用于生物活性化合物的受控释放的生物可降解的、半结晶的、相分离的、热塑性多嵌段共聚物

摘要

本发明涉及生物可降解的、半结晶的、相分离的热塑性多嵌段共聚物、用于制备所述多嵌段共聚物的方法、用于递送至少一种生物活性化合物的组合物以及用于向有此需要的对象递送生物活性化合物的方法。本发明的多嵌段共聚物的特征在于：a)其包含至少一个可水解的预聚物(A)链段和至少一个可水解的预聚物(B)链段；b)所述多嵌段共聚物在生理条件下的T

说明书

本发明涉及生物可降解的、半结晶的、相分离的、热塑性多嵌段共聚 物、用于制备所述多嵌段共聚物的方法、用于递送至少一种生物活性化合 物的组合物以及用于向有此需要的对象递送生物活性化合物的方法。

肽和蛋白质一起称为多肽，其在所有生物过程中起着重大的作用，并 且在近年来作为候选药物得到了越来越多的关注。肽和蛋白质药理学的快 速发展以及通过重组DNA技术及其他技术来大规模生产这些化合物激起 了对这些化合物的巨大兴趣。遗憾的是，肽和蛋白质的发展已远远超过使 用方便且有效的递送系统来全身地或局部地递送这些化合物的能力。

生物可降解聚合物在过去的十年中因用于全身或特定部位的药物递 送的长效肠胃外受控释放系统已受到越来越多的关注。生物可降解受控释 放制剂能显著提高治疗化合物的药代动力学。这特别与慢性疾病的治疗有 关，并且用于具有窄治疗窗(therapeutic window)的化合物因为其能降 低全身血浆浓度同时减少不期望的副作用。许多新的生物活性化合物还具 有短的半衰期，这使得频繁注射以达到治疗有效的血浆水平成为必需。患 者依从性以及与用于肠胃外施用的生物活性化合物的频繁给药方案相关 的高成本增加了对生物可降解的肠胃外受控释放剂型的兴趣。

聚(D，L-乳酸)(PDLLA)和乳酸与乙醇酸的共聚物(也称为PLGA 共聚物)是应用最广泛的用于肠胃外受控释放贮库(depot)制剂的生物 可降解聚合物。PLGA共聚物已成功地用于开发小分子(例如利培酮 (risperidone))和治疗肽(例如亮丙瑞林(Ieuprolide)、戈舍瑞林 (goserelin)或奥曲肽(octreotide))的持续释放贮库制剂。

然而，PLGA聚合物的一些缺点限制了它们的使用并且使其不太适于 多肽的递送。首先，PLGA共聚物是相对疏水的聚合物，不能为包封的 (encapsulated)蛋白质提供最佳环境。蛋白质可吸附到聚合物，导致慢 的和不完全的释放、蛋白质展开和／或聚集。其次，操纵较大的生物活性 化合物(例如包封的多肽)的释放的能力有限，因为这样的化合物在相对 刚性的和不可溶胀的PLGA基质中的扩散可忽略不计。因此，蛋白质从 PLGA共聚物的释放取决于经过存在于基质中的孔的扩散以及基质的降 解或溶解时间。通常来说，包封的蛋白质仍截留在聚合物基质中直到后者 已经降解至失去其完整性或溶解的程度的时候，导致通常为基于PLGA 的贮库制剂获得的两相或三相降解依赖性释放曲线。最后，在PLGA共 聚物降解期间，形成积聚在刚性的和不可溶胀性PLGA基质中的酸性部 分，导致在聚合物基质中的酸性微环境的形成，其原位pH值可低至1至 2。在这样的酸性条件下包封的蛋白质可形成聚集体，导致不完全的蛋白 质释放。此外，低pH可以对包封的肽或蛋白质的结构完整性和生物活性 具有劣化作用，潜在地导致降低的治疗效力和增强的免疫原性。已报道了 蛋白质和肽的化学修饰，例如酰基化和形成加成物。

因此，需要更适于蛋白质递送的生物可降解聚合物。然而，PLGA以 及相关的聚合物的优点之一是其具有良好的临床应用记录并且通常认为 是高度生物相容的，并且因为减轻风险的原因，已被许多制药公司采用来 为其活性化合物开发贮库制剂。因此期望可由公知的、生物安全的和临床 可接受的由单体构成的聚合物设计出新的生物可降解聚合蛋白质递送系 统。

试图提供对蛋白质药物具有改善的相容性的允许其受控释放的亲水 性基质，Kissel等(J.Contr.Rel.1996，39(2)，315-326)合成了含有亲水性 聚(环氧乙烷)的B嵌段和疏水性生物可降解的A嵌段的ABA三嵌段共聚 物，其由聚(L-乳酸-共聚-乙醇酸)组成。Kissel等报道了多种蛋白质类化 合物从微球的持续释放，所述微球由聚(L-乳酸-共聚-乙醇酸)-聚(乙二醇)- 聚(L-乳酸-共聚-乙醇酸)和聚(L-乳酸)-聚(乙二醇)-聚(L-乳酸)共聚物(即 ABA型聚合物，其中A是疏水性嵌段，B是聚乙二醇)构成。然而，这 些共聚物受限于其A／B的比率，即聚(乙二醇)(PEG)含量。为了预防与 使用高分子量的PEG相关的肾清除率问题，在这些ABA三嵌段共聚物 中所使用的PEG部分的分子量应优选地不超过5000g／mol。因此，为了 获得由Kissel等所描述的高PEG含量的三嵌段聚合物，同时保持低的 PEG分子量，疏水性嵌段也应该短。这将产生具有用作生物材料的不期 望特性的聚合物，这是由于在短嵌段长度的玻璃化转变温度(T_g)低于室 温(由本发明人确定的)并且结晶度(在聚(L-乳酸)(PLLA)的情况下) 非常低或者不存在(De Jong，Macromolecules，1998，31(19)，6397-6402)， 因此产生粘性材料并且所并入活性物质的受控释放(太)快并且控制不好。

在例如US-A-5554170、US-A-5066772、US-A-5236444、US-A-5133 739和US-A-4429080中发现了相分离的、链段化／嵌段共聚物的实例。 这些已知材料是生物可吸收的共聚酯，其中硬嵌段主要由结晶的聚乙交酯 和／或聚丙交酯构建。这些聚合物是刚性并且不可溶胀的，因此遭受如 PLGA和PDLA所提及的相同的缺点和局限性，使其不适于蛋白质的持 续释放。

已对包含一个可水解聚酯链段和一个亲水性水解稳定链段的生物可 降解多嵌段共聚物的药物负载和释放容量进行了研究(例如：Lee等(J. Control. Rel.，2001，73(2)，315-327)描述了基于ε-己内酯链段和聚(乙二醇) 链段的多嵌段共聚物(multi-block copolymers based onε-caprolactone  segments and poly(ethylene glycol)segments))。这些聚合物仅包含一个可 降解链段，因此限制了控制其降解和释放特性的能力。

在另一方面，已知的两种类型的生物可降解预聚物(链段)的多嵌段 共聚物只能以交替的预聚物序列形成，导致了受限的可能变量范围(Penco 等，J.Appl. Polym.Sci.2000，78(10)，1721-1728)。

在WO-A-2004／007588中描述了包含不同组分的可水解聚酯链段的 生物可降解多嵌段共聚物的实例。这些多嵌段共聚物包含具有无定形链段 的生物可降解相分离共聚物，“软的”为具有低于37℃的T_g(玻璃化转变 温度)和半结晶链段的生物可降解的预聚物(A)，“硬的”为具有40℃至 100℃相转化温度的生物可降解的预聚物(B)，其中所述链段由多官能扩 链剂连接。为了获得如WO-A-2004／007588中所公开的T_m为40℃至100 ℃的多嵌段共聚物，对用作B链段的预聚物的选择限制于由聚(ε-己内酯) (PLC)(WO-A-2004／007588)、聚(戊内酯)(PVL)和/或聚二烷酮(PDS) 构成的预聚物。当将PDS用作链段B时，获得了T_m为80℃至90℃的多 嵌段共聚物(US-A-5711958)。当将PCL用作链段B时，获得了T_m为 40℃至60℃的多嵌段共聚物(WO-A-2004／007588)。PVL均聚物的T_m类似于PCL均聚物的(即，约60℃)。因此，当将PVL用作链段B时， 可获得T_m为40℃至60℃的多嵌段共聚物。PDS、PCL和PVL具有相对 低的T_g，分别为-10℃、-60℃和-60℃。PDS链段、PCL链段和PVL链段 的低T_g限制了可获得的多嵌段共聚物的T_g范围(其中所述T_g来源于无 定形链段A和半结晶链段B的无定形部分的相混合)并且因此限制了对 释放特性和降解特性的控制。

WO-A-99／02168描述了用于生物医学应用的生物可降解多嵌段共聚 物，其中无论是ABA型预聚物还是AB型预聚物都是扩链的。ABA型预 聚物或AB型预聚物的扩链都只能导致交替的多嵌段共聚物。在AB预聚 物的扩链的情况下，交替的嵌段共聚物由ABABABABAB表示，或者在 ABA预聚物的扩链的情况下，由ABAABAABAABA表示。

在US-A-6160084中描述了包含硬链段和软链段的生物可降解的相 分离的多嵌段共聚物。该文件描述了由用三甲基己烷-1，6-二异氰酸酯 (THDI)连接的预聚物构成的PCL-PLLA多嵌段共聚物的用途。提到这 些材料可用于需要形状记忆的药物递送系统中。US-A-2006／0 140 999描 述了用于药物释放系统的类似形状记忆聚合物的用途，其中所述形状记忆 材料包含来源于选自以下中的单体的单元：己内酯、丙交酯、乙交酯和二 氧杂环己酮。实例包括PDS-PCL和PDS-PLGA多嵌段共聚物。这些材 料在(模拟的)生理条件下不能表现出任何显著溶胀度，因为溶胀会引起 机械特性的损失，从而丧失记忆的形状。

其他相分离的、链段化的多嵌段共聚物包括如US-A-5 980 948中所 描述的聚醚酯共聚物。这些共聚物由通过可水解酯键连接的结晶芳族链段 与包含软PEG的链段组成。所述共聚物具有这样的固有缺点：低可溶胀 性组分(即，疏水性芳族链段富含的组分)不能很好地降解，这是由于芳 族链段的高结晶度和疏水性。高可溶胀性组分(即，PEG富含的组分) 由于低浓度的酯键也不能很好地降解。相比之下，由于链段A以及链段B 中酯键的存在，本发明的多嵌段共聚物在各链段A／链段B的比率下是可 降解的。此外，与本发明的多嵌段共聚物相比，聚醚酯共聚物的T_g不能 被改变并且总是低的，大约为PEG的T_g，即-30℃。

本发明的目的是克服所发现的现有技术的一个或更多个缺点。

在第一方面中，本发明涉及生物可降解的、半结晶相分离的、热塑性 多嵌段共聚物，所述共聚物的特征在于：

a)其包含至少一个可水解的预聚物(A)链段和至少一个可水解的预 聚物(B)链段；

b)所述多嵌段共聚物在生理条件下的T_g为37℃或更低并且T_m为110 ℃至250℃；

c)所述链段通过多官能扩链剂连接；

d)所述链段无规地分布在聚合物链上；并且

e)所述预聚物(A)的至少部分来源于水溶性聚合物。

本发明的多嵌段共聚物可由至少两个各自具有不同物理特征(包括降 解特性和溶胀特性)的不同链段构成。由于其独特的组成和其半结晶相分 离的形态，本发明的材料出乎意料地是多用途的并且极其适于构建药物递 送基质与药物洗脱包衣(coating)，其可用于包封某些治疗药剂和用于所 述包封的治疗药剂局部地或进入到全身循环的持续释放。如下文所述，本 发明的组合物特别令人感兴趣地用于生物活性化合物的受控释放，例如生 物活性多肽到宿主。

本文所用术语“相分离的”意指系统，特别是由两个或更多个不同预 聚物构建的共聚物，其中至少两个(部分地)在体温或更低温度下(在生 理条件下，例如在人体内)彼此相容。因此，预聚物在组合时不形成均一 的混合物，既不在作为预聚物的物理混合物组合时，也不在预聚物作为“化 学混合物”(即作为共聚物)以单一化学种类组合时。

本文所用术语“预聚物”意指由多官能扩链剂无规地连接的聚合物链 段，一起构成本发明的多嵌段共聚物。通过合适的单体的聚合作用可获得 每个预聚物，所述单体因而是每个预聚物的化学单元。所述预聚物并且因 此本发明的多嵌段共聚物的期望特性可通过选择具有合适的组成和分子 量(特别是M_n)的预聚物来控制，以便获得所需的T_m或T_g。

本文所用术语“多嵌段”意指在聚合物链中存在至少两个不同的预聚 物链段。

本文所用术语“热塑性”意指多嵌段共聚物的非交联性质。在加热后， 热塑性聚合物变为流体，而(再)冷却后，其凝固。热塑性聚合物溶于适 当的溶剂中。

本文所用术语“可水解的”意指与水反应后该分子断裂的能力。可水 解的基团包括酯基、碳酸酯基、膦腈基、酰胺基和氨酯基。在生理条件下， 只有酯基、碳酸酯基和膦腈基在合理的时间范围内与水反应。

本文所用术语“多官能扩链剂”意指在扩链剂上存在至少两种反应基 团，其允许化学地连接反应性预聚物从而形成多嵌段共聚物。

本文所用术语“无规多嵌段共聚物”意指其中不同链段无规地分布在 聚合物链上的多嵌段共聚物。

本文所用术语“水溶性聚合物”意指在生理条件下，于水性介质(优 选地水)中具有良好溶解性的聚合物。该聚合物在与更疏水部分共聚时， 致使产生在水中可溶胀的共聚物。水溶性聚合物来源于二醇、二胺或二酸。 二醇或二酸适用于引发环状单体的开环聚合。

本文所用术语“可溶胀的”意指由聚合物摄取水。可通过水溶胀共聚 物的质量除以干共聚物的质量来计算溶胀比。

本文所用术语“半结晶的”意指包含两种不同的相(无定形相和结晶 相)的多嵌段共聚物的形态。优选地，所述多嵌段共聚物是由无定形相和 结晶相构成的。

本文所用术语“生物活性化合物”旨在广泛地解释为提供治疗或预防 作用的任何药剂。这样的药剂包括但不限于：抗微生物剂(包括抗菌剂和 抗真菌剂)、抗病毒剂、抗肿瘤剂、激素和免疫原性剂。

