中PD-L1基因的丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：本发明提供了一种猪外周血单核淋巴细胞PD-L1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法；

在此基础上本发明建立了一种PD-L1基因丰度的实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；

本发明通过研究外周血单核细胞中PD-L1的变化规律，为猪PD-L1分子检测的定量分析提供了技术平台，并能用于分析猪感染病毒性疾病如CSF后PD-L1基因的转录水平的变化规律中。

本发明的技术方案：

猪外周血单核淋巴细胞PD-L1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

采集仔猪的外周血，分离出外周血单核淋巴细胞，提取外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20℃，采用普通PCR方法扩增PD-L1目的基因片段；

采用普通PCR方法扩增PD-L1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将PD-L1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；

其中普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA 聚合酶，其余为无菌三蒸水；普通PCR反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min；

其中，正向引物F为：5′- AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3′，

反向引物R为：5′- CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3′。

所述目的基因片段为SEQ ID No.1；所述普通PCR扩增时的反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。

一种猪外周血单核淋巴细胞PD-L1基因的丰度实时检测方法，包括以下步骤：

（1）将回收纯化的PD- L1目的基因片段与pMD 18-T载体连接，然后转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与PD- L1目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，测定标准品质粒的DNA浓度，并换算成质粒的拷贝浓度，按1:10倍的浓度梯度稀释阳性质粒；

（2）以稀释的阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，反应结束后绘制出标准曲线，然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出样品DNA中PD-L1的基因丰度；

其中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20μL，包括2μL质粒模板，浓度为20μmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2μL，SYBR Green I PreMix 10μL，三蒸水7.6 μL；

其中，正向引物F为：5′- AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3′，

反向引物R为：5′- CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3′。

所述目的基因片段为SEQ ID No.1。

所述荧光定量 PCR扩增的反应程序为：95℃热启动 30s；94℃变性5s；60℃退火和延伸34s，60℃时收集荧光信号，再40个循环。

所述稀释的阳性质粒浓度范围为浓度范围为9.66×10¹⁰-9.66×10¹copies/μL；所述标准曲线为Y=-3.266X＋22.794。

所述的检测方法在分析猪感染病毒性疾病后PD-L1基因的转录水平变化规律中的应用。

本发明的积极有益效果：

本发明通过合成正向引物、反向引物和PD-L1目的基因片段，建立了猪外周血单核细胞中PD-L1基因丰度的实时荧光定量PCR的方法，为更好的对猪病毒性疾病中PD-L1的转录水平进行准确定量，进而研究外周血单核细胞中PD-L1的变化规律，为猪PD-L1分子检测的定量分析提供了技术平台，并为PD-L1在猪病毒性疾病中发挥的生物学功能及其应用机制奠定基础。

本发明的技术方案与传统技术相比，敏感性较高，利用所建立的方法对10⁹～10^{1>copies/μL的9组不同浓度标准阳性质粒进行检测，结果显示：本发明中PD-L1的检测下限为10 copies/μL，其浓度与C_t值之间有较好的线性关系，相关系数R2=0.998；利用建立的方法进行重复性试验，组内和组间重复性试验结果表明，变异系数均在3%以内，具有较好的重复性；从溶解曲线图可知，PD-L1分子溶解曲线出现单一狭窄峰（图4），且琼脂糖凝胶电泳分析表明，Real-time>}

本发明通过实验证实，猪感染CSFV后，随着病毒在机体内复制PD-L1的表达量逐渐升高，说明CSFV的感染及病毒载量与猪PD-L1基因丰度的变化关系十分密切；并证实了猪感染CSFV后PD-L1表达变化与IL-2和IL-10细胞因子的表达变化之间存在一定关系，猪PD-L1表达升高后激活了PD-L1：PD-Ls信号通路，引起了猪T细胞免疫功能下降，导致感染猪免疫功能降低。

本发明的猪PD-L1基因实时荧光定量PCR检测方法，为检测猪病毒性疾病如CSF（猪瘟）所导致的免疫功能损伤中PD-L1的表达变化规律提供了技术平台，从而进一步丰富了猪瘟引起免疫功能损伤的机理。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶检测猪PD-L1基因扩增结果；

