水中病毒分离提取装置及水中札幌病毒的提取方法

摘要

水中病毒分离提取装置及水中札幌病毒的提取方法，属于水中病毒提取领域。本发明解决现有微生物过滤器存在容易漏气的技术问题，并提供了一种提取效率高、提取产物干扰少、提取产物适用于多种检测平台的水中札幌病毒提取方法。该装置存储罐设有穹顶，穹顶设有弧形缩口，顶盖底端设有外翻沿，顶盖由弧形缩口伸入并可通过密封圈卡在弧形缩口内，顶盖顶端对称设有耳座，耳座内装有杠杆，出水管穿过穹顶伸入到存储罐底部，进气管与氮气压力罐连接，出水管与过滤器连接，过滤器与滤膜支架连接。方法：水样过滤，用牛肉浸提物溶液洗脱，再等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取核酸；即完成了札幌病毒的提取。本发明用于分离提取水中病毒。

说明书

技术领域

本发明属于水中病毒提取领域；具体涉及水中病毒分离提取装置及利用 该装置提取水中札幌病毒的方法。

背景技术

水中的病毒对人体健康的风险日益受到关注,对环境水体中病毒的检测 是预防疾病、评估水源卫生质量、环境卫生状况的一项有价值的工作。

现有水中微生物过滤器的内胆与上盖的重合性不好，随压力增大，上盖 的密闭性降低，容易漏气。

病毒引起的胃肠疾病对人类有着极大的危害。札幌病毒(Sapovirus/SaV) 是引起急性腹泻的常见病毒，该病毒于1977年日本札幌地区肠道疾病暴发流 行过程中被发现，SaV属于杯状病毒家族，由单链RNA构成无衣壳结构， 在环境中可以稳定存在，能够引起人胃肠疾病,其拥有极低的感染剂量，在感 染后又具有极高的释放量(达到每克粪便样本10¹¹个病毒颗粒)。

目前，已有报道的病毒的传播途径包括被污染的食物、水、人与人接触和 呕吐气浊物接触。相对于细菌来说，病毒更加难以灭活和消除。这些病毒通常 能够在各种水样中被监测到，如：污水，河水，地下水，海水甚至饮用水。由 这些水体中检测病毒的存在与否，关键环节在于如何由水中将病毒分离提取出 来。由于水中病毒的含量相对较低，且病毒颗粒较小，难以利用离心、过滤等 分离细菌的常规富集方法收集。由于设备和提取方法的限制，水体中病毒的提 取和检出费时费力。

发明内容

本发明要解决现有微生物过滤器存在容易漏气的技术问题；而提供一种 密封性好、过滤水中病毒效果好，易于拆卸组装，易于多次重复灭菌使用的 的水中病毒分离提取装置。

为解决上述技术问题，本发明的水中病毒分离提取装置包括氮气压力罐、 存储罐、过滤器和滤膜支架，所述的存储罐包括罐体和顶盖，罐体设有穹顶， 穹顶设有弧形缩口，顶盖底端设有外翻沿，密封圈置于外翻沿内，顶盖由弧 形缩口伸入并可通过密封圈卡在弧形缩口内，顶盖顶端对称设有耳座，耳座 内装有杠杆，杠杆包括一个“n”字形的提杆、两个弧形的连接杆及两个横折形 的支撑杆，所述提杆两端与连接杆通过过渡圆弧连接，连接杆的另一端与支 撑杆圆弧过渡连接，杠杆的支撑杆套在耳座内，支撑杆的底端可抵在穹顶上， 过渡圆弧可抵在穹顶上，穹顶上分别设有压力表、进气管和出水管，存储罐 的进气管与氮气压力罐连接，出水管底端穿过穹顶伸入到罐体底部，出水管 顶端设有控制阀，控制阀与过滤器通过两端连接快速接头的导管连接，过滤 器与滤膜支架通过两端连接快速接头的导管连接，滤膜支架设有放水管；所 述滤膜支架内设有正电荷滤膜。

出水管底端面与存储罐底部的距离为0.1～0.2mm，使分离水中病毒的效 果好，分离的彻底。

密封圈的截面为圆形或椭圆形，使密闭性更好。

本发明中顶盖通过杠杆将其由内向外卡在穹顶上，易于安装拆卸，并且 随着存储罐压力变大，顶盖与存储罐结合更加紧密，因此，密闭性就更好， 不易产生泄漏气体的现象。

本发明采用的过滤器通过快速接头与导管连接，可以根据不同水质需要 组合滤芯种类和滤器数量，降低水样水中杂质含量，降低滤膜因杂质干扰带 来的损耗影响。

存储罐即可采用消毒液浸泡灭菌也可采用高温高压灭菌，或采用两种方 法相结合灭菌，可以彻底消除二次污染对分子诊断学检测带来的影响。

本发明的装置结构简单，构思巧妙。

另外，本发明又提供了一种提取效率高、提取产物干扰少、提取产物适 用于多种检测平台的水中札幌病毒提取方法。

水中札幌病毒提取方法中利用上述的装置进行过滤、洗脱，具体提取方 法是按下述步骤进行的：

步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖，通入氮气，存储罐内的压力 上升至0.7个标准大气压，打开控制阀，使水样通过过滤器流向滤膜支架， 待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐，使 罐体泄压，更换新的存储罐；