本文所用术语“生物活性多肽”意指在哺乳动物体内、更特别地在人 体内具有生物活性的肽和蛋白质。

本发明的半结晶的、相分离的多嵌段共聚物克服了一个或更多个上述 缺点和局限性。因为来源于水溶性聚合物的链段(例如亲水性PEG链段) 的存在，相分离的多嵌段共聚物在水性环境中溶胀以形成溶胀的水凝胶来 为生物活性化合物(例如蛋白质)提供天然环境。当本发明的多嵌段共聚 物作为聚合物基质应用于受控释放制剂中以递送生物活性化合物时，所述 多嵌段共聚物的溶胀性可避免在聚合物链的水解期间形成的酸性降解产 物在聚合物基质中的累积。代替的是，这些降解产物从基质中释放从而防 止会对包封的生物活性化合物有害的聚合物基质中的酸性微环境的形成。 此外，由于本发明的相分离的多嵌段共聚物的溶胀性，任何包封的化合物 都可通过扩散逐渐释放，从而防止通常为非溶胀性生物可降解的聚酯(例 如聚(D，L-丙交酯)或聚(乳酸-共聚-乙醇酸))所获得的两相释放模式或三相 释放模式。

本发明的多嵌段共聚物在生理条件下的T_m为110℃至250℃。这归因 于预聚物链段B。所述链段B基于可结晶的聚合物，例如PLLA、聚(D- 乳酸)(PDLA)、聚乙醇酸(PGA)或聚羟基丁酸酯(PHB)、或者可结 晶聚合物的组合。最优选地，所述链段B基于由PLLA构成的预聚物。 本发明的相分离的多嵌段共聚物的无定形相主要由软的A链段组成。出 乎意料地，我们发现了硬的链段B的无定形部分对本发明的多嵌段共聚 物的总无定形相也有贡献。

对于在WO-A-2004／007588中所描述的多嵌段共聚物，用作B链段的 预聚物的选择限于由聚(ε-己内酯)(PCL)、聚(戊内酯)(PVL)和聚(二烷酮)(PDS)构成的预聚物，这是由于预聚物(B)的T_m在40℃至100 ℃的范围内(考虑到用于生物医学应用的常用聚酯)。根据本发明，预聚 物(B)的T_m优选地为110℃至250℃。结果，预聚物(B)可从之前未 考虑的化学上不同的预聚物列表中选择。本发明人发现不同的化学预聚物 (B)产生表现出不能由WO-A-2004／007588中所述的共聚物获得的有利 特性的多嵌段共聚物。

当将PDS用作链段B时，获得了T_m为80℃至90℃的多嵌段共聚物 (US-A-5 711 958)。当将PCL用作链段B时，获得了T_m为40℃至60℃ 的多嵌段共聚物(US-A-5 711 958)。PVL均聚物的T_m约为60℃，类似 于PCL均聚物。当将PVL链段用作链段B时，获得了T_m约为40℃至 60℃的多嵌段共聚物。PDS、PCL和PVL是半结晶的，因此除了其T_m之外还具有T_g。PDS、PCL和PVL均分别具有约-10℃、-60℃和-70℃的 其各自无定形相的低T_g。将嵌段B的温度范围提高至110℃至250℃开辟 了使用PLLA、PDLA、PGA和PHB的可能性。这些聚合物分别具有约 50℃、35℃和0℃的较高T_g。不考虑其中用于硬的B链段的聚合物，这 些硬的B链段本身会一直是半结晶，即部分地无定形。出乎意料地，发 现硬的B链段的无定形部分会(部分地)与软的A链段相混合，并且因 此两者均会对所述多嵌段共聚物的总T_g有贡献。因此，通过链段A的T_g和链段B的T_g两者与链段A／B的摩尔比率相结合确定了无定形相的T_g。 所述T_g可为从接近于预聚物(A)的T_g(当使用接近于1的预聚物A／B 比率时)至接近于预聚物(B)的T_g(当使用接近于0的预聚物A／B比率 时)之间变化。重要地，包封在聚合物基质中的活性物质的释放在很大程 度上取决于无定形相的T_g，因为活性物质的扩散经过无定形相而非致密 的结晶相发生。此外，聚合物的降解速度在很大程度上取决于无定形相的 T_g，因为这影响水流入的速度从而影响水解速度。使用T_m为110℃至250 ℃具有相对高的T_g的预聚物(B)使得能够覆盖比具有40℃至100℃的 T_m和相对低的T_g的预聚物(B)本来可能的范围更广泛的T_g范围。因此， 使用这样的预聚物(B)来制备T_m在110℃至250℃范围内的多嵌段共聚 物使得能够实现聚合物的更广泛的释放和降解特性，从而还允许更好地控 制不同的生物活性化合物的释放。

此外，本发明的多嵌段共聚物的较高T_m允许在环境条件下通过双乳 化方法来制备非粘性微球，同时仍然具有短的B链段。与较高分子量的 结晶的PLLA聚合物相反，可结晶的B链段的长度的限制对于具有在生 理条件下很好降解的多嵌段共聚物而言是重要的。相反，不能使用其中链 段B由短的PCL构成的多嵌段共聚物来制备微球，因为短的PCL嵌段 在微球形成期间不能形成结晶域。因此聚合物仍然是无定形的。由于无定 形聚合物的低T_g，该聚合物是粘的，因此微球在萃取／蒸发处理步骤期间 聚集并融合在一起。因为PVL的T_m与PCL类似，所以可以预料，不能 使用其中链段B由短的PVL预聚物构成的多嵌段共聚物来制备微球。未 参考由PDS或PDS共聚物构成的微球的文献。从文献中已知，PDS的结 晶在快速冷却速度和/或低PDS分子量下是缓慢和不完全的。这些结果预 测，使用其中链段B为短的PDS嵌段的多嵌段共聚物通过双乳化方法来 制备微球是不可行的。

理论上，在环境条件下用T_m为110℃至250℃的预聚物(B)制备的 微球的贮藏稳定性比用T_m为40℃至100℃的预聚物(B)制备的有所改 善。提高的T_m提高了T_c并且因此提高了微球的结晶度。较高的结晶度将 降低在聚合物基质中包封的生物活性化合物的分子流动性并且改善所述 产物的贮藏稳定性。从文献中已知，提高的结晶度提高了颗粒的贮藏稳定 性。此外，T_m为110℃至250℃的预聚物B比T_m为40℃至100℃的预聚 物(B)具有更高的T_g。从文献中已知，对于半结晶颗粒以及无定形颗粒， 提高的T_g提高了贮藏稳定性。

本发明的多嵌段共聚物与其中可结晶链段基于PCL的多嵌段共聚物 相比还具有改善的降解速度，因为本发明的多嵌段共聚物中的B链段与 PCL相比疏水性较低。

PDS单体、p-二烷酮的受限聚合以及PDS在常用溶剂中的受限溶 解性阻碍了其中可结晶链段基于PDS的多嵌段共聚物的合成。众所周知， p-二烷酮具有相对低的上限温度，导致约80％的最大转化率。相比之下， 用于本发明的多嵌段共聚物的单体(例如丙交酯和乙交酯)可容易地聚合 至转化率为95％以上。含有聚合物的PDS的受限溶解性也限制了其用于 制备受控释放制剂。

由基于PLLA的链段B构成的本发明的多嵌段共聚物具有另外的优 点，PDLA可作为另外的B链段添加，产生具有提高的结晶度和降低的 降解速度的多嵌段共聚物，因为T_m高至220℃的PLLA／PDLA立体络合 物晶体的形成，其比单独地由对映体L-丙交酯构成的结晶PLLA链段的 T_m高约50℃。

在本发明的多嵌段共聚物中，来源于水溶性聚合物的链段的含量可独 立于疏水(结晶的)链段的嵌段长度而变化。因此，可获得来源于水溶性 聚合物的高含量的链段，同时保持结晶度。此外，本发明的多嵌段共聚物 的特性粘度(IV)可独立于组成而变化，这与Kissel等描述的ABA三嵌 段共聚物相反。本发明的多嵌段共聚物的高度可变性使链段的长度、比率 以及组成易于调节以获得期望的降解特征和药物释放动力学。

本发明的多嵌段共聚物相对于背景技术实例中所提及的结构ABA嵌 段共聚物来说还具有优势。尽管通过使用具有不同共聚物的嵌段的嵌段共 聚物代替均共聚物或无规的共聚物可大大改善聚合物特征，但是这些 ABA共聚物仍然具有某些缺点。

为了获得最小分子量的ABA共聚物，序列A和序列B必须具有特定 长度。嵌段可独立地表现为具有类似组成的单个均聚物。ABA型共聚物 的特性仅能通过改变A嵌段和B嵌段的组成来调节。另一个缺点是嵌段 共聚物必须在惰性条件下于相对高的温度(>100℃)下制备以完全转化 所有单体并且获得足够的分子量。第一个缺点可通过使用其中嵌段或链段 短得多并且由在100℃以下的温度下进行的化学反应来连接到一起的多 嵌段共聚物来解决。例如降解行为的特性可通过选择链段长度、比率以及 组成的适当组合以更好的方式调节。

此外，由于在制备ABA嵌段共聚物(及其衍生物)的过程中使用的 相对高的温度，总是存在酯交换的可能性，导致一定程度的相混合。本发 明的多嵌段共聚物不遭受该缺点，因为其可通过在相当低的温度下(<100 ℃)连接具有用预先确定的单体组成的预聚物来制备，因此避免了酯交换 和其他副反应，所述副反应可导致产生不期望的降解和其他副产物。这意 味着，所述共聚物的单体序列长度是由构建组分的选择来确定而并没有如 通常适用于无规共聚物合成的那么多地取决于反应时间和温度。通过使用 多官能扩链剂连接预聚物来制备的本发明多嵌段共聚物的另一个优点是 预聚物链段无规地分布于共聚物中，因此提供调节特性的更大可能性。无 规多嵌段共聚物例如ABBBBABAAABBAAAAA...等。本发明的无规多嵌 段共聚物提供了许多交替多嵌段共聚物无法获得的优点。

首先，由A嵌段和B嵌段的扩链获得的无规多嵌段共聚物具有无限 制的A与B比率。A∶B可例如是10∶90，但也可以是90∶10。相比之下， 交替多嵌段共聚物中的嵌段的比率受限于在扩链聚合物中所用的比率。例 如，在AB的扩链的情况下，在多嵌段共聚物中A∶B的比率是50∶50。本 发明的多嵌段共聚物的无规性质大大地增加了材料的可能组成并且从而 控制其物理和化学特性。这包括对水中溶胀度、形态(相分离、无定形／ 结晶度)以及聚合物降解的更好控制。

其次，本发明的无规多嵌段共聚物的合成方法与交替多嵌段共聚物的 合成相比是更加不费力的。在交替多嵌段共聚物中，在AB二嵌段情况下 的链段A和链段B，或在ACA三嵌段情况下的链段A和链段C，都必须 在扩链之前被连接(或者需要合成大量的扩链剂)。在无规多嵌段共聚物 中，分开的A嵌段和B嵌段是用例如市售扩链剂来扩展的链。

本发明的多嵌段共聚物的另一个优点是其基于多官能(优选脂肪族) 扩链剂。通过选择扩链剂的类型和量可影响聚合物特性(例如，扩链剂可 作为软化剂起作用或者其可影响相分离的程度)。因此，获得具有期望特 性的聚合物的总自由度相比于现有技术的聚合物有所提高。

根据本发明，提供了相分离的多嵌段共聚物，其在施用后在水性环境 中和在生理条件下充分溶胀以为包封的肽或蛋白质提供水性微环境并且 允许肽和蛋白质的扩散受控释放。所述材料因此显示出机械强度的显著降 低。尽管这样的材料在干燥条件下可用作形状记忆材料，而在转化为记忆 形状之前不显示出机械强度的显著降低，例如，通过使用温度或光作为外 部引发(trigger)，这些材料在含水条件下显示出显著的尺寸改变和其机 械强度的显著降低，简单地因为这些材料由于其亲水特征吸收了大量的水 导致所述材料的广泛溶胀和增塑作用。因此，在含水条件下，例如在人体 或动物体内遇到的生理条件下，由这些材料制备的构建体的大小显著改变 并且这些材料的机械特性以数量级改变。与本发明的多嵌段共聚物相反， 在US-A-5 711 958中描述的形状记忆材料在含水条件下(例如在人体或动 物体遇到的生理条件下)几乎不溶胀。

本发明的相分离的聚酯或聚酯-碳酸酯是有前途的生物材料组并且可 用于多种药物递送应用中，因为它们对药物释放提供极好的控制并且允许 生物活性化合物(例如多肽)释放。

多嵌段共聚物(或其制备的构建体)的形态取决于环境条件：可在惰 性(干燥)条件下进行DSC(差示扫描量热法，Differential Scanning  Calorimetry)测量并且结果可用于确定干材料的热特性。然而，在生理 条件(即在体内)下的形态和特性可不同于在环境条件下(干燥、室温) 的形态和特性。可以理解，转化温度如本文所用的T_g和T_m，是指当应用 于体内时，即当在与被水蒸汽所饱和并且在体温下的气氛中平衡时，材料 的相应值。这可以通过使材料与水饱和的气氛达到平衡后进行DSC测量 来在体外模拟。当在干燥状态中时，用于本发明的材料的T_g值可以比在 哺乳动物体内条件下稍微高，也就是说，当干燥材料经受DSC时，第一 变形点可发生在较高温度，例如在42℃或50℃，或更高。然而，在应用 于体内时，干燥材料的T_g和/或T_m会因水的吸收而下降，其可塑化聚合 物并且根据本发明该终T_g应在体温附近或更低。该终T_m在生理条件下为 110℃与250℃。

