一株内生真菌及其生物转化甘草酸为甘草次苷的方法

摘要

本发明涉及一株内生真菌及其生物转化甘草酸为甘草次苷的方法，该菌命名为DX-SES3，鉴定为Microsphaeropsisarundinis，并已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2014177。该菌能在甘草酸的诱导下产生β-葡萄糖醛酸苷酶，进而催化甘草酸生产GAMG；所产生的GAMG富聚在菌体的表面，75%的乙醇冲洗菌体，减压浓缩喷雾干燥后获得GAMG粗制品，HPLC检测纯度为89.4%。本发明采用生物转化方法，不仅甘草酸的转化率高，绿色环保无污染，而且GAMG富聚于菌体表面，产物分离纯化简单易行。

说明书

技术领域

    本发明涉及生物转化技术领域及产物分离工艺，主要涉及一株能将甘草酸单一、定向的转化为甘草次苷（GAMG）的东乡野生稻内生真菌及GAMG分离纯化制备方法。

技术背景

   甘草酸（GL）是甘草中的主要活性成分之一，是甘草中含量最高的三萜类化合物，结构如图1所示，是由五环三萜皂苷通过糖苷键连接两个葡萄糖醛酸构成的。现代药理学研究表明，甘草酸具有抗炎症、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤等药理作用，还是一种高甜度、低热量的新型甜味剂，具有一定的应用价值。

    甘草酸经β-葡萄糖醛酸苷酶水解去除其末端的一个葡萄糖醛酸基就生成GAMG（如图1），是甘草酸的一个重要的衍生物。甘草次苷又叫单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），其应用价值远大于甘草酸。首先，在食品中应用方面，GAMC的甜度约为蔗糖甜度的941倍，是甘草酸甜度的5倍多，GAMG不仅有较强的持续性甜味，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂，而且可有效减少因高热量甜味剂的摄入引发的肥胖、糖尿病、高血脂症、龋齿等疾病；其次，在药物方面的应用，GAMG和甘草酸具有相类似的药理作用，但甘草次苷中等极性，在体内溶解度较好的和较易跨膜转运，比甘草酸生物利用度更好，其生物利用度优于甘草酸类药物及甘草次酸类药物，具有显著的新药物开发价值，如在对TPA诱导的Epstein-Barr病毒早期抗原形成的抑制率显示，GAMG的抑制率达到了100%，而甘草酸的抑制率只有84.4%，许多研究表明了抗肿瘤、抗病毒、抗炎症等方面有良好的功效，并证实其多种的药理活性不亚于甘草酸，最重要的一点是甘草次苷比甘草酸更安全，甘草次苷的LD50为5000 mg/kg，而甘草酸的LD50 为805 mg/kg；最后，GAMG在化妆品中也有重要的应用，GAMG可使油性香水或荷尔蒙增溶，可用于透明化妆品中，不会产生泡沫，也可用于面霜或乳液中，配制成稳定的水包油乳液等。因此生产和开发GAMG具有很重要的应用价值和现实意义。

GAMG的获取途径比较少，主要途径有以下几条：一是化学合成法合成GAMG，Brieskorn等和Mizutani等首次合成了GAMG，但合成路线长，收率很低。二是传统的化学水解法，通过水解去掉甘草酸的葡萄糖醛酸基生成甘草次苷，但此法对甘草酸的两个糖苷键选择性低，不能定向水解生成甘草次苷，副产物多，得率较低，同时存在高耗能，高污染的缺点。三是利用微生物所产生的β-D-葡萄糖醛酸酶水解甘草酸而制备得到的，这也是目前GAMG的主要获得途径，而其β-D-葡萄糖醛酸酶用量过大，来源不方便也不经济，并且产物较难分离纯化。此外，根据欧盟和美国的立法，通过化学方法获得的产品不是天然物质，应用于食品领域受到限制，而利用酶法或微生物法（即生物转化法）得到的物质，被认为是天然物质。生物转化是指利用微生物、动植物和培养体系或其产生的酶对外源化合物进行结构修饰的生物化学反应过程，其本质是利用生物体系产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。利用生物转化甘草酸生成GAMG已有报道过，其不仅具有专一性高、效率高的优点，而且方法简单、便于分离，是今后获得GAMG的理想途径。