步骤二、将pH值为9.5～9.75的牛肉浸提物溶液加入更换后的存储罐内， 通入氮气，存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀，使牛肉 浸提物溶液流向滤膜支架进行洗脱，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后 停止进样，通过放水管收集洗脱液，关闭氮气存储罐，使罐体泄压；

步骤三、然后进行等电点沉降法处理后离心，重溶后二次浓缩，再提取 核酸；即完成了札幌病毒的提取。

步骤三所述的等电点沉降法是按下述步骤进行的：利用1.2mol/L HCl 调节洗脱液的pH值至4.0，然后加入获得洗脱液0.1％(V/V)的0.5mol/L FeCl₃(约1.8mL)，用1.2mol/LHCl调节pH值至3.5。

步骤三在4℃条件下3000×g离心力作用下离心15min。

步骤三所述重溶具体操作：在生物安全柜中，小心弃上清，过程中不要 悬浮沉淀；然后用10mLPBS小心溶解沉淀，转移至50mL离心管中；再加入带 有抗生素的1×MEM至终体积30mL，0.22μM滤器过滤溶液，-70℃保藏备用。

步骤三中二次浓缩是按下述步骤进行的：(一)配制5％牛肉浸提物溶 液：取1.5克牛肉浸提物粉、0.375克甘氨酸、溶解于100mL无菌水中，121℃ 15min高压灭菌；(二)向Centricon Plus-70离心杯式滤器加入70mL去离子 水，以2000g的离心力离心5min，弃滤液；(三)倒置离心杯式滤器连接收 集管，以800g的离心力离心2min；(四)取30mL1.5％牛肉浸提物溶液加 入离心杯式滤器后，以2000g的离心力离心30min，弃滤液；(五)将第一次 过滤后获得的30mL病毒储液加入离心杯式滤器中，以2000g的离心力离心 45min，弃滤液；(六)倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离 心2min；(七)将收集管中离心产物转移至螺口管中，-70℃保藏备用。

步骤三种利用核酸提取试剂盒Promega MagaZorb Total RNA Mini-Prep  Kit提取札幌病毒核酸。该试剂盒利用磁珠吸附核酸、纯化、洗脱获得核酸 提取物，相对于目前RNA提取常用的TRIzol法和膜吸附试剂盒具有提取效 率高、不含有乙醇等影响后期PCR检出的组分、后期核酸检出效率高的优点。

本发明中水样的清洁程度决定过滤过程所需要的时间，一般情况下清洁 水源需要10min左右，杂质较多的水过滤需要2小时或更长时间。

本发明方法的优点是：病毒提取效率高，在提取过程中，通过利用初滤 除杂、膜吸附、蛋白洗脱、等电点沉降、离心重溶、磁珠试剂盒提取等步骤， 降低了提取产物中干扰组分的含量，使得通过本发明获得的样本提取物能够 适用于多种检测平台。

附图说明

图1是本发明结构的示意图(顶盖处于闭合状态)；图2是顶盖的结构示 意图；图3是顶盖与存储罐连接示意图(顶盖处于闭合状态)；图1-3中1—— 氮气压力罐，2——存储罐，3——过滤器，4——滤膜支架，5——放水管，6—— 压力表，7——顶盖，8——进气管，9——出水管，10——存储罐，11——穹 顶，12——弧形缩口，13——密封圈，14——外翻沿,15——耳座，16——杠 杆，161——提杆，162——连接杆，163——支撑杆，164——过渡圆弧，17—— 控制阀；图4是SYBRGreen试剂检验水中病毒提取样本扩增曲线；图5是 SYBRGreen试剂扩增熔解曲线；图6是TaqMan试剂检验水中病毒提取样本 扩增曲线。

具体实施方式

具体实施方式一、结合图1、2和3进行说明，本发明的水中病毒分离提 取装置包括氮气压力罐1、存储罐2、过滤器3和滤膜支架4，所述的存储罐 2包括罐体10和顶盖7，罐体10设有穹顶11，穹顶11设有弧形缩口12，顶 盖7底端设有外翻沿14，密封圈13置于外翻沿14内，顶盖7由弧形缩口12 伸入并可通过密封圈13卡在弧形缩口12内，顶盖7顶端对称设有耳座15， 耳座15内装有杠杆16，杠杆16包括一个“n”字形的提杆161、两个弧形的连 接杆162及两个横折形的支撑杆163，所述提杆161两端与连接杆162通过 过渡圆弧164连接，连接杆162的另一端与支撑杆163圆弧过渡连接,杠杆16 的支撑杆163套在耳座15内，支撑杆163的底端可抵在穹顶11上，过渡圆 弧164可抵在穹顶11上，穹顶11上分别设有压力表6、进气管8和出水管9， 存储罐2的进气管8与氮气压力罐1连接，出水管9底端穿过穹顶11伸入到 罐体10底部，出水管9顶端设有控制阀17，控制阀17与过滤器3通过两端 连接快速接头的导管连接，过滤器3与滤膜支架4通过两端连接快速接头的 导管连接，滤膜支架4设有放水管5；所述滤膜支架4内设有正电荷滤膜； 出水管9底端面与存储罐10底部的距离为0.1mm，密封圈13的截面为圆形。