例如，在软链段中含有PEG的聚合物可于环境温度下在干燥条件下 为结晶，而在潮湿条件下为无定形，产生由无定形的软PEG和聚酯／碳酸 酯形成的软链段的混合的T_g和两个独立的T_g。本发明的共聚物的相分离 特征反映在T_g和T_m的方面中。相分离的共聚物的特征在于至少两次相转 化，其每次都与(但是一般不同于)包含在共聚物中的预聚物的相应T_g值或T_m值有关。所述T_g是通过采取比热跃变(the specific heat jump) 的中点确定，如可例如通过DSC测量。所述T_m是熔点峰的最大峰值，如 在图1中示意性地说明的，其示出共聚物的特征在于T_g和T_m的热流吸热 的。如本文所定义的，某些预聚物的T_g和T_m值反映在共聚物上测量的值。 在预聚物完全不混溶的情况下，共聚物的T_g单独由无定形的“软的”预 聚物的T_g控制。然而，实际上，多嵌段共聚物的结晶相和无定形相的组 成不同于软A链段和半结晶的B链段的组成。形成预聚物的原始硬链段 的无定形部分将与形成预聚物(A)的软链段混合并且因此成为无定形相 部分。无定形相的T_g值因而不同于预聚物所用的那个。可混溶性的程度 (并且因此T_g和／或T_m相对于相应预聚物的那些的偏差)取决于共聚物 中的预聚物组成、比率和链段长度。共聚物链段的T_g通常处在相混合的 共聚物的T_g值与分离的预聚物的T_g值之间。

可通过改变形成预聚物的软链段和硬链段的单体的类型及其链长度 和链比率并且通过选择扩链剂的类型和量容易地调节多嵌段共聚物的理 化特性(例如降解、溶胀和热特性)。此外，相转化温度对于加工熔融的 聚合物是足够低的。可通过改变聚合条件容易地控制共聚物的单体比率和 分布。

结晶链段B通常需要获得非粘性材料。此外，为了具备聚合物基质 的受控溶胀，必须在暴露于生理条件(即，在体温下的水性环境)期间保 持具有无定形和结晶域的相分离形态。控制溶胀度对于控制包封的化合物 的释放是必需的。结晶B链段充当控制更亲水软链段的溶胀的物理交联 剂(physical cross-link)。除了受硬链段B的含量影响外，聚合物的溶胀 度还取决于软A链段中的水溶性聚合物的含量和分子量／长度。

如之前所提及的，相分离的链段共聚酯的必要条件是聚酯链段B的 T_m为110℃至250℃并且链段A的T_g在生理条件下为37℃以下。在多嵌 段共聚物中链段B的T_m通常会比未反应的预聚物(B)的T_m低，这是由 于一旦在多嵌段共聚物中构建预聚物则降低的链柔性并且由于在结晶相 中的多嵌段共聚物的其他组分的可能相混合。具有良好的相分离的主要类 别的链段共聚酯是基于由结晶的PLLA构成的硬链段B的那些。本发明 人已经示出具有基于PLLA的B链段的多嵌段共聚物的在生理条件下的 T_m为至少110℃。这些多嵌段共聚物提供一些优点。可获得广泛的降解速 度。形成硬链段B的预聚物(B)基于结晶的PLLA并且已知这样的聚合 物降解的非常慢。相比之下，预聚物(A)是基于水溶性聚合物和无定形 聚酯的聚合物。已知这样的聚合物降解的相对较快。最终降解速度通过链 段A／链段B的比率来确定并且因此可容易地调节。由于释放是通过多嵌 段共聚物的降解速度等控制，所以这也能通过链段A／链段B的比率来调 节。此外，可通过将PLLA与PDLA混合以形成立体络合物来容易地提 高结晶度。立体络合导致比单一对映体更高的结晶度并且还导致更高的 T_m(比单一对映体高～50℃)。此外，具有基于PLLA的B链段的多嵌段 共聚物的T_g可在宽的范围内变化，从约-40℃高至40℃(在干燥条件下测 量)。由于降解速度和释放速度等是由基质的T_g来控制的，所以该宽的 T_g范围也提供了释放特性和降解特性的很大调节。

一般来说，期望的相分离形态(由一个熔点和至少一个低T_g值反映 的)可通过改变组成来获得，例如，通过选择A预聚物和B预聚物的数 均分子量M_n。通过改变链段A／链段B的比率也可影响相分离的形态。

本发明的链段多嵌段共聚物包含来源于预聚物(A)的软链段A，所 述预聚物(A)是可水解的并且在生理(体内)条件下通常是完全无定形 的。此外，预聚物(A)优选地具有至少一个在生理(体内)条件下测量 为37℃或更低、优选地为25℃或更低的T_g的相转化。该链段将作为多嵌 段共聚物中的无定形相部分，其中无定形相在本文称为相(A)。本发明 的共聚物还包含来源于预聚物(B)的硬链段B，所述预聚物(B)包含 通常具有在生理(体内)条件下测量为110℃至250℃的T_m的半结晶的、 可水解的聚合物。链段B主要促成相(B)。分别形成“软的”链段和“硬 的”链段的预聚物A和预聚物B由多官能扩链剂连接。通常来说，结晶 相包含硬链段B并且无定形相包含软链段A和链段B的无定形部分。结 晶相和无定形相在体内条件下不相容或仅部分相容，即，其相分离。所述 多官能扩链剂优选地为脂肪族分子。

本发明所得的多嵌段共聚物优选地具有根据式(1)的结构：

-[R¹-H-R¹-Q¹-R⁴-Q²]x-[R²-Q³-R⁴-Q⁴]y-[R³-Q⁵-R⁴-Q⁶]z-   (1)

其中R¹是链段A的部分，其是相(A)的部分，并且可以是无定形聚酯、 无定形聚醚酯或无定形聚碳酸酯；或由组合的酯、醚和／或碳酸酯基团获 得的无定形的预聚物。H是链段A的中间嵌段并且来源于水溶性聚合物。 来源于水溶性聚合物的嵌段在室温下可以是无定形或半结晶的。然而，由 此引入链段A的嵌段H在生理条件下会变成无定形的。该水溶性聚合物 选自：聚醚，例如聚乙二醇(PEG)、聚四亚甲基氧化物(PTMO)和聚 丙二醇(PPG)；聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯己 内酰胺、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚-(HEMA))、聚磷腈、聚原酸酯 (polyorthoester)、聚原酸酯酰胺(polyorthoesteramides)或前述聚合物 的共聚物。优选地。H是PEG，其是形成R¹的环状单体的开环聚合的起 始物(initiator)。

R²是链段B并且主要或完全地促成相(B)。R²可以是结晶的或半结 晶的聚酯、聚醚酯、聚碳酸酯或聚酐；或组合的酯、醚、酐和／或碳酸酯 基团的预聚物。相R²部分可是无定形的，在这种情况下，该部分R2会促 成相(A)。R¹和R²优选地是不同的。变量z是零或者正整数。变量x和 变量y都是正整数。

任选地，存在链段R³。该链段来源于选自H所提及的聚合物的水溶 性聚合物。R³在生理条件下会是无定形相(A)的部分。如果存在R³， 那么本发明的多嵌段共聚物包含作为另外的预聚物的水溶性聚合物。优选 地，该水溶性聚合物选自聚醚，例如聚乙二醇(PEG)、聚四亚甲基氧化 物(PTMO)和聚丙二醇(PPG)；聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 聚乙烯己内酰胺、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)(聚-(HEMA))、聚磷腈、聚原 酸酯、聚原酸酯酰胺或前述聚合物的共聚物。例如，所述水溶性聚合链段 来源于M_n为150g／mol至5000g／mol的PEG。

R⁴来源于扩链剂并且由脂肪族C₂至C₈亚烷基组成，任选地被C₁至 C₁₀亚烷基取代，脂肪族基团为直链或环状的。R⁴优选地为亚丁基、-(CH₂)₄- 基团。所述C₁至C₁₀亚烷基侧基可包含受到保护的S、N、P或O部分。 包含芳族基团的扩链剂通常是不合适的，因为包含芳族基团的扩链剂可导 致产生不期望的降解产物。因此，优选脂肪族扩链剂。

Q¹至Q⁶是由预聚物与多官能扩链剂反应获得的连接单元。Q¹至Q⁶ 各自可独立地选自胺、聚氨酯、酰胺、碳酸酯、酯和酐。所有连接基团Q 均不同的情况是罕见的并且通常不是优选的。

通常来说，一种类型的扩链剂可以与具有相同末端基团的三种预聚物 一起使用，导致含有六个类似连接基团的式(1)共聚物。

在预聚物R¹和预聚物R²不同地封端的情况下，会存在两种类型的基 团Q：例如在两个连接的链段R¹之间Q¹和Q²会是相同的，但是当R¹和R²连接时，Q¹和Q²是不同的。式(1)的实例示出双官能扩链剂与双 官能预聚物反应的结果。

参照式(1)，本发明的聚酯还可表示为具有无规分布的链段(AB)_r的 多嵌段或链段共聚物，其中‘A’对应于链段A并且‘B’对应于链段B(对 于z=0)。在(AB)_r中，A／B的比率(对应式(1)中的x／y)可以是一致或 不一致的。预聚物可以任何期望量混合并且可通过多官能扩链剂(即，具 有至少两种官能团的化合物，通过所述官能团其可用于化学连接预聚物) 偶联。优选地，其是双官能扩链剂。在z≠0的情况下，则可由(ABC)_r给 出的所有链段的无规分布呈现是三种不同的预聚物(一种是来源于水溶性 聚合物例如PEG的链段)以所有可能比率无规分布。

其中a链段和b链段(和任选的c链段)形成在(AB)_r和(ABC)_r中的 预聚物是通过多官能扩链剂连接的。该扩链剂优选地是二异氰酸酯扩链 剂，但是也可以是二酸化合物或二醇化合物。在预聚物都包含羟基端基并 且使用二异氰酸酯扩链剂的情况下，连接单元将是聚氨酯基团。在预聚物 (之一)是羧酸封端的情况下，连接单元是酰胺基团。具有结构(AB)_r和 (ABC)_r的多嵌段共聚物还可使用偶联剂例如DCC(二环己基碳二亚胺) 通过二羧酸封端的预聚物与二醇扩链剂反应或者反之亦然(二醇封端的预 聚物与二酸扩链剂)反应形成酯键来制备。

如上所提及的，无规链段化的共聚物是指具有无规分布(即，非交替 的)的链段A和链段B的共聚物。在链段A和链段B的情况下，这可表 示为(AB)_r，在链段A、链段B和链段C的情况下，这可表示为(ABC)_r。

式(1)的可水解链段R¹-H-R¹是通过预聚物(A)的反应获得的。

预聚物(A)可例如通过开环聚合来制备。因此预聚物(A)可以是 由以二醇化合物或二酸化合物起始的开环聚合制备的可水解共聚物，优选 地具有无规的单体分布。二醇化合物优选地为脂肪族二醇或低分子量聚醚 例如PEG。聚醚是预聚物(A)的部分，通过使用其作为起始物并且其还 能与预聚物(A)混合，因此形成式(1)中另外的亲水链段R³。预聚物 (A)可以是可水解的聚酯、聚醚酯、聚碳酸酯、聚酯碳酸酯、聚酐或其 共聚物。例如，预聚物(A)包含选自二醇、二羧酸和羟基羧酸的单体形 成的酯的反应产物。预聚物(A)可包含环状单体和/或非环状单体的反应 产物。示例性环状单体包括乙交酯、丙交酯、ε-己内酯、δ-戊内酯、碳酸 亚丙酯、碳酸亚丁酯、1，5二氧杂环庚烷-2-酮、1，4-二烷-2-酮(对二氧 杂环己酮)和/或环状酐(例如氧杂环庚烷-2，7-二酮)。在一个实施方案中， 使用了L-丙交酯、D-丙交酯和/或D，L-丙交酯。

为了满足Tg低于37℃的要求，一些上面提及的单体或单体的组合比 其他的更优选。例如，包含单体丙交酯和/或乙交酯的预聚物(A)优选地 与任何其他提及的环状共单体(ε-己内酯、δ-戊内酯、碳酸亚丙酯、1，4- 二烷-2-酮及其组合)组合。其本身可降低T_g。可替选地，用具有足够 分子量的PEG起始预聚物以降低多嵌段共聚物的T_g。

在含有聚(D，L-丙交酯)的预聚物A的情况下，丙交酯的L／D比率可并 非一致(50／50除外)。例如，L／D比率在85／15与15／85之间完全地得到 无定形均聚物。此外，已知一种异构体(L或D)对于其他的异构体过量 提高了聚(D，L-丙交酯)的T_g。构建无定形相的少量任何其他的上面提 及的单体还可存在于形成预聚物或嵌段的结晶相中。

此外，预聚物(A)可基于单体的缩合(非环状)类型(的混合物) 形成酯和／或酐可水解部分，所述单体例如羟基酸(例如乳酸、乙醇酸、 羟基丁酸)、二元酸(例如戊二酸、己二酸或琥珀酸、癸二酸)和二醇(例 如乙二醇、二甘醇、1，4-丁二醇或1，6-己二醇)。

式(1)的链段R²可通过预聚物(B)的反应获得，在生理条件下具 有在110℃至250℃之间的相转化，所述预聚物(B)来源于单体L-丙交 酯、D-丙交酯、羟基丁酸酯、乙交酯或者导致立体络合物形成的这些单体 的组合。优选地，链段B是通过L-丙交酯单体的反应获得。

通常来说，预聚物(B)的M_n为1000g／mol或更大，优选地为2000 g／mol或更大，更优选地为3000g／mol或更大。一般来说，预聚物(B) 的M_n将为10000g／mol或更小。基于多嵌段共聚物的总重量，在共聚物 中预聚物(B)的含量优选地为10重量％至90重量％，更优选地为25 重量％至70重量％，最优选地为30重量％至50重量％。

预聚物优选地是直链的和无规的具有反应性端基的(共)聚酯、聚酯 碳酸酯、聚醚酯或聚酐。这些端基可以是羟基或羧基。优选具有二羟基封 端的共聚物，但是也可使用羟基-羧基或二羧基封端的聚合物。在聚合物 是直链的情况下，其可用双官能组分(二醇)作为起始物制备，但是在使 用三官能或更多官能的多元醇的情况下，可获得星状聚酯。预聚物(A) 中的二醇可以是脂肪族二醇或低分子量聚醚。

通过开环聚合合成预聚物优选地在催化剂的存在下进行。合适的催化 剂是M／I=5000至30000(M／I是单体对起始物的比率)的Sn(Oct)₂。也 可在没有催化剂的条件下进行合成。

用于制备聚酯、聚碳酸酯和聚酐的条件在本领域是已知的。

本发明的共聚物一般是直链的。然而，还可以以支化的形式制备共聚 物。本发明的这些非直链共聚物可通过使用三官能(或更多官能的)扩链 剂(例如三异氰酸酯)来获得。支化的共聚物可示出改善的蠕变特性。