本发明人从国家二级保护植物禾本科植物东乡野生稻健康的组织中分离并筛选到能将甘草酸单一定向的转化为GAMG的内生真菌——菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)。该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014177。该菌能在甘草酸的诱导下，能将甘草酸定向转化为GAMG，且转化率较高，特别指出的是，合成的GAMG富积在菌球的表面，极大的利于后续GAMG的分离纯化工作，这为利用该菌株生物转化生成制备GAMG提供了新的研究思路。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有定向转化甘草酸为GAMG的东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)。本发明不仅克服了现有工艺技术中催化定向性差，污染环境，高耗能，转化率低等不足的缺点，而且还避免了GAMG分离纯化的复杂工序。

本发明中转化甘草酸为GAMG的内生真菌菌株，命名为DX-SES3，分类为小球壳孢属菌Microsphaeropsi sarundinis，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年5月3日，保藏号为CCTCC M 2014177。

本发明所述的东乡内生真菌菌株DX-SES3的形态特征为：在PDA上28℃培养5-7 d，5天菌落直径为20 mm，7天菌落直径为30-35 mm，7天菌落直径无变化；质地絮状，中部突起，表面灰白色，中间色深，边缘色浅，老后颜色加深，无渗透液，无可溶性色素，菌落反面为黑色；菌丝细长弯曲，呈黑色或灰黑色；分身孢子较少，为蛹虫状（如图2）。

本发明所述的东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis) 基因登录号为KC871028。

本发明所述的东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成甘草次苷包括以下步骤：

步骤一、将东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)，接种到PDA斜面培养基中培养活化72～84小时，并制作孢子悬浮液，然后接种至种子培养基中，28±1℃，150～300 r/min，摇床培养至对数生长期。

步骤二、按照质量分数10%～30％的接种量把上述对数生长期的种子液接种至含甘草酸的转化培养基中，转化产生甘草次苷至含量基本恒定。

步骤三、冲洗菌球表面的GAMG，并分离纯化GAMG。

优选的是，所述的DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成GAMG，步骤一中种子培养基的组成为：每升培养基中含葡萄糖10～40g，甘草酸（或甘草酸铵盐）0.1～1 g，KH₂PO₄1.0～3.0 g， NH₄NO₃ 2.0～5.0 g， NaCl 0.3～0.8 g，酵母粉0.05～0.3 g， MgSO₄0.1～0.5 g， CaCl₂0.01～0.5 g， FeSO₄ 0.014 g ，ZnSO₄·7H₂O 2.9 mg，MnCl₂·4H₂O 2.0 mg， CuSO₄·5H₂O 0.25 mg，CoCl₂·6H₂O 0.24 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24 mg， H₃BO₃ 0.03 mg， 其余为纯水，调pH为5.0～7.0。

优选的是，所述的DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成GAMG，在步骤二中转化培养基组成为：每升培养基中含甘草酸（或甘草酸铵盐） 2～30 g， KH₂PO₄ 1.0～3.0 g， NH₄NO₃ 2.0～4.0 g， NaCl 0.3～0.8 g，酵母粉0.05～0.1 g， MgSO₄  0.1～0.5 g， CaCl₂  0.01～0.5 g， FeSO₄ 0.014 g ， ZnSO₄·7H₂O 2.9 mg， MnCl₂·4H₂O 2.0 mg，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg， CoCl₂·6H₂O 0.24 mg， Na₂MoO₄·2H₂O 0.24 mg， H₃BO₃ 0.03 mg，其余为纯水，调pH为3.5～9.0。其中甘草酸（或甘草酸铵盐）是菌体产β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导剂。

优选的是，所述的DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成GAMG，在步骤二中培养条件为：28℃～60℃，转速150～300 r/min，。

优选的是，所述的DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成GAMG，在步骤三中甘草次苷的分离纯化包含以下步骤：