具体实施方式二、结合图1、2和3进行说明，本实施方式与具体实施方 式一不同的是：出水管9底端面与存储罐10底部的距离为0.2mm。其它结 构与连接方式与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：结合图1、2和3进行说明，本实施方式与具体实施方 式一不同的是：所述的正电荷滤膜为NanoCeram正电荷滤膜。其它结构与连 接方式与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式采用具体实施方式三中的装置进行过滤、 洗脱，具体提取方法是按下述步骤进行的：

步骤一、将水样装入存储罐2中，闭合顶盖，通入氮气，存储罐2内的 压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀，使水样通过过滤器流向滤膜支 架，待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐， 使罐体泄压，更换新的存储罐；

步骤二、将pH值为9.5～9.75的牛肉浸提物溶液加入更换后的存储罐内， 通入氮气，存储罐2内的压力上升至0.7个标准大气压，打开控制阀，使牛 肉浸提物溶液流向滤膜支架进行洗脱，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜 后停止进样，通过放水管收集洗脱液，关闭氮气存储罐，使罐体泄压；

步骤三、然后进行等电点沉降法处理后在4℃条件下3000g离心力离心 15分钟，重溶后二次浓缩，再用核酸提取试剂盒Promega MagaZorb Total RNA  Mini-Prep Kit提取札幌病毒核酸提取核酸；即完成了札幌病毒的提取。

步骤三所述的等电点沉降法是按下述步骤进行的：在生物安全柜中，小 心弃上清，过程中不要悬浮沉淀；然后用10mLPBS小心溶解沉淀，转移至50mL 离心管中；再加入带有抗生素的1×MEM至终体积30mL。

步骤三中重溶具体操作：在生物安全柜中，小心弃上清，过程中不要悬 浮沉淀；然后用10mLPBS小心溶解沉淀，转移至50mL离心管中；再加入带有 抗生素的1×MEM至终体积30mL，0.22μM滤器过滤溶液，-70℃保藏备用。

步骤三中二次浓缩是按下述步骤进行的：(一)配制5％牛肉浸提物溶 液：取1.5克牛肉浸提物粉、0.375克甘氨酸、溶解于100mL无菌水中，121℃ 15min高压灭菌；(二)向Centricon Plus-70离心杯式滤器加入70mL去离子 水，以2000g的离心力离心5min，弃滤液；(三)倒置离心杯式滤器连接收 集管，以800g的离心力离心2min；(四)取30mL1.5％牛肉浸提物溶液加 入离心杯式滤器后，以2000g的离心力离心30min，弃滤液；(五)将第一次 过滤后获得的30mL病毒储液加入离心杯式滤器中，以2000g的离心力离心 45min，弃滤液；(六)倒置离心杯式滤器连接收集管，以800g的离心力离 心2min；(七)将收集管中离心产物转移至螺口管中，-70℃保藏备用。

水中病毒提取过程中，本发明利用自行设计的水体病毒分离提取系统实 施提取，通过阳性滤膜过滤，经过调整电荷洗脱，蛋白沉降包裹及复溶后， 通过RNA提取反转录后获得的cDNA能够应用荧光定量PCR体系检测出阳 性结果。

为对比SYBRGreen染料法与Taqman探针法PCR扩增结果，将两种检测方 法PCR产物进行凝胶电泳检验。检测结果见图4。

本发明能够高效富集水中病毒的设备，利用该设备结合发明中病毒分离 提取方法，应用SYBRGreen染料法和TaqMan探针法两种荧光定量PCR方 法进行检测，都能够成功检出札幌病毒。

由图5可知，在应用SYBRGreen染料法时，融解曲线中74℃左右处有 一个非特异扩增峰，可能由于存在少量引物二聚体干扰，但并不影响阳性检 出结果；

由图6可知，在利用TaqMan探针法进行检测时，检出结果与染料法基 本一致，能够检出水中札幌病毒。

利用荧光定量PCR进行定量及定性检测时，由于不同厂家提供的材料存 在差异，不同反应体系对荧光定量PCR扩增结果有直接影响，在本发明中， 通过本发明提供的分离提取装置和提取方法进行提取时，不同厂商的 SYBRGreen染料试剂和TaqMan探针试剂基本能够在反应中得到相近的结 果，因此本发明适用于多种检测平台。