对于可结晶的硬链段，预聚物的长度(M_n)必须足够大以能够在共 聚物中结晶。例如，形成预聚物的PLLA硬链段的M_n优选地为700g／mol 或更大，更优选地为2000g／mol或更大，最优选地为3000g／mol或更大。 期望较大的PLLA预聚物长度在较低的硬链段含量下导致相分离的形态。 因此，观察到相分离的预聚物比例取决于预聚物长度。一般来说，形成共 聚物内的软链段和硬链段的预聚物长度必须为在其上观察到相分离的形 态的值，相分离的程度(不相容性)对于生物医学设备所需特性是有利的。

形成预聚物(A)的软链段的M_n可为500g／mol或更大，优选地为 1000g／mol或更大，更优选地为2000g／mol或更大。预聚物的长度必须以 这样的方式选择以使其如获得良好的相分离形态以及产生的共聚物的良 好的机械特性和热特性所必需的长度一样大。预聚物长度必须足够低以在 聚合温度下可与扩链剂混合。通常来说，当M_n为10000g／mol或更小时， 这可达到。

一般来说，基于多嵌段共聚物的总重量，硬链段含量为10重量％至 90重量％，优选地为25重量％至90重量％，导致在应用的温度下(即， 对于医学应用约37℃)具有良好的降解和溶胀特性的柔性的、热塑性材 料。

在另一方面，本发明涉及用于制备本发明的相分离的、热塑性多嵌段 共聚物的方法，其包括预聚物(A)和预聚物(B)在多官能扩链剂存在 下的扩链反应，由此获得无规链段化的多嵌段共聚物。

具有结构(AB)_r和(ABC)_r的链段化多嵌段共聚物可通过预聚物混合物 以期望的比率用当量的多官能扩链剂进行扩链来制备，所述预聚物混合物 包含形成链段R¹、H和R²以及任选地R³的单体的硬链段和软链段，所 述扩链剂优选地为脂肪族分子，更优选地为二异氰酸酯例如1，4-丁烷二异 氰酸酯(BDI)。结构(AB)_r或(ABC)_r的链段化共聚物优选地在溶液中制备。 合适地，将所述预聚物溶解在惰性有机溶剂中并且添加纯的或在溶液中的 扩链剂。聚合温度可与所述预聚物的最高相转化温度相同或者甚至更低。 与二环己基碳二亚胺(DCC)的偶联反应优选地在溶液中进行。均为二 醇或二酸封端的两种(或三种)预聚物可分别地在溶液中与二酸或二醇封 端的扩链剂混合，其后添加DCC。

聚合发生足够长的时间以获得0.1dl/g或更高的共聚物特性粘度(于 25℃在氯仿中测量)。低的聚合温度和短的聚合时间可阻止酯交换以便获 得相分离的形态并且单体分布与构建共聚物的预聚物中的一样。反之，高 分子量无规共聚物必须在较高温度下(>100℃)制备较长时间以获得所有 单体的完全并入。在那段时间内会发生酯交换反应并且获得更无规(即更 小嵌段)的单体分布。

通过在本体中(bulk)扩链获得的材料还可在挤出机中原位生产。

如果扩链剂是双官能的、脂肪族分子并且预聚物是直链的，那么可制 备直链共聚物；如果反应物之一(不论扩链剂还是至少一种预聚物)或二 者具有多于两种官能团，那么可在充分低转化率下获得支化结构。所述扩 链剂可以是双官能脂肪族扩链剂，优选地为二异氰酸酯例如1，4-丁烷二异 氰酸酯。

形成预聚物或单体的结晶相和无定形相的组合是以这样的方式选择 以获得具有期望的降解、溶胀、物理和热特性的相分离的链段化或嵌段共 聚酯或聚酯-碳酸酯。通常来说，特性粘度大于0.1dl／g并且小于10dl/g (于25℃在氯仿中测量)，优选地为0.1dl／g至2dl／g，并且更优选地为 0.2dl／g至1dl／g。

多嵌段链段化共聚物可使用任何已知的技术(例如，乳化工艺、挤出、 模制、溶剂浇铸、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、静电纺丝或冷冻干燥)来形 成为多种形状和尺寸的制剂。使用后者的技术来形成多孔材料。孔隙率可 通过添加共溶剂、非溶剂和／或溶出物进行调节。可将共聚物加工成(无 论是实心的或多孔的)微球、微粒、纳米球、杆、膜、片、喷雾剂、管、 膜、网、纤维、栓、包衣剂以及其它制品。产品可以是实心的、空心的或 (微)多孔的。可制备广泛的生物医学植入物(implant)以用于例如伤 口护理、皮肤复原、神经再生、血管假体、药物递送、半月板重建、组织 工程、手术器械的涂覆、韧带和肌腱再生、牙科和整形外科修复的应用中。 所述共聚物可单独使用或者可与其他可吸收的聚合物或不可吸收的聚合 物混合和／或共挤出。

此外，其可用于药物应用，例如用于药物递送，例如以微球、固体植 入物、凝胶剂、包衣剂、膜、片、喷雾剂、管、膜、网、纤维、栓及其他 构造的形式。

如将在以下实例中举例说明的，本发明的材料相比现有技术中所描述 的共聚物具有改善的特性，包括热特性、机械特性、加工特性。

在另一个方面，本发明涉及用于递送至少一种生物活性化合物(例如 生物活性小分子、蛋白质或肽)至宿主的组合物，其包含至少一种包封在 基质中的生物活性化合物，其中所述基质包含至少一种如本文所限定的相 分离的、热塑性多嵌段共聚物。

发现本发明的生物可降解的多嵌段共聚物特别适合作为用于多肽的 递送载剂，使多肽从基质受控释放至其环境，例如在对象的体内。

本发明的多嵌段共聚物具有多种选择来调节用于特定应用的递送组 合物的释放特性。生物活性化合物的释放速度可例如通过以下来提高：

·在预聚物(A)分子量恒定的情况下，提高预聚物(A)中水溶性聚合 物的分子量；

·提高预聚物(A)与预聚物(B)之间的摩尔比；

·提高在预聚物(A)中提供更快降解聚合物的单体的含量，例如通过 由D，L-丙交酯或乙交酯代替ε-己内酯或者通过用乙交酯代替D，L-丙交 酯；

·在预聚物(A)与预聚物(B)之间的摩尔比恒定的情况下，降低预聚 物(B)的分子量(这增加了预聚物(A)的重量百分比并且还降低了 预聚物(B)的T_m以及结晶相存在的总量)；

·在水溶性聚合物的分子量和预聚物(A)与预聚物(B)之间的摩尔比 恒定的情况下，降低预聚物(A)的分子量；和/或

·使用来源于水溶性聚合物的另外的、第三链段，由此提高水溶性聚合 物的含量。 通过与如上所提及的相反的改变以及通过以下改变可降低释放速度：

·提高链段B的T_m，例如通过以使得PLLA与PDLA之间发生立体络 合的比率使用PLLA和PDLA的混合物作为预聚物(B)(代替仅用 PLLA)；

·使用来源于水溶性聚合物二醇的另外的第三链段，由此使用二异氰酸 酯作为扩链剂并且水溶性聚合物的含量保持恒定或减少。相比在预聚 物(A)中的水溶性聚合物的更快降解酯键，使用较慢降解的聚氨酯 键来在多嵌段共聚物中构建第三链段中的水溶性聚合物。

可包含在多嵌段共聚物基质中的生物活性化合物包括但不限于分子 量一般为1000Da或更小的非肽、非蛋白质小尺寸药物以及生物活性多 肽，所述基质例如聚(D，L-乳酸)-共聚-PEG-共聚-聚(D，L-乳 酸)-b-PLLA-((PDLLA-共聚-PEG-共聚-PDLLA)-b-PLLA)基质或聚(ε-己 内酯)-共聚-PEG-共聚-聚(ε-己内酯)-b-PLLA((PCL-共聚-PEG-共聚 -PCL)-b-PLLA)基质。

可包含在聚醚酯聚氨酯基质(例如(PDLLA-共聚-PEG-共聚 -PDLLA)-b-PLLA基质或PCL-共聚-PEG-共聚-PCL)-b-PLLA基质)中 的非肽、非蛋白质小尺寸药物的实例包括但不限于抗肿瘤剂、抗微生物剂 包括抗生素、头孢菌素(sephalosporin)、氨基糖苷；大环内酯；四环素、 化疗剂包括磺酰胺；尿路抗菌剂(urinary tract antiseptic)；用于厌氧菌 感染的药物；用于结核病的药物；用于麻风病的药物、抗真菌剂、抗病毒 剂，抗蠕虫病药、抗炎、抗痛风剂、中枢作用(阿片类)镇痛药、局部麻 醉剂、用于帕金森氏病的药物、中枢作用肌肉松弛剂、激素和激素拮抗剂、 皮质类固醇、糖皮质类固醇、雄激素、雄激素类固醇、合成代谢类固醇、 抗雄激素、雌激素、雌激素类固醇、抗雌激素、孕激素；甲状腺药和抗甲 状腺药。

当小尺寸药物(例如上文所描述的那些)包含在(PDLLA-共聚-PEG- 共聚-PDLLA)-b-PLLA基质中时，共聚物的PEG组分的分子量优选地为 200g／mol至1500g／mol，优选600g／mol至1000g／mol，并且以共聚物重 量的5重量％至20重量％的量、优选地以共聚物重量的5重量％至10重 量％的量存在于共聚物中。一般来说，PLLA以共聚物重量的20重量％ 至90重量％的量、优选地以共聚物的30重量％至70重量％的量存在于 共聚物中。至少一种小尺寸药物分子可以以0.1重量％至80重量％、优 选1.0重量％至40重量％、最优选5重量％至20重量％的量存在于基质 中。如果期望提高多嵌段共聚物的亲水性，从而提高共聚物的降解速度和 所并入的生物活性化合物的释放速度，那么可通过由乙交酯部分或完全地 代替亲水链段的D，L-丙交酯和/或通过使用具有更高分子量的PEG组分 或者通过提高预聚物链段中PEG组分的重量分数来修饰共聚物。如果期 望降低聚合物的亲水性，并从而降低共聚物的降解速度和所并入的生物活 性化合物的释放速度，那么可通过由ε-己内酯部分地或完全地代替亲水链 段的D，L-丙交酯和/或通过使用具有较低分子量的PEG组分或者通过降 低预聚物链段中的PEG组分的重量分数来修饰共聚物。

由氨基酸组成的多肽通过肽键连接。短多肽也称为肽，而较长的多肽 通常称为蛋白质。一个惯例是将足够短以由成分氨基酸合成地制备的那些 多肽链称为肽而不是蛋白质。然而，随着更好的合成技术的出现，只要数 百个氨基酸就可以制备多肽，包括全蛋白质如泛素。另一个惯例是处于长 度约50个氨基酸的非正式分界线。这个定义有些任意。可以认为长的多 肽例如与阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)相关的淀粉样β肽是蛋 白质；并且可以认为小蛋白质例如胰岛素是肽。在任何情况下，本领域技 术人员将会理解，基本上任何类型的多肽都可以被包封并随后从共聚物基 质中释放。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含生物活性肽或者生物活性蛋 白质。包封的多肽优选地仅包含天然氨基酸，但可替选地使用非天然氨基 酸(即，自然界中不存在但是可以并入多肽链的化合物)和／或如本领域 已知的氨基酸类似物。此外，可修饰多肽中的一种或更多种氨基酸，例如， 通过添加化学实体例如碳水化合物基团、磷酸酯基团、法呢基、异法呢基、 脂肪酸基团、用于结合(conjugation)、官能化或其它修饰(例如α-酰胺 化)的连接剂等。

在一个优选的实施方案中，肽的修饰导致更加稳定的肽(例如体内更 长的半衰期)。这些修饰可包括肽的环化、D-氨基酸的并入等。所有修饰 基本上都不干扰肽所需的生物活性。在一些实施方案中，肽的修饰导致更 多生物活性的肽。

生物活性多肽优选地选自：蛋白质／肽类药物、酶、受体配体、神经 递质、抑制肽、调节肽、活化肽、细胞因子类、生长因子、单克隆抗体、 单克隆抗体片段、抗肿瘤肽、抗生素、抗原、疫苗以及激素。在US-A-5 980 948和Crommelin等，Int.J.Pharm.2003，266(1-2)，3-16中提及了待包封 的示例性多肽。当然，也可以设想包封两种或更多种不同的(生物活性) 多肽。

多肽的大小可不同。在一个实施方案中，多肽的分子量为10000Da 或更小。发现这种大小的多肽特别适于包封在包含PEG作为预聚物(A) 链段和/或作为另外的预聚物的共聚物基质中，所述PEG的数均分子量为 400g／mol至3000g／mol，优选600g／mol至1500g／mol。可替选地或另外 地，基于共聚物的总重量，所述PEG的存在量为5重量％至60重量％， 优选5重量％至40重量％。

在另一个实施方案中，所述多肽是分子量为10000Da或更大的生物 活性蛋白质。这些较大的多肽优选地包封在包含PEG作为预聚物(A) 的链段和/或作为另外的预聚物的共聚物基质中，并且其中所述PEG的数 均分子量为600g／mol至5000g／mol，优选1000g／mol至3000g／mol和／ 或其中基于共聚物的总重量，所述PEG的存在量为5重量％至70重量％， 更优选10重量％至50重量％。

本发明的组合物可具有任何期望的外观或形状。在一个实施方案中， 本发明的多嵌段共聚物是以微球、微粒、喷雾剂、植入物、包衣剂、凝胶 剂、膜、箔、片、膜或者杆的形式加工的。

一个特定的方面涉及微球形式的组合物。通常微球是直径小于1000 μm的微细球形颗粒，并且包含生物活性化合物。微球可以是均匀的或整 体微球，其中生物活性化合物溶解或分散在整个聚合物基质中。也有可能 微球是在其中生物活性化合物是由单核或多核态的聚合物包围的储库 (reservoir)类型。当生物活性化合物是小型水溶性药物时，该药物可首 先分散在疏水性或亲脂性赋形剂中，然后其组合以颗粒、滴或微混悬剂的 形式分散在聚合物基质中。然后可由乳液形成微球。

微球可通过本领域技术人员已知的技术来制备，包括但不限于，团聚、 溶剂萃取／蒸发、喷雾干燥或喷雾冷冻干燥技术。

在一个实施方案中，通过溶剂萃取／蒸发技术制备微球，所述溶剂萃 取／蒸发技术包括在有机溶剂(例如二氯甲烷)中溶解多嵌段共聚物，在 包含乳化剂(例如聚乙烯醇(如由Okada，Adv.Drug Del.Rev.1997，28(1)， 43-70等所描述的)的水相中乳化多嵌段共聚物溶液。