图2为猪PD-L1实时荧光定量分析扩增曲线；

图3为猪PD-L1实时荧光定量分析标准曲线；

图4为猪PD-L1实时荧光定量分析标准品溶解曲线；

图5为猪PD- L1实时荧光定量产物特异性分析结果；

图6为猪感染CSFV不同时期外周血单核细胞中PD-L1基因的拷贝数；

图7为猪感染CSFV不同时期血浆中CSFV病毒载量检测结果；

图8为猪感染CSFV不同时期IL-2基因的拷贝数；

图9为猪感染CSFV不同时期IL-10基因的拷贝数。

具体实施方式

在本发明中，基因拷贝数、基因丰度代表同样的概念；Real-time PCR、实时荧光定量PCR表示同样的概念；ddH₂O表示双蒸水；CSF表示猪瘟；CSFV表示猪瘟病毒，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein>

实施例中的实验动物和菌种：30日龄健康仔猪，隔离器中饲养；石门株CSFV由中国兽医药品检查所提供，半数感染量为10⁵×TCID₅₀；大肠杆菌感受态细胞DH5α，为本实验室保存。

主要试剂和仪器：淋巴细胞分离液，购自天津灏阳生物制品科技有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒、pMD 18-T载体，均购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Green I，购自Invitrogen公司。

实施例1>猪PD-L1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建

采集45日龄仔猪的外周血，参照淋巴细胞分离液的说明书分离外周血的淋巴细胞，参照Invitrogen公司TRIzol试剂盒说明书和相关文献进行总RNA的提取。提取的总RNA参照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，保存于-20℃备用，用于扩增PD-L1目的基因片段的模板。

采用普通PCR方法扩增PD-L1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将PD-L1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；

所述目的基因片段为序列SEQ ID No.1：

AATGGCGAGGAAGACCTGAATGTTCAGCACAGTAGCTACAGCCAGAGGGCCCAGCTGTTGAAGGACCAGCTCTTCTTGGGAAAGGCCTCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAAGATGCAGGGGTTTACTGCTG。

用以构建PD-L1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的普通PCR反应体系：

普通PCR反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品DNA模板，阴性对照以无菌三蒸水为模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，正、反向引物各0.5μL（20μmol/L），0.5μL TaqDNA 聚合酶（大连宝生物工程公司），其余体积以无菌三蒸水补足；将反应体系轻柔混合，于普通PCR仪进行扩增反应。

普通PCR程序为：95℃热启动 1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。

其中猪PD-L1实时荧光定量PCR引物由某生物公司合成，引物序列如下：

正向引物F为：5′- AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3′，

反向引物R为：5′- CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3′。

将普通PCR产物进行2%琼脂糖电泳分析，电压100V，35min后在紫外灯下观察产物，结果显示扩增出单一条带，片段大小在137bp左右。

扩增结果见附图1，图中M为DL2000分子量标准，1为PD-L1基因的扩增产物，扩增条带较清晰，无引物二聚体影响。扩增序列经克隆、测序后，在GenBank中进行核酸同源性的比对，结果显示，获得的序列SEQ ID No.1与GenBank中猪PD-L1基因（NM_001025221.1）的序列同源性为100%，说明引物及扩增产物都正确，可用于下一步实验研究。将特异性片段进行琼脂糖凝胶回收后，进行克隆转化，将获得的阳性克隆交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析。

实施例2：猪PD-L1实时荧光定量PCR体系的建立

（1）质粒DNA模板的制备

采用普通PCR扩增方法扩增PD-L1目的基因片段，将目的基因片段经2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化，与pMD 18-T载体（TaKaRa，大连）连接后转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，测序结果显示与GenBank 中猪PD-L1基因的序列100%同源，说明所获得序列正确，阳性质粒可用于质粒标准品的制作。使用微量核酸蛋白分光光度仪测定该标准品质粒DNA浓度为300μg/mL，将初始标准品质粒溶液进行1:10倍的倍比稀释。

（2）标准质粒浓度计算和PD-L1标准曲线的制作

提取经过测序验证的阳性克隆质粒，将质粒的DNA浓度换算成拷贝数。质粒拷贝数的计算方法为：拷贝数(copies/μL)=浓度(μg/μL)×6.02×10²³(copies/μL)／MW（g/mol）。

其中MW=（克隆载体长度+目的片段长度）（bp））×660 g/mol/ bp。

已知：cDNA=300 μg/mL，质粒PMD18-T序列长度为2692bp，PD-L1基因插入片段长度为137bp；单个碱基的平均摩尔质量为660 g/mol，计算公式为：