布氏漏斗抽滤或六层纱布过滤，收集菌体，用75%的乙醇冲洗菌体3-5次，收集乙醇溶液，后减压浓缩，再喷雾干燥，获得纯度较高的GAMG粗成品。

最后本发明采用高效液相色谱及LC-MS进一步检测GAMG，确认甘草酸转化率、甘草次苷的纯度和得率。

附图说明

图1为本发明所述东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)的菌落形态及子囊形态，图中，A: PDA菌落形态；B: CA 菌落形态；C：蛹虫状孢子囊（显微镜下40×）；

图2甘草酸被β-葡萄糖醛酸苷酶水解生成GAMG；

图3为本发明所述东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸产物的HPLC检测；

图4内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸产物的LC-MS检测。

具体实施方案  

以下结合实例对本发明进行详细说明

实施例1：本发明中东乡野生稻菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)的分离

（1）采集健康的东乡野生稻植物样本，带回实验12h内处理。

（2）选野生稻材料无病症长势良好的植株，在自来水下冲洗1-2h，去除枯萎发黄的枝叶根须，洗净后，选取健康的根、茎和叶，并将根、茎、叶剪成3 cm的小段若干。

（3）然后置于新配制的1-2%NaClO溶液中，茎和叶浸泡5 min，根处理4 min，接着用新配制的2.5%的Na₂S₂O₃浸泡10 min，无菌水清洗3次，然后用新配制的75%的乙醇浸泡1 min，无菌水清洗3次。

（4）将上述处理好的茎用灭菌过的剪刀将两头剪掉，再将去掉两头的茎纵剖，一分为二，再剪成0.1×0.5 cm的小块。将叶子的边缘用灭过菌的剪刀剪去，把剪去了边缘的叶片也剪成约0.2×0.5 cm的小块，处理后的植物组织小块定殖到含50 mg·L^-1氯霉素的PDA、MEA、CA培养基上，置于28℃培养。为了检查表面灭菌效果，设对照进行灭菌效果的检验，用移液枪吸取200 μL最后一次清洗的无菌水，均匀的涂布在平板培养基上，作为对照。

（5）每日定时观察内生真菌的长出情况，将切口处新长出的真菌挑取接到PDA培养基上，纯化培养直至获得纯菌株。

实施例2：本发明筛选出定向转化甘草酸生成GAMG的东乡野生稻菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)。

（1）平板初筛：将上述分离到的东乡野生稻的内生真菌活化，接种于甘草酸作为唯一碳源的固体筛选培养基中，对照组用葡萄糖代替甘草酸作为唯一碳源。28℃，培养7 d，筛选出能生生长良好的菌株。

所述筛选培养基为；每升培养基中含甘草酸3.0 g， KH₂PO₄  2.2 g， NH₄NO₃  3.0 g，NaCl 0.5 g，酵母粉0.05 g，MgSO₄0.12 g，CaCl₂  0.014 g，FeSO₄ 0.014 g ，ZnSO₄·7H₂O 2.9 mg， MnCl₂·4H₂O 2.0 mg， CuSO₄·5H₂O 0.25 mg，CoCl₂·6H₂O 0.24 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24 mg， H₃BO₃ 0.03 mg，琼脂粉20 g（液体培养基不加），其余为纯水，pH6.0。

(2)摇瓶复筛：将上述平板初筛出来的菌株接种到种子培养基（用20g/L的葡萄糖替换筛选培养基中的3.0 g/L的甘草酸）中28℃ 、150  rpm培养 2 d，然后按20%的接种量转接至甘草酸为唯一碳源的液体筛选培养基中，并设两个对照：一是液体筛选培养基中不接入菌体，以检测甘草酸是否在培养基中分解；二是将菌株转接到用葡萄糖代替甘草酸作为唯一碳源的筛选培养基中，28℃ 、150 rpm摇床培养4 d，收集发酵液，用TLC、HPLC和LC-MS检测转化的产物。