如此形成的微球的特性(例如颗粒大小、孔隙率和载药量)取决于工 艺参数，例如聚乙烯醇水相的粘度或浓度、多嵌段共聚物溶液的浓度、二 氯甲烷与活性物质水溶液的比率、初级乳剂与聚乙烯醇相的比率以及搅拌 速度。

当通过喷雾干燥方法形成微球时，使用有机溶剂(例如二氯甲烷)中 的0.5重量％至5重量％、优选地约为2重量％的低浓度多嵌段共聚物。 喷雾干燥通常导致多孔的、不规则形状的颗粒的形成。

随着微球的形成，将生物活性化合物包封在微球或微粒中。一般来说， 当使用溶剂萃取／蒸发技术来包封亲脂性化合物时，首先将化合物溶解在 多嵌段共聚物在有机溶剂(例如二氯甲烷或乙酸乙酯)中的溶液中。然后 将有机溶液接着在聚乙烯醇水溶液中乳化，其产生水包油(O／W)乳液。 然后将有机溶剂萃取到水相中并蒸发以固化微球。

一般来说，当使用溶剂蒸发技术来包封水溶性化合物时，首先将化合 物的水溶液在多嵌段共聚物在有机溶剂(例如二氯甲烷)中的溶液中乳化。 然后将该初级乳剂接着在聚乙烯醇水溶液中乳化，其产生水包油包水 (W／O／W)乳液。然后将有机溶剂(例如二氯甲烷或乙酸乙酯)类似于 O／W工艺路线萃取以固化微球。或者，可将水溶性药剂直接分散在多嵌 段共聚物在有机溶剂中的溶液中。然后将获得的分散体接着在包含表面活 性剂(例如聚乙烯醇)的水溶液中乳化，其产生水包油包固体(S／O／W) 乳液。然后将有机溶剂类似于O／W工艺路线萃取以固化微球。

当使用W／O／W和S／O／W乳化路线来包封水溶性化合物时，获得具 有充分包封率微球可能是有挑战性的。由于化合物的水溶性特征，部分化 合物可损失到水性萃取介质(例如聚乙烯醇水溶液)中。可在内部水相中 使用增粘剂(例如明胶)以减少内部水相中的化合物到外部水相的扩散。 此外，可以向外部水相添加添加剂以降低化合物在外部水相中的溶解性。 为了此目的，可使用盐或者可调节pH。

油包油包水(W／O／O)或油包油包固体(S／O／O)乳化路线提供了令 人感兴趣的选择以获得具有充分包封率的微球。在W／O／O工艺中，类似 于W／O／W工艺，将生物活性化合物溶解在水性溶液中并且用聚合物在有 机溶剂(例如通常是二氯甲烷或乙酸乙酯)中的溶液乳化。随后，在搅拌 下接着慢慢添加聚合物沉淀剂(例如硅油)以形成初期微粒，然后将其倾 倒入庚烷或己烷中以萃取硅油和有机溶剂并且固化微球。可通过真空过滤 收集微粒，用另外的溶剂冲洗并在真空下干燥。在S／O／O乳化路线中， 类似于S／O／W工艺，将生物活性化合物作为固体粉末分散在聚合物在有 机溶剂中(例如二氯甲烷或乙酸乙酯)的溶液中。随后，在搅拌下接着慢 慢添加聚合物沉淀剂(例如硅油)以形成初期微粒，然后将其倾倒入庚烷 或己烷中以萃取硅油和二氯甲烷并固化微球。

可向蛋白质水溶液中添加稳定剂以防止在加工成微球期间蛋白质活 性损失。这样的稳定剂的实例是人血清白蛋白、明胶和碳水化合物例如海 藻糖、菊粉和蔗糖。

当使用喷雾干燥技术时，将化合物的水溶液在共聚物在有机溶剂(例 如二氯甲烷)中的溶液中乳化，如上文所描述的。然后使用喷雾干燥器来 喷雾干燥油包水乳液。

在另一些实施方案中，本发明的组合物为包衣剂、可注射凝胶剂、植 入物(优选地注射用植入物)或包衣的植入物的形式。包衣剂形式的组合 物可作为药物洗脱包衣应用，例如应用在医学植入物中，例如血管或泌尿 支架、矫形假体或眼植入物。

可通过挤出将生物活性化合物配制成注射用固体植入物。通常来说， 将所述化合物和多嵌段共聚物粉末物理混合后，将所得的粉末共混物引入 挤出机中，加热并处理以得到所需形状和尺寸的制剂，例如小直径的圆柱 杆。代替化合物和多嵌段共聚物的粉末的物理混合，可将该化合物与聚合 物共同溶解在合适溶剂中或者可制备在聚合物在合适溶剂中的溶液中的 化合物分散体，随后进行冷冻干燥和冷冻干燥粉末的挤出。后者一般地改 善了共混均匀性和植入物的含量均匀度。

在另一个方面，本发明涉及向有此需要的对象递送生物活性化合物的 方法，其包括向所述对象施用有效剂量的如本文所限定的组合物。

所述对象通常为哺乳动物，优选地为人。然而，还涵盖了本发明的兽 医用途。该方法可以具有治疗、预防和／或化妆品目的。根据具体情况可 选择任何合适的施用方式。例如，施用可包括该组合物的肠胃外、经口、 动脉内、关节内、静脉内、眼内、硬膜外、鞘内、肌内、腹膜内、静脉内、 阴道内、直肠、局部或皮下施用。在一个实施方案中，本发明提供了用于 向有此需要的对象递送目的生物活性多肽的方法，其包括向所述对象施用 有效剂量的根据本发明的组合物，其中所述组合物为微球、注射用植入物 或原位形成的凝胶剂的形式并且其中所述组合物经眼内、动脉内、肌内或 皮下施用。

对于局部施用，微球可包含在凝胶剂、霜剂或软膏剂中并且如果期望 的话，可通过阻挡层(barrier)覆盖。因此，微球可包含用于治疗皮肤疾 病(例如银屑病、湿疹、皮脂溢和皮炎)的一种或更多种生物活性化合物。

在另一个实施方案中，微球可包含在凝胶剂中，所述凝胶剂例如透明 质酸凝胶或者大分子多糖凝胶。这样的实施方案特别适用于肠胃外应用， 例如手术期间和手术后。

当通过注射施用时，微球可包含在药物载体中，所述药物载体例如水、 盐水溶液(例如0.9％)或者含有0.1％w／v至0.5％w／v的量的表面活性 剂的溶液。可使用的表面活性剂的实例包括但不限于，吐温80表面活性 剂。药物载体还可包含增粘剂，例如羧甲基纤维素钠。

当通过注射施用时，微球的平均大小为1μm至200μm，优选5μm 至100μm，最优选10μm至50μm。当这样的微球与可药用载体组合施 用时可用于治疗多种疾病或病症，取决于所包封的生物活性化合物。因此， 包括本发明微球的可注射制剂可用于治疗全身性疾病例如类风湿性关节 炎、肝炎、糖尿病或代谢综合征，和局部受限的疾病例如骨关节炎、肾脏 疾病、炎症、局部疼痛过程、局部感染、局部皮肤疾病、肿瘤(或在其手 术切除后的部位作为术后治疗以摧毁任何可能残留的肿瘤细胞)、前列腺 癌或乳腺癌、agromegaly、眼部疾病(例如年龄相关的黄斑变性)、局部 脑疾病(例如帕金森氏病)以及心血管疾病(例如急性心肌梗死、慢性心 脏衰竭)或关节硬化。这样的可注射制剂还可用于长期治疗例如用皮质类 固醇、雄激素、抗雄激素、雌激素、抗雌激素、孕激素(progestangenic agent) 或甲状腺激素，或者用抗结核病、抗麻风病、或抗疟疾药物治疗。

附图说明

图1A：50LP10L20-LL40的DSC差示热分析图

图1B：30LP30L40-LL40的DSC差示热分析图

图1C：50CP10C20-LL40的DSC差示热分析图

图2：溶菌酶从由30LP10L20-LL40、50LP10L20-LL40、 70LP10L20-LL40、50CP10C20-LL40和30CP30C40-LL40构成的膜中的 累积释放。膜加载有10重量％的溶菌酶。在37℃于pH7.4的磷酸盐缓冲 液中测量释放(n=3)。

图3：牛血清白蛋白(BSA)从由30LP10L20-LL40、50LP10L20-LL40、 70LP10L20-LL40、30LP30L40-LL40和30CP30C40-LL40构成的膜中的 累积释放。膜加载有10重量％的BSA。在37℃于pH7.4的磷酸盐缓冲 液中测量释放(n=3)。

图4：多嵌段共聚物的亲水性嵌段的组分对溶菌酶从膜的累积释放的 作用。膜由50LP10L20-LL40、50GP10C20-LL40或50CP10C20-LL40(25 重量％PEG1000)构成并且加载有10重量％的溶菌酶。在37℃于pH7.4 的磷酸盐缓冲液中测量释放(n=3)。

图5：作为时间的函数的从由30LP10L20-LL40或50LP10L20-LL40 构成的含有10重量％溶菌酶(37℃，pH7.4的磷酸盐缓冲液)的膜释放 的溶菌酶活性以及在4℃和37℃贮存的溶菌酶溶液(0.01重量％，pH7.4 的磷酸盐缓冲液)的溶菌酶活性(n＝3)。

图6：在37℃于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，BSA从由 30LP10L20-LL40和50CP10C20-LL40组成的加载有3重量％至4重量 ％BSA的微球的体外释放(n=3)。

图7：IGF-1从通过W／O的溶剂浇铸制备的加载有IGF-1的 50CP30C40-LL40和30CP30C40-LL40膜的体外释放。在37℃于pH7.2 的磷酸盐缓冲液中测量释放(n=3)。实线表示由UPLC测量的IGF-1释 放。虚线表示由ELISA测量的iGF-1释放。

图8：通过W／O／W双乳化路线制备的加载有0.2重量％IGF-1的 50CP10C20-LL40微球的SEM照片。

图9：iGF-1从由具有不同IV的50CP10C20-LL40制备的加载有0.2 重量％IGF-1的微球的体外释放。在37℃于pH7.2的磷酸盐缓冲液中测 量释放(n=3)。

图10：从具有0.2重量％IGF-1目标加载并且在1周和2周之后使用 多种ultra-turrax速度制备的50CP10C20-LL40微球释放的IGF-1的SDS PAGE结果。

图11：蛋白质A(MW 15 000 Da)从由20LP10L20-LL40、 30LP6L20-LL40和30CP10C20-LL40构成的膜(蛋白质A含量为5重量 ％；膜厚度80μm至120μm)的体外释放。在37℃于pH7.4的磷酸盐缓 冲液中测量释放(n=3)。

图12：使用内部水相中多种量的菊粉制备的由30CP10C20-LL40(IV 0.71dl／g)构成的加载有3重量％至4重量％蛋白质A的微球的SEM照片。 A：0％的菊粉，B：2％的菊粉。1：纵览，2：放大。

图13：蛋白质A从由30CP10C20-LL40构成的具有3重量％至4重 量％蛋白质A目标加载以及任选地2重量％或5重量％的共包封菊粉的 微球中在37℃于pH7.4的磷酸盐缓冲液中的体外释放(n=3)。

图14：蛋白质A从由30CP10C20-LL40构成的具有3重量％至4重 量％蛋白质A目标加载以及不同聚合物IV的微球中在37℃于pH7.4的 磷酸盐缓冲液中的体外释放(n=3)。

图15：从具有4重量％蛋白质A和2重量％菊粉目标加载的 30CP10C20-LL40微球中于1天(泳道4)、7天(泳道7)、14天(泳道 8)和21天(泳道9)之后释放的蛋白质A的SDS-PAGE结果。泳道5： 分子量标记物。泳道6：标准蛋白质A。注意，暗涂片是由于磷酸缓冲盐 的着色。

图16：肽A(MW2500)从加载的由20LP10L20-LL40构成的(加 载5重量％和10重量％的肽；膜厚度为80μm至100μm)膜的体外释放。 在37℃于pH7.4的磷酸盐缓冲液中测量释放(n=3)。

图17：肽A(MW2500)从由20LP10L20-LL40构成的微球(颗粒 大小30μm；加载10重量％的肽)中的体外释放。在37℃于pH7.4的磷 酸盐缓冲液中测量释放(n=3)。

图18：雷帕霉素(rapamycin)从由20LP1020-LL40和 10LP10L20-LL40的多种共混物构成的微球中的体外释放。

图19：通过W／O／O方法制备的加载有戈舍瑞林的20LP1020-LL40 微球的SEM图片。

图20：戈舍瑞林从通过W／O／O方法制备的20LP1020-LL40微球中 的体外释放。

实施例

在以下实施例中合成了多种生物可降解的半结晶的、相分离的多嵌段 共聚物并且评估了其加工和受控释放特性。所述聚合物由具有熔点(T_m) 的基于结晶L-丙交酯的硬链段B和具有在生理条件下玻璃转化温度(T_g) 低于体温的基于亲水性聚(乙二醇)(PEG)的链段A构成。在以下实施例 中PEG用其分子量(MW)表示。例如PEG₁₀₀₀是指具有MW1000g／mol 的PEG。

实施例1

在该实施例中，提供了用于制备聚(DL-丙交酯-共聚-PEG)预聚物(A) 的一般方法。在氮气氛下将单体称入三颈瓶中并且在乙交酯和D，L-丙交 酯的情况下在减压下于50℃干燥至少16小时。将PEG在减压下于90℃ 干燥至少16小时。在氮气氛下将PEG添加至单体。然后，添加辛酸亚锡， 磁力搅拌混合物并且在140℃反应数天。在以300MHz操作的VXR Unity Plus NMR Machine(Varian)上进行¹H-NMR。d₁等待时间设置为20s， 并且扫描次数为16次。从0ppm至14ppm记录谱。由¹H-NMR确定转 化率和预聚物M_n。通过将10mg聚合物溶解至1ml氘代氯仿中来制备 ¹H-NMR样品。

实施例2

该实施例描述了M_n为2000g／mol的聚(DL-丙交酯-共聚-PEG₁₀₀₀) (pLP10L20)的制备。称取149.84g(1.04mol)DL-丙交酯(Purac)并 且添加149.21g(0.149mol)PEG MW1000(Ineos，PU级)。添加71.6mg 辛酸亚锡(Sigma Corp)(单体/催化剂的摩尔比=5900)，磁力搅拌混合物 并且在140℃反应245小时。¹H-NMR示出了94.8％的单体转化率。按重 量计计算的分子量(M_n)为2000g／mol。通过¹H-NMR确定的分子量是 1950g／mol。