分子量（MW）=（2692+137）×660=1.87×10^6>g/mol。

质粒拷贝浓度：6.02×10²³×（300×10^-9）÷（1.87×10⁶）=9.66×10¹⁰>

将上述已知拷贝浓度的质粒溶液作为标准质粒，在进行Real-time PCR标准曲线绘制时按10倍梯度稀释（浓度范围为9.66×10¹⁰-9.66×10¹copies/μL）。

将已知拷贝数的质粒进行1:10倍梯度稀释，获得质粒标准品。

以稀释好的质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应采用Real-time PCR 试剂盒SYBR PremixExTaqTM（Invitrogen公司），反应体系为20μL：2μL标准质粒模板，F、R引物（20μmol/L）各0.2μL，SYBR Green I PreMix 10μL，三蒸水7.6 μL。每次Real-time PCR反应中均设置阴性对照（模板为2μLddH₂O），Real-time>

标准曲线及所有待测样品均设置3个平行反应。反应在ABI 7500定量PCR仪（美国Life Technologies）中进行，利用ABI 7500软件检测和收集荧光信号，并进行数据分析。

ABI 7500软件实时荧光定量分析软件自行绘制出反应的扩增曲线（见附图2）。扩增曲线显示从左至右6条曲线依次代表标准品10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²的梯度稀释液的扩增曲线，6个质粒标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型，且各循环阈值（Ct值）间隔均匀。

根据扩增曲线提供的标准品各浓度梯度及反应的循环阈值（Ct值），ABI 7500软件自行绘制出反应的标准曲线（见附图3）。该标准曲线的相关系数R²=0.998，斜率为-3.266，标准曲线为Y=-3.266X＋22.794，其中Y为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X为PD-L1基因构建的标准质粒拷贝数对数值。计算其扩增效率Eff%=102.392%，符合ABI>

测定各浓度稀释梯度的标准品在实时荧光定量PCR过程中的溶解温度，并绘制溶解曲线（见附图4）。标准品及样品的溶解曲线型峰单一，且标准品溶解温度相同（83.5±0.5℃），表明扩增反应产物溶解温度均一，特异性好，且无引物二聚体。

根据荧光信号的变化及标准曲线即可测出样品DNA中PD-L1的基因丰度。

实施例3：猪PD-L1实时荧光定量PCR体系的敏感性、特异性及重复性分析

采用实施例1所构建的猪PD-L1重组质粒作为阳性重组标准质粒；采用实施例2所建立的猪PD-L1实时荧光定量PCR检测体系；实时荧光定量PCR仪采用Life Technologies公司（美国）生产的ABI 7500荧光定量PCR仪进行。

用10 倍系列稀释的10¹～10⁹ copies/μL猪PD-L1阳性重组标准质粒做敏感性试验，结果表明，PD-L1的检测下限为10>

对猪PD-L1分子Real-time -PCR溶解曲线（见附图4）及产物琼脂糖凝胶电泳做特异性分析，结果表明，溶解曲线出现单一狭窄峰，能够扩增到与预期目的片段同样大小的特异性片段，没有生成非特异性产物和引物二聚体（见附图5）。

用建立的方法分别进行批内和批间重复性检测，结果显示，批内和批间的变异系数小于3%，重复性良好（见表1）。

表1 猪PD-L1实时荧光定量PCR方法批内与批间重复性评价结果

实施例4：利用本发明建立的实时荧光定量PCR方法，分析猪在病毒性疾病感染后外周血单核淋巴细胞中PD-L1基因丰度的变化规律。

采用实施例2建立的猪PD-L1实时荧光定量PCR体系；实时荧光定量PCR仪采用Life Technologies公司（美国）生产的ABI 7500荧光定量PCR仪。

将15头30日龄的健康仔猪饲养至45日龄，用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测，确定CSFV抗体为阴性，随机分为对照组（5头）和实验组（10头）。实验组和对照组隔离饲养，其中实验组通过颈部肌肉注射CSFV稀释液0.1 mL/头；对照组用灭菌PBS作相同处理。

分别于CSFV感染45日龄仔猪后的第0、3、7、10、14和21天采外周静脉血，并以未感染CSFV的同日龄仔猪为对照，同时分离感染组与对照组外周血单核淋巴细胞，并提取总RNA，利用反转录试剂盒（大连宝生物）反转录合成cDNA，利用实施例1提供的特异性引物，采用实施例2建立的实时荧光定量PCR体系进行检测，根据标准曲线计算即可获得感染组和对照组外周血单核淋巴细胞中PD-L1基因拷贝数（即基因丰度），见附图6。