实验结果表明：东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)能定向转化为甘草次苷（如图3、图4），甘草酸转化率（（起始GL摩尔浓度-转化后GL摩尔浓度）/起始GL摩尔浓度×100%）为72.4%，GAMG产率（转化后GAMG摩尔浓度/起始GL摩尔浓度×100%）为67.3%。

实施例3：东乡野生稻菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸生成GAMG

将活化后的东乡野生稻菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)接入到种子培养基28℃ 、250 rpm培养3 d，然后按30%的接种量转接至转化培养基中，35℃、250 rpm摇床培养7 d。离心去菌体，收集发酵液，用HPLC检测转化产物。

所述种子培养基的组成为：每升培养基中含葡萄糖25 g，甘草酸（或甘草酸铵盐）0.2 g，KH₂PO₄ 2.0 g，NH₄NO₃ 3g，NaCl 0.5 g，酵母粉0.1 g，MgSO₄ 0.12 g，CaCl₂ 0.2 g，FeSO₄ 0.014 g， ZnSO₄·7H₂O 2.9 mg， MnCl₂·4H₂O 2.0 mg，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg，CoCl₂·6H₂O 0.24 mg， Na₂MoO₄·2H₂O 0.24 mg， H₃BO₃ 0.03 mg， 其余为纯水，调pH为6.0。

所述转化培养基组成为：每升培养基中含甘草酸单铵盐5 g， KH₂PO₄ 2.2 g，NH₄NO₃ 3 g，NaCl 0. 5g，酵母粉0.1 g，MgSO₄ 0.12 g，CaCl₂ 0.4 g， FeSO₄ 0.014 g ，ZnSO₄·7H₂O 2.9 mg，MnCl₂·4H₂O 2.0 mg， CuSO₄·5H₂O 0.25 mg，CoCl₂·6H₂O 0.24 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24 mg，H₃BO₃ 0.03 mg，其余为纯水，调pH为7.0。

转化结束后，8层纱布过滤或抽滤菌体，然后用75%的乙醇冲洗菌体3-5次，收集乙醇溶液，并检测转化产物，检测结果为甘草酸转化率为80.5%，GAMG产率为75.2%。

所得的乙醇溶液经减压浓缩后，再喷雾干燥，获得GAMG粗成品，检测纯度为89.4%。 

实施例4：东乡野生稻菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸生成GAMG的检测

高效液相色谱检测转化产物步骤如下：转化产物（发酵液与甲醇洗菌液的合并液）用色谱甲醇稀释5倍后，用有机滤膜（孔径为0.22 μm或0.45 μm）过滤后用高效液相色谱仪分析检测。色谱条件：仪器为色谱柱为J’sphere ODS-H80 (250×4.6 mm，4 μm)，检测器为PDA，检测波长251.1 nm，流动相为甲醇：三蒸水（乙酸调pH 2.85）＝81：19，进样量：20 μL，流速为1 mL/min，柱温箱：35°C。

液质联用（LC-MS）检测转化产物：样品的处理方法与HPLC法处理方法一样。检测参数为：仪器：Agilent6120 Quadrupole LC/MS，色谱柱：Agilent StableBond SB-C₁₈（2.1×50mm, 1.8μm），检测器：四级杆质量检测器，流动相：甲醇：三蒸水＝81：19，进样量：5 μL，流速：0.2mL/min，柱温箱：25°C，电离方式：EIS（－），选择离子检测(SIM)质荷比(M /Z)：821.9和和645.5，即对应检测GL（分子量为822.9）和GAMG（分子量为646.81）。

附录：菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)的ITS序列

TTCCGTAAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAATTCAACGGTGTGGTCGCGGCCTCCGGGGGCTTCCCTCCGGGCGGTAGAGGTAACACTCTCACGCGCCACATGTCTGAATCCTTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCCTCGGTGGGGCAACCTGCCGTTGGAACTTATCAAAAACCTTTTTTGCATCTAGCATTACCTGTTCAGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTCCGCGCGTGGACTCGCCCCAAATTCATTGGCAGCGGTCTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCAGAGGGGCGTGGGCCGCGTCCACGAAGCAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG。

附录：菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)的ITS序列

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