实施例3

该实施例描述了M_n为4000g／mol的聚(DL-丙交酯-共聚-PEG₃₀₀₀) (pLP30L40)的制备。称取50.35g(0.349mol)DL-丙交酯(Purac)并 且添加151.08g(50.4mmol)PEG MW3000(Sigma Corp)。添加37.5mg 辛酸亚锡(Sigma Corp)(单体/催化剂的摩尔比=4300)，磁力搅拌混合物 并且在140℃反应90小时。¹H-NMR示出了93.4％的单体转化率。按重 量计计算的分子量(M_n)为4000g／mol。通过¹H-NMR确定的分子量是 3940g／mol。

实施例4

该实施例描述了M_n为2000g／mol的聚(ε-己内酯-共聚-PEG₁₀₀₀)预聚 物(pCP10C20)的制备。在氮气氛下将100.81g(0.101mol)PEG MW1000 (Ineos，PU级)称入三颈瓶中并且在减压下于90℃干燥至少16小时。 在氮气氛下将101.76g(0.892mol)ε-己内酯(Acros，预先干燥并且经过 CaH₂在减压下蒸馏)添加到PEG中并且将该混合物加热至135℃。添加 57.9mg辛酸亚锡(Sigma Corp)(单体/催化剂的摩尔比=6200)，磁力搅 拌混合物并且在135℃反应76小时。¹H-NMR示出了100％的单体转化率。 按重量计计算的分子量(M_n)为2010g／mol。通过¹H-NMR确定的分子 量是1950g／mol。

实施例5

该实施例描述了M_n为4000g／mol的聚(ε-己内酯-共聚-PEG₃₀₀₀)预聚 物(pCP30C40)的制备。在氮气氛下将176.60g(58.9mmol)PEG MW3000 (Ineos，PU级)称入三颈瓶中并且在减压下于90℃干燥至少16小时。 在氮气氛下将59.4g(0.520mol)ε-己内酯(Acros，预先干燥并且经过 CaH₂在减压下蒸馏)添加到PEG中并且将混合物加热至135℃。添加69.6 mg辛酸亚锡(Sigma Corp)(单体/催化剂的摩尔比=3000)，磁力搅拌混 合物并且在135℃反应243小时。¹H-NMR示出了100％的单体转化率。 按重量计计算的分子量(M_n)为2010g／mol。通过¹H-NMR确定的分子 量是1950g／mol。

实施例6

该实施例描述了由1，4-丁二醇(BDO)起始的M_n=4000g／mol的聚(L- 乳酸)预聚物(LL4000)的制备。在氮气氛下将399.89g(2.77mol)L- 丙交酯(Purac)称入三颈瓶中并且在减压下于50℃干燥至少16小时。 在氮气氛下将9.36g(0.104mol)BDO(Acros，预先在减压下蒸馏)添 加到L-丙交酯中。添加434ml二烷(Acros，预先干燥并且经过钠线蒸 馏)以溶解所述L-丙交酯和BDO并且将混合物加热至80℃。添加87.8mg 辛酸亚锡(Sigma Corp)(单体/催化剂的摩尔比=12800)。磁力搅拌混合 物并且在80℃反应50.6小时。通过冷冻干燥72小时至最终温度50℃来 从二烷中重新得到聚合物。在聚合物溶解在二烷中的情况下，首先在 减压下于50℃除去二烷。¹H-NMR示出了96.5％的单体转化率。按重 量计计算的分子量(M_n)为3940g／mol。通过¹H-NMR确定的分子量是 3900g／mol。在冷冻干燥之后，通过¹H-NMR(300MHz，将50mg聚合 物溶解于1ml氘代氯仿中，d1=30s，32次扫描)确定二烷的含量。将 5mg二溴苯(Acros)溶解于样品中以量化二烷。发现二烷含量为1193 ppm。

实施例7

该实施例描述了用于制备多嵌段共聚物的一般过程。将ε-己内酯-共 聚-PEG-共聚-ε-己内酯(CPC)或D，L-丙交酯-共聚-PEG-共聚-D，L-丙交 酯预聚物(LPL)(M_n为2000g／mol)加热至50℃至80℃直到其变得更 具流动性。将适当量的LL4000预聚物(M_n为4000g／mol)和CPC或LPL 预聚物称入配置有氮气入口的玻璃安瓿瓶中并且在50℃干燥至少48小 时。然后，给玻璃安瓿瓶配置机械搅拌。将1，4-二烷(Acros，经过钠 蒸馏)添加到浓度为30重量％的聚合物中并且将安瓿瓶的内容物加热至 80℃以溶解预聚物。添加0.900当量至0.990当量(相对于预聚物羟基) 的1，4-丁烷二异氰酸酯(Bayer，在减压下蒸馏)并且将反应混合物机械 搅拌16小时至22小时。将未蒸馏的二烷添加到浓度为20重量％的聚 合物中以淬灭未反应的异氰酸酯基团。用未蒸馏的二烷进一步稀释反应 混合物至聚合物浓度为10重量％。将安瓿瓶冷却至室温，将反应混合物 倒入浅盘并且在-18℃冷冻。然后，通过将冷冻的反应混合物在30℃置于 真空下来除去二烷。在-18℃将聚合物贮存密封包装中。分析该批次的 一小部分用于分析热特性(mDSC)、二烷含量(气相色谱法)、特性粘 度和聚合物组成(¹H-NMR)。通过调制式差示扫描量热(Modulated  Differential Scanning Calorimetry)(mDSC)进行热分析。将5mg至10 mg样品称入DSC盘中。使用调制好的温度程序在DSC Q1000(TA仪) 上进行测量。振幅设为1℃，调制周期为60s并且加热速度为5℃/分钟。 将样品从-80℃加热到100℃至200℃(取决于聚合物的类型)。使用配备 有包括水浴的Schott AVS-450粘度计的Ubbelohde粘度计(DIN)，型号 0C、0a或I，Schott 来测量特性粘度。在室温下于氯仿中进行测 量。氯仿中的聚合物浓度使得相对粘度在1.2至2.0的范围内。使用 GC-FID顶空法确定二烷含量。在配备有安捷伦柱(Agilent Column， DB-624／30m／0.53mm)的GC-FID Combi进样器上进行测量。在DMSO 中制备样品。使用二烷校准标准品确定二烷含量。

实施例8

该实施例描述了20(D，L-丙交酯-共聚-PEG₁₀₀₀-共聚-D，L-丙交 酯)₂₀₀₀-80(L-丙交酯)₄₀₀₀(20LP10L20-LL40)的制备。称取42.02g的LL40 预聚物(M_n为4040g／mol，10.40mmo1)和10.16g的D，L-丙交酯-共聚 -PEG₁₀₀₀-D，L-丙交酯预聚物(M_n为2000g／mol，5.08mmol)并且于80 ℃溶解在100ml的1，4-二烷中。添加1.8466g(13.2mmol)的1，4-丁烷 二异氰酸酯(相对于预聚物羟基为0.851当量)以及20ml的1，4二烷。 17小时之后，用88ml未蒸馏的二烷淬灭反应并用255ml未蒸馏的二烷进一步稀释。通过将冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除去二烷。

实施例9

该实施例描述了30(D，L-丙交酯-共聚-PEG₁₀₀₀-共聚-D，L-丙交 酯)₂₀₀₀-70(L-丙交酯)₄₀₀₀(30LP10L20-LL40)的制备。称取34.44g的LL40 预聚物(M_n为4020g／mol，8.57mmol)和14.95g的D，L-丙交酯-共聚 -PEG₁₀₀₀-D，L-丙交酯预聚物(M_n为2040g／mol，7.33mmol)并且于80 ℃溶解在100ml的1，4-二烷中。添加2.7386g(19.5mmol)的1，4-丁烷 二异氰酸酯(相对于预聚物羟基为1.231当量)以及20ml的1，4二烷。 20小时之后，用85ml未蒸馏的二烷淬灭反应并且用240ml未蒸馏的 二烷进一步稀释。通过将冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除去 二烷。

实施例10

该实施例描述了50(D，L-丙交酯-共聚-PEG₁₀₀₀-共聚-D，L-丙交 酯)₂₀₀₀-50(L-丙交酯)₄₀₀₀(50LP10L20-LL40)的制备。称取19.59g的LL40 预聚物(M_n为4060g／mol，4.83mmol)和19.57g的D，L-丙交酯-共聚 -PEG₁₀₀₀-D，L-丙交酯预聚物(M_n为2040g／mol，9.59mmol)并且于80 ℃溶解在78ml的1，4-二烷中。添加2.0018g(14.3mmol)的1，4-丁烷 二异氰酸酯(相对于预聚物羟基为0.991当量)到20ml的1，4二烷中 的。20小时之后，用67ml未蒸馏的二烷淬灭反应并用189ml未蒸馏 的二烷进一步稀释。通过将冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除 去二烷。

实施例11

该实施例描述了70(D，L-丙交酯-共聚-PEG₁₀₀₀-共聚-D，L-丙交 酯)₂₀₀₀-30(L-丙交酯)₄₀₀₀(70LP10L20-LL40)的制备。称取8.59g的LL40 预聚物(M_n为4020g／mol，2.14mmol)和19.96g的D，L-丙交酯-共聚 -PEG₁₀₀₀-D，L-丙交酯预聚物(M_n为2040g／mol，9.78mmol)并且于80 ℃溶解在48ml的1，4-二烷中。添加1.648g(11.8mmol)的1，4-丁烷二 异氰酸酯(相对于预聚物羟基为0.986当量)以及20ml的1，4二烷。 21小时之后，用49ml未蒸馏的二烷淬灭反应，并且用147ml未蒸馏 的二烷进一步稀释。通过将冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除 去二烷。

实施例12

该实施例描述了30(D，L-丙交酯-共聚-PEG₃₀₀₀-共聚-D，L-丙交 酯)₄₀₀₀-70(L-丙交酯)₄₀₀₀(30LP30L40-LL40)的制备。称取29.96g的LL40 预聚物(M_n为4030g／mol，7.43mmol)和14.01g的D，L-丙交酯-共聚 -PEG₁₀₀₀-D，L-丙交酯预聚物(M_n为4000g／mol，3.50mmol)并且于80 ℃溶解在83ml的1，4-二烷中。添加1.52g(10.8mmol)的1，4-丁烷二 异氰酸酯(相对于预聚物羟基为0.992当量)以及20ml的1，4二烷。 21小时之后，用74ml未蒸馏的二烷淬灭反应并用222ml的未蒸馏的 二烷进一步稀释。通过将冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除去 二烷。

实施例13

该实施例描述了50(ε-己内酯-共聚-PEG₁₀₀₀-共聚-ε-己内酯)₂₀₀₀-50(L- 丙交酯)₄₀₀₀(50CP10C20-LL40)的制备。称取24.34g的LL40预聚物(M_n为4030g／mol，6.04mmol)和23.87g的ε-己内酯-共聚-PEG1000-ε；-己内酯 预聚物(M_n为2010g／mol，11.9mmol)并且于80℃溶解在95ml的1，4- 二烷中。添加2.4098g(17.2mmol)的1，4-丁烷二异氰酸酯(相对于预 聚物羟基为0.960当量)以及20ml的1，4二烷。18小时之后，用82ml 未蒸馏的二烷淬灭反应并且用246ml未蒸馏的二烷进一步稀释。通过 将冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除去二烷。

实施例14

该实施例描述了30(ε-己内酯-共聚-PEG₃₀₀₀-共聚-ε-己内酯)₄₀₀₀-70(L- 丙交酯)₄₀₀₀(30CP30C40-LL40)的制备。称取35.84g的LL40预聚物(M_n为4030g／mol，8.89mmol)和14.79g的ε-己内酯-共聚-PEG₃₀₀₀-ε-己内酯 预聚物(M_n为4010g／mol，3.69mmol)并且于80℃溶解在100ml的1，4- 二烷中。添加1.7428g(12.4mmol)的1，4-丁烷二异氰酸酯(相对于预 聚物羟基为0.988当量)以及20ml的1，4二烷。18小时之后，用83ml 未蒸馏的二烷淬灭反应并用240ml未蒸馏的二烷进一步稀释。通过将 冷冻的反应混合物在30℃置于真空下来除去二烷。

实施例15

分析合成的多嵌段共聚物的化学组成、分子量和残留二烷含量。表 1示出对20LP10L20-LL40、30LP10L20-LL40、50LP10L20-LL40、 70LP10L20-LL40、30LP30L40-LL40、50CP10C20-LL40、 30CP30C40-LL40所收集的分析结果。所述共聚物的实际组成，如通过 ¹H-NMR从良好类似于目标组成的L／P和C／P摩尔比来确定。所有聚合 物的特性粘度均在0.7dl／g至1.1dl／g之间。二烷含量大大低于1000 ppm，表明通过真空干燥有效的除去了二烷。

分析所述多嵌段共聚物的热特性以确定其相分离的形态。结果在表2 中示出。图1示出了50LP10L20-LL40(图1A)、30LP30L40-LL40(图 1B)和50CP10C20-LL40(图1C)多嵌段共聚物的典型DSC热分析图。 所有多嵌段共聚物均表现出约120℃至133℃的熔化温度(T_m)，由于LL40 链段的熔化。如所预期的，结晶的LLA40链段的熔化焓(ΔH_m)随链段 量的增加而增加。70LP10L40-LL40、50CP10C20-LL40也表现出约85℃ 的T_m，这归因于LL40的不完美晶体的熔化。含有PEG3000的共聚物示 出约40℃的T_m，由于PEG的熔化。所述多嵌段共聚物的玻璃转化温度 (Tg)一般在预聚物(A)的T_g与预聚物(B)的T_g之间，表明无定形 预聚物(A)与预聚物(B)的无定形内容物的相混合。当LLA40链段从 30重量％增加至80重量％时，LP10L20-LL40型多嵌段共聚物的T_g从-18 ℃提高至50℃。这些多嵌段共聚物的T_g在预聚物(A)(pLP10L20，T_g-37 ℃)的T_g与预聚物(B)(LL40，T_g～50℃)的T_g之间并且因此归因于 半结晶的LL40嵌段的无定形聚丙交酯与PEG的混合。50CP10C20-LL40 的T_g为-48℃，其类似地归因于无定形PEG、聚己酸内酯和聚丙交酯的混 合。表3示出所述多嵌段共聚物的溶胀度。为了测量聚合物的溶胀特性， 通过将二氯甲烷中的13重量％的聚合物溶液(约300毫克的聚合物与1.5 ml二氯甲烷)倾倒在玻璃板上并且用流延刀铺展聚合物溶液或者倾注到 Teflon^TM模具中来制备聚合物膜。将二氯甲烷放置过夜慢慢蒸发并且通过 在20℃真空干燥除去残留的二氯甲烷。产生的膜厚度为100μm至200 μm。为了溶胀测试，称取15mg至40mg直径约25mm的圆形膜并且浸 入含有10ml pH为7.4的磷酸盐缓冲液(ISO-15814)的烧瓶中。将样品 贮藏在37℃烘的箱中。在每个取样时间点，收集样品并且将过量的缓冲 液从表面除去，之后将样品称重并保留4位小数。所有测试均进行两次。 发现溶胀度随着共聚物的PEG含量以及随着在大约恒定的PEG含量下的 PEG MW而逐渐增加。