结果显示，与未感染CSFV健康仔猪相比，在CSFV感染后的不同时期，因为机体的免疫状态不同，各期PD-L1基因的丰度不同，在感染后第3~10天与对照组相比显著（P＜0.05）升高，其中第3天升高显著（P＜0.05）；第7天持续升高，与对照组相比极显著（P＜0.01），第10天开始下降，但与对照组相比仍显著（P＜0.05），之后继续降低，且没有统计学意义。由此可见，猪PD-L1基因的丰度和猪瘟病程具有较大的关联。

实施例5：猪瘟病毒（CSFV）感染猪后PD-L1表达变化与血浆中病毒载量之间的关系

CSFV载量实时荧光定量PCR引物及探针由某生物公司合成，引物及探针序列如下：

正向引物F：5’-CCCTGAAGTGGATTAGAA-3’，

反向引物R：5’-TACCCTTGTTGATCCTATC-3’,

TaqMan probe: 5’-(FAM) TTCACCGACTGTCCATTGTGG (Eclipse)-3’

分别于CSFV感染45日龄仔猪后的第0、3、7、10、14和21天采取外周血，提取外周血中CSFV的总RNA，利用反转录试剂盒（大连宝生物）反转录合成cDNA。反转录反应体系为：2 μL 5×PrimeScript Buffer, 0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I, 0.5 μL Oligo dT 引物, 0.5 μL Random 6 mers, 1 μg 总RNA 和 RNase Free dH2O。反转录反应条件为：37℃反应15分钟，85℃ 5秒，合成 cDNA置于-20℃保存备用。实时荧光定量PCR检测CSFV的载量，试剂为premix Ex Taq (probe qPCR)（大连宝生物），在ABI 7500仪器进行，实时荧光定量PCR反应体系为20μL体系：10 μL Premix Ex Taq, 0.4 μL CSFV正向引物 (10 μmol/L), 0.4 μL 反向引物 (10 μmol/L), 0.8 μL TaqMan 探针 (10 μmol/L), 0.4 μL ROX Preference Dye, 2 μL 模板DNA 和 6 μL 三蒸水。反应体系为：95℃热启动10秒，45个循环：95℃变性15秒，56℃退火和延伸45秒。根据标准曲线计算血浆中CSFV的载量。

结果表明，在CSFV感染后第3天病毒载量开始升高，第7天达到峰值，之后逐渐降低（见附图7）。

结合实施例4结果可以看出，随着病毒在机体内的复制，PD-L1的表达量逐渐升高，说明CSFV的感染及病毒载量与猪PD-L1基因丰度的变化关系十分密切。

实施例6：猪CSFV感染后PD-L1表达变化与IL-2、IL-10细胞因子表达变化之间的关系

采用实施例2建立的猪PD-L1实时荧光定量PCR体系，采用实施例4的CSFV感染45日龄仔猪后第0、3、7、10、14和21天的外周血，以其外周血单核淋巴细胞的总RNA反转录cDNA的产物为模板，对CSFV感染后第第0、3、7、10、14和21天的猪细胞因子IL-2、IL-10的表达变化进行检测。

实时荧光定量PCR仪采用Life Technologies公司（美国）生产的ABI 7500荧光定量PCR仪进行。

结果表明，IL-2 mRNA表达水平在CSFV感染第7天表达水平降低（P<0.05），当PD-L1表达增高时（第7天），IL-10表达水平升高且变化极显著（P<0.01），见附图8。

CSFV感染后，PD-L1表达量升高，激活PD-L1：PD-Ls信号通路，导致IL-2表达的降低（第7天），见附图9。于此同时，IL-10的表达量升高（第7天），说明在CSFV感染后，IL-10的表达影响了PD-L1的表达。而IL-10是一种免疫抑制性细胞因子，所以CSFV感染后，猪PD-L1表达的升高，激活了PD-1：PD-Ls信号通路，以及IL-2的降低和IL-10的升高，使机体处在免疫抑制的状态。

SEQUENCE LISTING

<110>新乡学院

<120>猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其

应用

<130>分子病理学与免疫学研究

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>137

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aatggcgagg aagacctgaa tgttcagcac agtagctaca gccagagggc ccagctgttg 60

aaggaccagc tcttcttggg aaaggcctca cttcagatca cagatgtgaa attgcaagat120

gcaggggttt actgctg 137

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aatggcgagg aagacctgaa 20

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cagcagtaaa cccctgcatc t 21

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccctgaagtg gattagaa 18

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ttcaccgact gtccattgtg g 21

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