实施例16

在该实施例中，评估了上述实施例中所描述的多种亲水性相分离的多 嵌段共聚物的蛋白质释放特征，使用牛血清白蛋白(BSA，69kDa)和溶 菌酶(14kDa)作为模型蛋白质。

通过将约150μl的20重量％蛋白质溶液与1.5ml的含有300mg的 聚合物的二氯甲烷用Ultra turrax以18000rpm混合30s来制备含有10 重量％蛋白质的加载有蛋白质的膜。将乳液用流延刀铺展在玻璃板上或倾 倒在Teflon^TM模具中。将二氯甲烷放置过夜慢慢蒸发并且通过真空干燥在 20℃除去残留的二氯甲烷。得到的膜的厚度为80μm至120μm。

对于释放测试，将加载有20mg蛋白质的膜称重并且浸入含有5ml 的pH7.4的磷酸盐缓冲液的小瓶中并贮藏在37℃的烘箱中。在每个取样 点，取出1ml的释放介质并且用1ml的新鲜缓冲液替换。用双金鸡宁酸 (Bicinchoninic Acid(BCA))测定法(Pierce)使用Easys Expert96孔 板读板器确定释放样品的蛋白质含量。

通过细菌溶胞测试测量释放的溶菌酶的生物活性。如上文描述的来制 备加载有溶菌酶的膜。通过称取2.1mg的溶菌酶并添加20ml磷酸盐缓 冲液来制备0.01重量％的溶菌酶溶液以作为对照。将加载有溶菌酶的膜 称重并浸入含有5ml的pH7.4的磷酸盐缓冲液的小瓶中。将含有加载有 溶菌酶的膜以及新鲜制备的溶菌酶溶液的小瓶贮藏在37℃的烘箱中。在 每个取样点，取出1ml的释放介质并且用1ml的新鲜缓冲液替换。通过 如上所描述的BCA确定释放样品的蛋白质含量。(释放的)溶菌酶的活性 通过随后向其中添加10μl样品的细菌分散体(溶壁微球菌Micrococcus  lysodeikticus，Sigma，0.21mg／ml)在450nm处保持3分钟的浊度变化 来确定。为此目的使用了UV-VIS分光光度计(Varian)。如有必要，对 样品进行稀释以获得浓度为5μg／ml至100μg／ml的溶菌酶。通过比较所 获得曲线的斜率(与溶菌酶活性相关的斜率)与从新鲜的溶菌酶溶液获得 的曲线的斜率来计算样品的溶菌酶活性。

图2和图3分别示出了溶菌酶和牛血清白蛋白从膜的释放。结果示出 通过改变PEG含量和PEG MW可改变释放速度和特征(profile)。溶菌 酶释放经过的周期从几天多至约3个月不等。由于其较大的大小，BSA 的释放速度较低导致释放经过周期范围为几天多至约4个月。此外，溶菌 酶的释放可通过引入相邻于多嵌段共聚物的亲水性嵌段中PEG基团的不 同单体(的组合)来调节。得到的多嵌段共聚物(50LP10L20-LL40、 50GP10C20-LL40和50CP10C20-LL40)含有25重量％的PEG1000并且 表现出类似的溶胀度，但是对于包封的溶菌酶，不同的降解速度导致不同 的释放特征(图4)。

图5示出从加载有10重量％溶菌酶的30LP10L20-LL40或 50LP10L20-LL40的膜(pH7.4的磷酸盐缓冲液，37℃)释放的溶菌酶的 活性。作为对照，测量了贮藏在4℃或37℃的0.01重量％的溶菌酶溶液4 的溶菌酶活性(pH7.4的磷酸盐缓冲液)。结果示出从膜释放的溶菌酶经 过约1个月的时间仍保留其生物活性，这表明溶菌酶的结构完整性和生物 活性不仅在包封过程期间而且在溶菌酶在水合的和溶胀的聚合物基质中 于37℃释放前的长期存在期间是被保护的。

实施例17

在该实施例中，使用30LP10L20-LL40(IV0.85dl/g)和 50CP10C20-LL40(IV1.06dl／g)型相分离的共聚物来将BSA配制到微球 中。

加载有BSA的微球由50CP10C20-LL40(IV1.06dl／g)和30LP10L20- LL40(IV0.85dl/g)亲水性相分离的多嵌段共聚物通过使用如Kissel等， J.Contr.Rel.1996，39(2)，315-326和Meinel等，J.Contr.Rel.2001，70(1-2)， 193-202所公开的过程的溶剂蒸发方法来制备。将BSA(25mg至50mg) 溶解在约150mg超纯水中并且用2ml至3ml的50CP10C20-LL40(15％ w／v)或30LP10L20-LL40(23％w／v)在二氯甲烷中的溶液使用Ultra turrax  IKA T18以20000rpm操作进行60s乳化得到油包水(W／O)乳液。如 此获得的初级乳液接着使用Ultra turrax IKA T18以14000rpm操作在约 80ml至130ml的含有4.0重量％PVA的UP水中进行30s乳化得到水包 油包水(W／O／W)乳液。如此获得的次级乳液在室温下以600rpm轻轻 搅拌2小时。由于二氯甲烷的蒸发，聚合物从溶液中沉淀以得到微球。3 小时之后(达到二氯甲烷几乎完全蒸发所必需的时间)通过离心收集所形 成的微球，将微球用100ml至200ml的0.05重量％吐温20的超纯水溶 液洗涤三次。最后，将微球冻干。

对于IVR测试，将2ml的100mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.02 重量％的NaN₃)(在30LP10L20-LL40微球的情况下)和25mM的NaPi 缓冲液(pH7.2，105mM的NaCI，0.01重量％的吐温80，0.02重量％ 的NaN₃)(在50CP10C20-LL40微球的情况下)添加到20mg微球中。 在37℃孵育样品并且在每个取样点取出1.8ml的样品并用释放缓冲液补 充。在30LP10L20-LL40微球的情况下，BSA含量采用BCA蛋白质测定 进行测量，在50CP10C20-LL40微球的情况下，BSA含量采用UPLC(洗 脱液A：1重量％的TFA在UP水中，洗脱液B：0.085重量％的TFA在 乙腈中，在25分钟内从95／5v／v的A／B至5／95的A／B)进行测量。

通过Coulter计数器来测量微球的颗粒大小分布。将约1mg微球通 过轻轻搅拌分散在50ml至100ml的Isotron II溶液中，并且用装备有100 μm测量单元(measurement cell)的Coulter计数器测量颗粒大小。

通过将5mg至10mg微球(精确称量)溶解于5.0ml乙腈中来确定 微球的BSA含量。离心之后，移去4ml的上清液并添加5ml PBS。使用 UPLC(洗脱液A：0.1重量％的TFA在UP水中，洗脱液B：0.1重量％ 的TFA在乙腈中，在4分钟内从90／10v／v的A／B至10／90v／v的A／B)来 测量BSA含量。

表4列出了所制备的加载有BSA的微球的颗粒大小、包封率(EE)。 图6示出了BSA从具有5重量％BSA目标加载的30LP10L20-LL40微球 和具有10重量％BSA目标加载的50CP10C20-LL40微球的体外释放。 BSA从30LP10L20-LL40微球中以线性方式释放几乎3个月无明显破裂。 50CP10C20-LL40微球以线性方式释放BSA几乎～3个月无明显破裂，其 后接着再减慢释放另外～1.5个月。

表4：加载有BSA的50CP10C20一LL40和30LP10L20-LL40

微球的平均粒径、BSA含量和包封率。

实施例18

在该实施例中，使用如上实施例中所描述制备的多种亲水性相分离的 多嵌段共聚物来制备加载有胰岛素样生长因子I(Insulin-like Growth  Factor I，IGF-1)的膜和微球制剂。

通过以下来制备加载有IGF-1的膜：将0.18g的聚合物溶解至1.46g 二氯甲烷中，接着通过Ultra turraxing用溶解在超纯水中的IGF-1以18 000rpm保持30s或通过使用100W的超声保持5s进行乳化。将乳液倾 注到Teflon^TM模具中。将二氯甲烷放置蒸发过夜并且通过真空干燥过夜来 除去残留的二氯甲烷。切割20mg的膜并且用1ml的磷酸盐缓冲生理盐 水(PBS，25M pH7.2，105mM NaCI，0.01重量％的吐温80和0.02重 量％的NaN₃)于37℃放置释放。在预定时间点，取出样品并且取出量由 新鲜缓冲液补充。

通过基于溶剂萃取／蒸发的W／O／W乳化方法来制备加载有IGF-1的 微球。将2.78mg的IGF-1和51.8mg的BSA在微量离心杯中溶解于143 μl的UP水中并且使用Ultra turrax(20000rpm，60s)在0.47g的 50CP10C20-LL40(IV1.05dl／g)在2.62g二氯甲烷中的溶液中进行乳化。 如此获得的初级乳液接着使用Ultra turrax(14000rpm保持60s)在81 ml含有4.0重量％PVA的UP水中乳化并在室温下以600rpm搅拌2小 时。在5μm的膜滤器上收集所得到的微球并且用1L含有0.05重量％吐 温80的UP-水洗涤。最后，将微球冻干。

通过轻轻搅拌将约1mg的微球分散在50ml至100ml的Isotron II 溶液中并且使用装配有100μm测量单元的Coulter计数器来测量颗粒大 小。

通过将5mg的微球(精确称量)溶解在0.3ml乙腈中来确定IGF-1 含量和BSA含量。然后，添加1.2ml的PBS并且轻轻摇动。离心之后， 通过UPLC确定上清液中的IGF-1和BSA含量。将该过程进行3次。

使用市售的sandwich ELISA(R&D System)，测量样品中的人胰岛 素样生长因子I(IGF-1)的浓度以确定微包封的和释放的IGF-1在释放 之后仍能够与捕获和检测抗体结合并且因此在该水平下未发生蛋白质降 解。试剂盒的捕获和检测抗体对天然IGF-1和重组IGF-1具有特异性并 且作为标准的重组IGF-1。

为了研究释放的IGF-1的结构完整性，将从释放样品收集的100ng 至300ng的IGF-1用Laemli／β-巯基乙醇缓冲液变性并且加载到“任何 KD TGX”预制小凝胶上并在100V至200V变性条件下使用1×Tris／甘氨 酸／SDS作为分离缓冲液进行分离，而在胶体CBB染色剂中染色过夜。使 用Dual Xtra蛋白质标记(Bio-Rad)来确定所分离的蛋白质的蛋白质大 小。

图7示出了IGF-1从加载有0.6重量％的IGF-1的50CP30C40-LL40 和30CP30C40-LL40聚合物膜的体外释放，由UPLC和ELISA测量。 IGF-1从50CP30C40-LL40膜在约7天内释放，而IGF-1从 30CP30C40-LL40聚合物膜中在28天后以约40％的累积释放缓慢释放。 因为由UPLC测量的IGF-1累积释放与由ELISA测量的IGF-1累积释放 几乎相同，可以得出结论，所释放的IGF-1是结构完整的并且具有生物活 性。

具有0.5重量％的IGF-1目标加载的微球是由具有IV1.05dl/g和0.68 dl/g的50CP10C20-LL40通过双乳化方法来制备的。微球具有光滑的表面 (图8)并且包封率为40％至60％不等。用装备有100μm测量单元的 Coulter计数器测量的体积平均颗粒大小(d₅₀)为54.4μm，具有61％的 CV(变异系数)。图9示IGF在体外从这些微球中释放。对于由IV0.68dl／g 的50CP10C20-LL40构成的微球，获得了2天内IGF-1的完全释放。IGF-1 从由IV1.05dl/g的50CP10C20-LL40构成的微球中释放是比较慢的，在 约6天之后达到完全释放。如从SDS-PAGE结果中可得出结论，所释放 的IGF-1是结构完整的(图10)，其未示出该蛋白质的任何降解或聚集。

实施例19

在该实施例中，使用如上实施例中所描述制备的多种亲水性相分离的 多嵌段共聚物(20LP10L20-LL40(IV0.58dl／g)、30LP6L20-LL40(IV0.60 dl／g)和30CP10C20-LL40(IV0.71dl／g))来制备加载有分子量为15kDa 的高水溶性生物活性多肽(蛋白质A)的膜制剂。此外，使用具有多种iV (0.81，0.71和0.65dl/g)的30CP10C20-LL40多嵌段共聚物来将蛋白质 A配制成微球制剂。

通过溶剂浇铸方法制备加载有蛋白质A的膜。将10mg的蛋白质A 溶解在123mg的UP水中并使用Ultra turrax(18000rpm，60s)在0.18 g聚合物在1.46g二氯甲烷中的溶液中进行乳化。然后将如此获得的初级 乳液倾注到Teflon^TM模具中并将二氯甲烷蒸发过夜。通过真空干燥除去残 留的二氯甲烷。

通过基于溶剂萃取／蒸发的W／O／W乳化方法来制备加载有蛋白质A 的微球。将21mg的蛋白质A(5重量％的目标加载)在微量离心杯中溶 解在156μl的任选地含有菊粉的UP水中并使用Ultra turrax(20 000 rpm，60s)在0.4g聚合物在2.1g二氯甲烷中的溶液中进行乳化。如此 获得的初级乳液接着使用Ultraturrax(14000rpm保持60s)在70ml 含有4.0重量％PVA的UP水中进行乳化并在室温下以600rpm搅拌2小 时。在5μm的膜滤器上收集所得到的微球并用100ml含有0.05重量％ 吐温80的UP-水洗涤。最后，将微球冻干。

通过轻轻搅拌将约10mg的微球分散在50ml至100ml的Isotron II 溶液中并使用装配有100μm测量单元的Coulter计数器来测量颗粒大小。

通过溶解5mg的微球(精确称量)到0.3ml乙腈中来确定蛋白质A 含量。离心之后，将上清液除去并蒸发残留的ACN。添加1.95ml的PBS。 用UPLC测量蛋白质A含量(洗脱液A：0.1重量％TFA在UP水中，洗 脱液B：0.1重量％TFA在乙腈中，3分钟内从80／20v／v的A／B到10／90 的A／B)。

对于SEM成像，将少量微球粘附于碳导带并且用金涂覆3分钟。采 用10kV的电子束对样品进行成像。

在100mM pH7.4的磷酸盐缓冲液中(20mg的膜在2ml中)测量加 载有蛋白质A的膜和微球的体外释放动力学。在37℃孵育样品。在每个 取样点，取出1.8ml的样品并用1.8ml的磷酸盐缓冲液补充。用UPLC (洗脱液A：0.1重量％TFA在UP水中，洗脱液B：0.1重量％TFA在乙 腈中，3分钟内从80／20v／v的A／B到10／90的A／B)来测量蛋白质A含量。

在还原模式下用4％至20％的Tris-HCl凝胶进行SDS-PAGE。对于 样品和蛋白质标准品，每个槽(per slot)中施加20μl的蛋白质溶液。对 于标记，施加2μl到槽中。每个槽中添加蛋白质的量为75ng或150ng。 通过用12mM pH7.4的PBS或UP水稀释至蛋白质A的浓度为150ng／20 μl或300ng／20μl来制备样品。然后，以1∶1v／v的比率添加Laemmli工 作溶液(含有1％巯基乙醇的Laemmli缓冲液)。将样品加热至～90℃保持 5分钟并且施加于凝胶。将凝胶夹在电泳槽中并且添加电泳缓冲液(pH8.3 的Tris／甘氨酸／SDS)。将样品和标准品施加于凝胶，并且凝胶在100kV 运行15分钟。随后将电压设置为200kV并且运行凝胶直到获得分子量标 准品的良好分离。用UP-水洗涤凝胶并且用银试剂染色。

图11示出了蛋白质A从20LP10L20-LL40(10重量％的PEG MW 1000)、30LP6L20-LL40(9重量％的PEG MW600)和30CP10C20-LL40 (15重量％的PEG MW1000)的体外释放。基于30CP10C20-LL40的膜 释放蛋白质A比较快，3个月后蛋白质A的累积释放为100％。通过用 PEG600代替PEG1000，其导致溶胀度的降低，蛋白质A的释放会变慢 并且获得接近一级扩散受控释放动力学导致4个月后的累积释放为 ～75％。蛋白质A释放速度的降低还可通过降低聚合物中亲水性LP10L201 嵌段的质量分数来实现。通过使用20LP10L20-LL40(10重量％ PEG1000)，释放可进一步变慢，在低于15％的初始小破裂之后，获得了 蛋白质A的良好受控释放动力学，在6个月内累积释放为约65％。该数 据清楚地示出蛋白质A释放动力学可通过聚合物的选择来控制。

加载有蛋白质A的微球由加载有3重量％至4重量％的蛋白质A的 30CP10C20-LL40来制备。任选地，共包封2重量％或5重量％的菊粉以 提高蛋白质A的释放速度。通过研究蛋白质A从由具有不同特性粘度的 30CP10C20-LL40聚合物构成的微球的释放动力学来研究聚合物分子量 对蛋白质释放动力学的影响。对于所有加载有蛋白质A的微球，获得了 球形微球。对于共包封菊粉的微球，表面孔隙率随菊粉含量的增加而增加， 如在图12中的SEM照片所示。表5列出了蛋白质A微球的颗粒大小和 包封率(EE)。图13示出在小的初始破裂之后，蛋白质A以恒定速度释 放。据观察，随着菊粉含量的降低，破裂降低并且线性提高。在不存在菊 粉的条件下，3个月释放了约70％，而当共包封2重量％或5％重量％的 菊粉时，释放90％至100％。蛋白质A从含有2重量％或5重量％的共 包封菊粉的30CP10C20-LL40膜的释放是相似的。示出了多至～4个月的 释放数据。蛋白质A从30CP10C20-LL40微球的期望释放持续时间为约 6个月。

图14示出了蛋白质A从具有不同特性粘度(IV)聚合物的 30CP10C20-LL40膜的释放动力学。蛋白质A的释放速度随着聚合物IV 的增加而增加。对于具有0.71dl/g或0.81dl／g IV的30CP10C20-LL40聚 合物，获得了蛋白质A的持续释放，2个月之后的累积释放为60％至70％。 蛋白质A从由具有0.58dl/gIV的30CP10C20-LL40构成的微球的释放动 力学是显著不同的。达到一个月的初始释放速度显著降低，但在1个月与 3个月之间蛋白质A释放加速，其后，再次变慢，得到约5个月的总释放 持续时间。该数据清楚地示出蛋白质A可以线性方式从微球释放至少4 个月并且可通过共包封的糖(例如菊粉)以及通过特性粘度的聚合物来控 制释放动力学。

通过SDS-PAGE研究了从微球释放的蛋白质A的结构完整性。 SDS-PAGE确认，蛋白质A释放至少持续21天，主要由天然蛋白质组成 (图15)。这些结果示出，30CP10C20-LL40微球为结构完整性蛋白质A 的长期释放提供了合适的基质。

表5：具有3重量％至4重量％蛋白质A目标加载的加载有蛋白质A的

微球特性的概述。

实施例20

在该实施例中，使用如上实施例中所描述制备的亲水性相分离的多嵌 段共聚物20LP10L20-LL40(IV0.73dl／g)来制备加载有分子量为2.5kDa 的生物活性多肽(肽A)的膜和微球制剂。

通过溶液浇铸方法来制备加载有肽A的膜。将10mg(用于5重量％ 加载)或20mg(用于10重量％加载)的肽A溶解在123mg的UP水中 并且使用Ultra turrax(18000rpm，30s)在0.18g的20LP10L20-LL40(IV 0.76dl／g)在1.46g二氯甲烷中的溶液中进行乳化。将如此获得的初级乳液 倾注到Teflon模具中并且将二氯甲烷蒸发过夜。通过真空干燥除去残留 的二氯甲烷。

通过基于溶剂蒸发的双乳化方法来制备加载有肽A的微球。将50mg 的肽A溶解在PBS中并使用Ultra turrax(24000rpm，60s)在0.5g 的20LP10L20-LL40(IV0.73dl／g)在2g二氯甲烷中的溶液中进行乳化。 如此获得的初级乳液接着使用Ultraturrax(14000rpm保持30s)在200 ml含有4.0重量％聚乙烯醇的UP水中进行乳化，并且在室温下以600rpm 搅拌3h。将所得微球离心，移去上清液并且用200ml含有0.05重量％吐 温20的UP-水洗涤微球3次。最后，将微球冻干。用Coulter计数器来 测量颗粒大小分布。通过轻轻搅拌将约10mg的微球分散在50ml至100 ml的Isotron II溶液中并且用100μm测量单元来测量颗粒大小。

通过溶解5mg至10mg的微球(精确称量)到5.0ml乙腈中来确定 微球的肽A含量。离心之后，移去4ml上清液并添加5ml的PBS。用 HPLC(洗脱液A：1重量％TFA在UP水中，洗脱液B：0.085重量％TFA 在乙腈中，25分钟内从95／5v／v的A／B到5／95的A／B)测量肽A含量。

肽A从膜和微球的体外释放动力学是在37℃于PBS pH中测量。将 含有肽A的膜或微球(5mg至20mg)称入小瓶中并添加2ml的PBS。 在37℃孵育小瓶并在预定时间点取样。在每个取样点，收集75％至90％ 的释放介质并且用新鲜的PBS替换。用HPLC(洗脱液A：1重量％TFA 在UP水中，洗脱液B：0.085重量％TFA在乙腈中，25分钟内从95／5v／v 的A／B到5／95的A／B)确定释放样品的肽A含量。

图16示出肽A从20LP10L20-LL40膜的体外释放。肽A以线性方式 从加载有5重量％的20LP10L20-LL40膜中释放至少5个月，没有明显的 破裂。对于具有较高肽A加载(10重量％)的20LP10L20-LL40膜，破 裂释放增加至15％。约2个月后，释放类似于加载有5重量％的膜。

加载有肽A的20LP10L20-LL40微球的平均颗粒大小为30μm并且 肽A含量为10.3重量％，表示包封率为100％。图17示出了肽A MSP 表现出约10重量％的低破裂释放，随后经过零级释放动力学至少40天。

实施例21

在该实施例中，使用亲水性相分离的多嵌段共聚物20LP10L20-LL40 (实施例8)和10LP10L20-LL40来制备加载有雷帕霉素(MW914Da) 的微球。聚合物的聚乙二醇组分的分子量为1000g／mol。

通过使用单一水包油(O／W)乳化路线的溶剂蒸发方法来制备具有 20重量％雷帕霉素的目标加载的加载有雷帕霉素的微球。将聚合物以多 种混合比率溶解到二氯甲烷中至浓度为约20重量％，并且添加所需量的 雷帕霉素。聚合物／雷帕霉素溶液接着使用Ultra turrax(14000rpm，30 s)在200ml含有4.0重量％聚乙烯醇(PVA)的UP水中进行乳化，然 后在室温下以300rpm用磁力搅拌器搅拌3小时。将微球分散体通过离心 浓缩并且用50ml的0.05重量％吐温20水溶液洗涤3次。最后，将微球 冻干。

用Coulter计数器测量颗粒大小分布。通过轻轻搅拌将约10mg的微 球分散在50ml至100ml的Isotron II溶液中并用100μm测量单元测量 颗粒大小。

通过溶解5mg至10mg微球(精确称量)到5.0ml乙腈中来确定微 球的雷帕霉素含量。离心之后，移去4ml的上清液并添加5ml的PBS。 用HPLC测量雷帕霉素含量(洗脱液：乙腈／水70／30v／v；278nm)。

在37℃于含有0.5重量％SDS的10mM pH7.4的PBS中测量雷帕霉 素从微球的体外释放动力学。将含有雷帕霉素的微球(5mg至20mg) 称入小瓶中，并添加2ml的释放介质。在37℃孵育小瓶并在预定的时间 点取样。在每个取样点，收集75％至90％的释放介质并且用新鲜的PBS 替换。用HPLC确定释放样品的雷帕霉素含量。

如此制备的雷帕霉素微球的平均大小为35μm并且雷帕霉素含量为 17重量％至20重量％不等，表示包封率为89％至100％。图18示出雷 帕霉素从由20LP10L20-LL40和10LP10L20-LL40的多种共混物构成的 微球的释放。雷帕霉素从基于20LP10L20-LL40的微球的释放是相对快 的，而雷帕霉素从基于10LP10L20-LL40的微球的释放是非常慢的。通过 共混两种聚合物获得了具有中间释放特征的微球。

实施例22

在该实施例中，通过油包油包水方法由亲水性相分离的多嵌段共聚物 20LP10L20-LL40制备加载有戈舍瑞林乙酸酯的微球。将62.6mg戈舍瑞 林乙酸酯溶解于150μl的UP-水(29.4重量％)中并用0.5g的 20LP10-LLA40聚合物在7.4g二氯甲烷中的溶液在闪烁管(scintillation  vial)中(Ultra turrax，20000rpm，60s)进行乳化。在恒定搅拌(12000 rpm)下接着慢慢添加(2分钟至5分钟)13.5g的聚合物沉淀剂(硅油， 350cSt)以形成初期微粒。将所述初期微粒接着在室温下倾入550ml庚 烷中(二氯甲烷与庚烷溶剂的比率为13.5∶1)。将萃取器关闭以防止萃取 介质的过量蒸发。在萃取约3小时之后，通过真空过滤收集微粒，用另外 的庚烷冲洗并真空下干燥。微球的平均大小为67μm并且戈舍瑞林含量 为8.3％，表示包封率为88％。

用Coulter计数器来测量颗粒大小分布。通过轻轻搅拌将约10mg的 微球分散在50ml至100ml的Isotron II溶液中并且用100μm测量单元 测量颗粒大小。

通过溶解5mg至10mg的微球(精确称量)到5.0ml乙腈中来确定 微球的戈舍瑞林含量。在离心之后，移去4ml的上清液并添加5ml的 PBS。用HPLC测量戈舍瑞林含量(洗脱液∶水／乙腈／三氟乙酸72／28／0.1， 220nm)。

戈舍瑞林从微球的体外释放动力学是于37℃在PBS(192mM pH7.4 含有0.01％吐温80和0.02％叠氮化钠)中测量。将含有戈舍瑞林的微球 (5mg至20mg)称入小瓶中并添加2ml的释放介质。在37℃孵育小瓶 并且在预定时间点取样。在每个取样点，收集75％至90％的释放介质并 且用新鲜的PBS替换。用HPLC确定释放样品的戈舍瑞林含量。

如此制备的加载有戈舍瑞林的20LP10-LLa40微球具有球形的光滑 外观(图19)，平均大小为71μm(CV47％)并且戈舍瑞林含量为8.3％， 表示包封率为88％。图20示出了戈舍瑞林从微球的释放。

实施例23

在该实施例中，通过油包油包固体方法(S／O／O)由亲水性相分离的 多嵌段共聚物30CP10L20-LL40来制备加载有溶菌酶的微球。在闪烁管 中，将0.43g30CP10L20-LL40溶解于7.4g二氯甲烷(5.4重量％)中， 并将0.074g颗粒大小为1μm至2μm的喷雾干燥的菊粉稳定的溶菌酶微 粒(溶菌酶／菊粉比率：1∶2w／w)添加到聚合物溶液中，并且通过Ultra  turrax(20 000rpm，60s)均质化分散体。在恒定搅拌下(12 000rpm) 接着慢慢添加(2分钟至5分钟)11.46g聚合物沉淀剂(硅油，350cSt) 以形成初期微粒。将所述初期微粒接着在室温下倾入550ml庚烷中(二 氯甲烷与庚烷溶剂的比率为13.5∶1)。将萃取器关闭以防止萃取介质的过 量蒸发。在萃取约3小时之后，通过真空过滤收集微粒，用另外的庚烷冲 洗并通过真空过滤干燥。微球的平均大小为59μm并且溶菌酶含量为 4.1％至5.6％，表示包封率为80％至100％。